陳志迪，張思寧，夏 凡，鐘連全，易欣欣，高秀芝*

(1.北京農學院食品科學與工程學院/食品質量與安全北京實驗室/農產品有害微生物及農殘安全檢測與控制北京市重點實驗室，北京 102206；2.北京市昌平區(qū)種子管理站，北京 102200)

植物多酚是一種小分子天然有機化合物，由植物生長發(fā)育代謝活動而產生，廣泛存在于植物的表皮、根系、葉和果實中[1]。植物多酚屬于芳香族羥基化合物，根據(jù)結構不同分為兩大類：一類是類黃酮，包括黃酮類、黃酮醇類、異黃酮類、查爾酮類等；另一類是非類黃酮，包括芪類、單寧、酚酸類等[2]。多酚具有抑菌[3]、預防糖尿病和心血管疾病[4-5]、促進抗癌細胞增殖[6]等生物活性。以植物多酚為原料的天然防腐劑因其性能高效、安全性好，且具有一定營養(yǎng)價值，廣泛用于食品工業(yè)領域[7]。

生菜(LactucasativaL.)又名葉用萵苣、鵝子菜、麥子菜、萵籽菜，為一年生或二年生草本植物[8]。食用方法多樣，因其口感清脆、營養(yǎng)物質含量豐富，作為生食蔬菜廣受大眾歡迎[9]。生菜起源于歐洲，從東南沿海地區(qū)引進至中國[10]。PEPE等[11]研究表明，萵苣中含有羥基肉桂酸、鄰氧萘酮、黃烷醇等16種多酚類化合物，具有良好的抗氧化和抗炎活性。MARTíNEZ-SáNCHEZ等[12]研究發(fā)現(xiàn)綠葉萵苣主要含酚酸類物質，紫葉萵苣中含豐富的黃酮醇。

多酚的提取方法主要有溶劑浸提法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、超臨界流體萃取法等[13]。超聲輔助提取法操作過程簡單，成本低廉，是目前應用最為廣泛的一種多酚提取方法。王佰靈等[14]利用Box-Behnken響應面法對景天三七總多酚的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，優(yōu)化因素包括液料比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間、超聲溫度。

該試驗擬采用超聲輔助提取法，利用單因素結合正交試驗的方法研究乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間、超聲溫度4個因素對散葉生菜中的多酚提取量的影響，優(yōu)化散葉生菜多酚的提取工藝，確定散葉生菜多酚提取的最佳工藝條件，比較5種散葉生菜多酚的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

原料散葉生菜，其中提取條件優(yōu)化所用散葉生菜購自北京農學院超市；北散生1號、北散生2號、北紫生1號、北紫生2號、北紫生3號來自昌平農作物試驗展示基地；沒食子酸標準品(純度≥98%)：北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇，分析純：北京東方博遠科技發(fā)展有限公司。

真空冷凍干燥機(CHRIST凍干機有限公司)，旋轉蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)，T6新世紀紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司)。

1.2 方 法

1.2.1 提取工藝 新鮮散葉生菜葉片30 g，真空冷凍干燥24 h，粉碎后過250 μm篩，超聲輔助乙醇浸提，8 000 r/min離心15 min，得到多酚粗提液。

1.2.2 多酚含量的測定 散葉生菜中多酚含量的測定采用福林酚法[15]，按公式1計算多酚含量mg/kg(以沒食子酸計)，X為散葉生菜中多酚含量，mg/kg；C為標準曲線多酚質量濃度，mg/mL；V1為稀釋體積，mL；V2為乙醇溶液體積，mL；V3為量取的多酚粗提液體積，mL；M為散葉生菜鮮重，g。

X=(C×V1×V2)/(M×V3)×1 000

(公式1)

1.2.3 標準曲線繪制 根據(jù)康超等[16]的研究方法略作修改，在OD765 nm下測量吸光度?？v坐標為吸光度，橫坐標為沒食子酸質量濃度，繪制標準曲線。

1.3 散葉生菜中多酚提取工藝

1.3.1 單因素試驗 在料液比1∶30，超聲溫度50 ℃，超聲時間60 min，乙醇體積分數(shù)分別為50%、60%、70%、75%和80%的條件下提取散葉生菜多酚，在OD765 nm下測定吸光度并計算多酚含量。

在乙醇體積分數(shù)70%，超聲溫度50 ℃，超聲時間60 min，料液比分別為1∶10、1∶15、1∶20、1∶25和1∶30，提取散葉生菜多酚，在OD765 nm下測定吸光度并計算多酚含量。

在乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶30，超聲溫度50 ℃，超聲時間分別為30、45、60、90和120 min的條件下提取散葉生菜多酚，在OD765 nm下測定吸光度并計算多酚含量。

在乙醇體積分數(shù)70%，料液比1∶30，超聲時間60 min，超聲溫度分別為30、40、45、50和60 ℃的條件下提取散葉生菜多酚，在OD765 nm下測定吸光度并計算多酚含量。

1.3.2 正交試驗設計 選擇乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間和超聲溫度作為4個因素，每個因素分別選取3個水平，進行L9(34)四因素三水平正交試驗，以確定散葉生菜中多酚的最優(yōu)提取條件。以正交表中最佳組合為優(yōu)化組、正交試驗各因素最佳水平組為對照組，對最優(yōu)條件組合進行驗證。

表1 試驗因素水平表Tab.1 Level of experimental factors

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

每個試驗都有3組平行，并將得到的數(shù)據(jù)取平均值。使用Excel軟件進行單因素試驗和正交試驗的數(shù)據(jù)分析并繪圖，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析選用Excel-2016和SPSS19.0，差異顯著性為P<0.05。

2 結果與分析

2.1 沒食子酸標準曲線

根據(jù)沒食子酸的質量濃度與吸光度，得到標準曲線如圖1。標準曲線的回歸方程Y= 25.831X-0.0005，其中Y為吸光度，X為沒食子酸質量濃度(mg/mL)，線性回歸系數(shù)R2= 0.9992。

圖1 沒食子酸標準曲線Fig.1 Gallic acid standard curve

2.2 單因素試驗

2.2.1 乙醇體積分數(shù)對散葉生菜多酚提取量的影響 當乙醇體積分數(shù)70%時散葉生菜多酚的提取量達到最大值，為522.16 mg/kg(圖2)。出現(xiàn)這種情況可能由于多酚的結構中帶有羥基具有一定極性，乙醇與多酚的極性越接近，各物質之間的化學鍵越容易被破壞，則多酚提取量越高[17]。乙醇體積分數(shù)選取60%～75%這個區(qū)間繼續(xù)后續(xù)正交試驗。

圖2 乙醇體積分數(shù)對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.2 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

2.2.2 料液比對散葉生菜多酚提取量的影響 料液比對散葉生菜多酚提取量的影響如圖3所示。在料液比1∶15時散葉生菜中多酚提取量達到最大值，之后隨料液比的增大，散葉生菜多酚提取量下降?？赡苁怯捎谠?∶15時多酚的溶解達到飽和，繼續(xù)增大料液比增大其他雜質的溶出率，從而導致多酚提取量降低[18]。選取1∶10～1∶20這個區(qū)間的料液比進行后續(xù)正交試驗。

圖3 料液比對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.3 Effect of material-to-liquid ratio on the extraction amount of polyphenols from leaf lettuce

2.2.3 超聲時間對散葉生菜多酚提取量的影響 當超聲時間60 min時，散葉生菜中的多酚提取量達到最大值。隨著超聲時間的增大散葉生菜多酚提取量反而減少(圖4)。如果超聲時間太短，則多酚將無法充分溶解，提取率會偏低，如果超聲時間太長，會使提取溫度升高導致多酚受熱氧化分解，而且隨著提取溫度升高，細胞通透性增大，其他物質的溶出也會影響提取率[19]。超聲時間選取45～90 min這個區(qū)間進行正交試驗。

圖4 超聲時間對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.4 Effect of ultrasonic time on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

2.2.4 超聲溫度對散葉生菜多酚提取量的影響 隨著超聲溫度的增加，散葉生菜多酚提取量先略有下降后上升至頂峰最后又下降(圖5)。在50 ℃時多酚提取量最高。超聲溫度的升高促進多酚的溶解，但如果超聲溫度過高，則散葉生菜的多酚會熱分解，破壞已提取出多酚的結構，使多酚得率降低[20]。后續(xù)正交試驗選擇45～60 ℃這個范圍內的超聲溫度。

圖5 超聲溫度對散葉生菜多酚提取量的影響Fig.5 Effect of ultrasonic temperature on the extraction of polyphenols from leaf lettuce

2.3 正交試驗

表2為正交試驗結果。根據(jù)R值大小可以看出各因素對散葉生菜多酚提取量的影響大小順序為：乙醇體積分數(shù)>超聲溫度>超聲時間>料液比；正交試驗得出最優(yōu)工藝組合為乙醇體積分數(shù)75%、料液比1∶20、超聲時間60 min、超聲溫度60 ℃。

方差分析見表3。乙醇體積分數(shù)F值6.461，料液比F值0.194，超聲時間F值1.519，超聲溫度F值3.940。從而可知，乙醇體積分數(shù)對散葉生菜多酚提取效果具有極顯著性影響(P<0.01)，超聲溫度對散葉生菜多酚提取效果具有顯著影響(P<0.05)，而料液比和超聲時間對散葉生菜多酚提取效果的影響不顯著(P>0.05)。

表2 散葉生菜多酚提取正交試驗結果表(L934)Tab.2 Orthogonal test results (L934) of leaf lettuce polyphenols

乙醇體積分數(shù)對散葉生菜多酚提取效果具有極顯著性影響(P<0.01)，可選擇75%；超聲溫度對散葉生菜多酚提取效果具有顯著影響(P<0.05)，可選擇60 ℃；而料液比和超聲時間均對散葉生菜多酚提取效果的影響不顯著(P>0.05)，且根據(jù)k值的大小發(fā)現(xiàn)料液比1∶10與1∶20的均值相差不大，故從成本方面考慮，可選最佳料液比為1∶10，而超聲時間60 min值最大，故超聲時間60 min為最佳可取值。

超聲提取工藝的最優(yōu)條件為乙醇體積分數(shù)75%、料液比1∶10、超聲時間60 min、超聲溫度60 ℃，這是理論上超聲提取散葉生菜多酚的最佳工藝條件。

表3 正交試驗結果方差分析表Tab.3 Orthogonal experiment results analysis of variance table

2.4 驗證試驗

驗證試驗結果見表4。多酚提取量分別為(1 233.5±49.7)mg/kg、(1 152.6±25.5)mg/kg和(1 128±12.53)mg/kg，超聲提取散葉生菜多酚的最佳工藝條件為乙醇體積分數(shù)75%、料液比1∶10、超聲時間60 min、超聲溫度60 ℃。

表4 散葉生菜多酚提取工藝驗證試驗結果表Tab.4 Validation test result table of polyphenol extraction technology from leaf lettuce

2.5 不同品種散葉生菜多酚含量

選用最佳提取工藝對5種散葉生菜的多酚進行提取，測定含量見圖6。不同品種散葉生菜之間多酚含量存在差異，其中北紫生1號多酚含量顯著高于其他品種(P<0.05)，含量為(1 176±48.5) mg/kg；北散生2號的含量最低為(622.3±65.2) mg/kg。

注：ab表示差異顯著(P<0.05)。Note:ab means significant difference (P<0.05).圖6 不同品種散葉生菜多酚含量Fig.6 Contents of polyphenols in different varieties of leaf lettuce

3 討 論

該試驗通過單因素結合正交試驗的方法優(yōu)化散葉生菜多酚超聲輔助提取的最佳工藝，多酚可以溶于水和醇類、醚類、酮類等有機溶劑[21]，常用的有機溶劑包括乙醇、甲醇、丙酮等，乙醇毒性小、回收率高，所以該試驗選用乙醇作為提取溶劑。楊文娟等[22]對花生多酚的超聲輔助提取工藝進行優(yōu)化，各因素對提取量的影響大小順序為乙醇體積分數(shù)、超聲溫度、料液比、超聲時間。在該試驗中，4種因素對散葉生菜多酚提取量的影響程度與楊文娟等[22]研究結果大致相同，乙醇體積分數(shù)影響是最大的，其次是超聲溫度，雖然超聲時間和料液比的結果不一致，但是這兩種因素影響較小。用最優(yōu)提取工藝提取5種不同的散葉生菜多酚，不同品種散葉生菜多酚含量存在差異，楊曉等[23]在研究中發(fā)現(xiàn)不同品種生菜酚類物質含量存在差異，即使相同品種，由于光照和采收時間不同，總酚含量也有差異。

該試驗通過單因素和正交試驗探究乙醇體積分數(shù)、料液比、超聲時間、超聲溫度對散葉生菜中多酚提取量的影響，各因素的影響順序為乙醇體積分數(shù)>超聲溫度>超聲時間>料液比；最佳提取工藝為乙醇體積分數(shù)75%、料液比1∶10、超聲時間60 min、超聲溫度60 ℃；北紫生1號的多酚含量顯著高于其他品種，為(1 176±48.5)mg/kg。