袁 琦，王家勝，毛 豪，蔡開(kāi)云，陳 萍，馮向東，方尚玲，3，陳茂彬，3*

（1.湖北工業(yè)大學(xué) 生物工程與食品學(xué)院，湖北 武漢 430070；2.湖北稻花香酒業(yè)股份有限公司，湖北 宜昌 443100；3.湖北省釀造工藝與裝備工程技術(shù)中心，湖北 武漢 430070）

中國(guó)傳統(tǒng)白酒產(chǎn)生于西漢甚至漢代以前[1]，距今已有2 000多年的歷史，與世界其他5種蒸餾酒相比，其所含風(fēng)味化合物種類最為豐富[2]，目前已經(jīng)檢測(cè)出約1 874種風(fēng)味化合物[3]，這得益于中國(guó)傳統(tǒng)白酒獨(dú)特的釀造原輔料、生產(chǎn)工藝及地理環(huán)境等因素。四大基本香型白酒在釀造原輔料上存在巨大差異，濃香型和清香型以高粱為主要釀造原糧[4-5]，醬香型則以50%的高粱和50%的高溫大曲為主要釀造原料[6]，而米香型是以大米為主要釀造原料[7]。

對(duì)競(jìng)爭(zhēng)日益激烈的白酒市場(chǎng)和人們不斷提高的消費(fèi)水平而言，開(kāi)發(fā)新型白酒有利于豐富中國(guó)白酒的種類和滿足人們對(duì)新口感的需求。為此，稻花香集團(tuán)開(kāi)發(fā)了一種馫香型白酒。它的釀造工藝分為小曲糖化、高溫堆積、泥窖發(fā)酵、量質(zhì)摘酒、洞藏貯存5個(gè)階段，在傳統(tǒng)白酒釀造工藝上進(jìn)行創(chuàng)新，使酒體兼具清香、醬香、濃香三種香型特色風(fēng)格。清香源自于小曲糖化生香，加入根霉小曲糖化后的糟醅中微生物、香味物質(zhì)層次更豐富，賦予酒體更加清甜自然的風(fēng)味；醬香源于高溫堆積，這一過(guò)程不僅培育出產(chǎn)醬香風(fēng)味化合物的一類微生物，同時(shí)也生成了醬香風(fēng)味物質(zhì)和醬香風(fēng)味物質(zhì)的前體物。濃香源于泥窖發(fā)酵，經(jīng)過(guò)高溫堆積的堆積醅，加入一定配比的中高溫大曲，在泥窖中密封發(fā)酵。三香結(jié)合的工藝使得馫香型白酒色清透明，復(fù)合香氣幽雅，風(fēng)格獨(dú)特，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。本研究通過(guò)比較馫香型白酒與其他傳統(tǒng)香型白酒在風(fēng)味化合物種類和含量上的差異，揭示馫香型白酒的風(fēng)味特征，并結(jié)合工藝探索風(fēng)味形成的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

濃香型基酒（66.4%vol）、馫香型基酒（62.4%vol）：稻花香集團(tuán)；清香型基酒（56.4%vol）：石花釀酒股份有限公司；醬香型基酒（53%vol）：郎酒股份有限公司；兼香型基酒（53%vol）：白云邊股份有限公司；馥郁香型基酒（52%vol）：酒鬼酒股份有限公司；小曲清香型基酒（62.8%vol）：勁牌有限公司。

二氯甲烷、氯化鈉、無(wú)水硫酸鈉（均為分析純）：中國(guó)醫(yī)藥（集團(tuán)）上?；瘜W(xué)試劑公司；乙醇、乙酸正戊酯、叔戊醇、乙醛、正丙醛、異丁醛、乙酸乙酯、2-戊酮、丁酸乙酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、仲戊醇、正丁醇、異戊醇、己酸乙酯、正戊醇、乙偶姻、庚酸乙酯、乳酸乙酯、正己醇、己酸丁酯、辛酸乙酯、己酸異戊酯、糠醛、壬酸乙酯、DL-白氨酸乙酯、己酸己酯、癸酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、β-苯乙醇、肉豆蔻酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、亞油酸乙酯（均為色譜純）：上海麥克林生化科技有限公司或阿拉丁試劑（上海）有限公司提供。

1.2 儀器與設(shè)備

7890B-5977B氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）儀、7820A氣相色譜儀：美國(guó)安捷倫科技有限公司；50/30 mm DVB/CAR/PDMS萃取纖維：上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；MS-H-ProA LCD數(shù)顯加熱型圓盤磁力攪拌器：大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司；30 mL頂空瓶：上海雷布斯網(wǎng)絡(luò)科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

內(nèi)標(biāo)溶液的配制：準(zhǔn)確吸取100 μL叔戊醇、乙酸正戊酯，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容至5 mL容量瓶。

標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制：吸取相應(yīng)體積的34種標(biāo)準(zhǔn)品化合物（純度均＞98%）至100 mL容量瓶，經(jīng)分析天平稱質(zhì)量后，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容至100 mL，此為母液。準(zhǔn)確吸取一定體積的母液，用體積分?jǐn)?shù)60%的乙醇溶液定容至5 mL容量瓶（定容過(guò)程中加入兩種內(nèi)標(biāo)溶液各200 μL），配制成不同濃度梯度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2 樣品處理方法

定性樣品：準(zhǔn)確移取稀釋至14%vol的酒樣6 mL于30 mL頂空瓶中，準(zhǔn)確稱取3 g NaCl，加入攪拌子，將頂空瓶密封好，放置于55 ℃的恒溫磁力攪拌器上平衡15 min，轉(zhuǎn)速為500 r/min；將裝有萃取纖維的進(jìn)樣手柄插入頂空瓶，推出萃取纖維（纖維與液面保持1 cm），在同樣溫度、轉(zhuǎn)速條件下吸附40 min。萃取完成后，取出萃取纖維插入進(jìn)樣口解吸5 min，進(jìn)樣口溫度為260 ℃，然后用GC-MS分析。

定量樣品：準(zhǔn)確吸取待測(cè)酒樣5 mL，加入100 μL內(nèi)標(biāo)溶液，吸取1 μL待處理的酒樣進(jìn)行GC分析。

1.3.3 儀器條件

（1）頂空固相微萃取GC-MS條件

氣相色譜條件：CP-WAX57CB色譜柱（50 m×0.25 mm×0.20 μm）；載氣為高純氦氣（He），恒定流速為0.7 mL/min，采用不分流模式；色譜柱初始溫度45 ℃保持1.5 min，以6 ℃/min升至85 ℃不保持，再以4 ℃/min升至225 ℃保持15 min。

質(zhì)譜條件：電子電離（electron ionization，EI）源，四極桿溫度為150 ℃，傳輸線溫度為250 ℃，離子源溫度為230 ℃。電子能量70 eV，全掃描模式，掃描質(zhì)量范圍30～550 aum。

（2）直接進(jìn)樣法GC條件

CP-WAX57CB色譜柱（50 m×0.25 mm×0.20 μm）；載氣為高純氮?dú)猓∟2），恒定流速為1 mL/min，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比為10∶1；進(jìn)樣口溫度240 ℃，檢測(cè)器溫度270 ℃；色譜柱初始溫度35℃保持6min，以6℃/min升溫至110℃恒溫3 min，再以6 ℃/min升溫至205 ℃保持13 min。

1.3.4 定性定量方法

定性方法：采用美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（national institute of standards and technology，NIST）17譜庫(kù)檢索進(jìn)行初步定性，再將各成分的保留指數(shù)（retention index，RI）與參考文獻(xiàn)RI值對(duì)比定性；定量方法：計(jì)算參考GB/T5009.48—2003《蒸餾酒與配制酒衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)的分析方法》。所得數(shù)據(jù)采用Origin 2021b軟件進(jìn)行繪圖和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 定性結(jié)果分析

7種不同白酒定性分析結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，7種不同白酒共檢測(cè)到141種風(fēng)味化合物，其中濃香型84種，清香型51種，醬香型76種，兼香型65種，馥郁香型70種，小曲清香型55種，馫香型78種。比較可知，馫香型在風(fēng)味化合物的豐富度上具有一定優(yōu)勢(shì)，這可能與多種因素有關(guān)，其中微生物的種類和數(shù)量是最主要的影響因素，近年來(lái)通對(duì)白酒發(fā)酵過(guò)程中微生物多樣性的研究總結(jié)發(fā)現(xiàn)，濃香型和醬香型酒醅中微生物明顯比清香型豐富[9]。

表1 7種原酒樣品風(fēng)味化合物定性結(jié)果比較Table 1 Comparison of qualitative results of flavor substances in seven kinds of Baijiu samples

續(xù)表

續(xù)表

續(xù)表

對(duì)7種白酒風(fēng)味化合物定性結(jié)果進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果見(jiàn)圖1。由圖1可知，馫香型白酒的風(fēng)味化合物與濃香型、兼香型、馥郁香型相關(guān)性較強(qiáng)，與清香型和小曲清香型相關(guān)性較弱，除此之外與醬香型也存在一定的相關(guān)性。

圖1 7種原酒樣品風(fēng)味化合物定性結(jié)果相關(guān)性分析Fig.1 Correlation analysis of qualitative results of flavor substances in seven kinds of Baijiu samples

為了進(jìn)一步研究馫香型與其他香型白酒之間的差異，采用主成分分析法（principal component analysis，PCA）對(duì)其進(jìn)行分析，結(jié)果如圖2。由圖2可知，雖然馫香型與濃香型、兼香型、馥郁香型白酒有較高的相關(guān)性，但是它們之間還是存在明顯差異。3種香型中，兼香型更接近醬香型，馥郁香型更接近濃香型，而馫香型是位于兼香型和馥郁香型之間，這是因?yàn)樗褂玫奶腔l(fā)酵劑和生產(chǎn)工藝的不同。馫香型和兼香型都采用高溫大曲與中溫大曲結(jié)合的工藝[10]，但是馫香型糖化時(shí)單獨(dú)使用小曲糖化；濃香型采用中高溫大曲邊糖化邊發(fā)酵的生產(chǎn)工藝[11]；馥郁香型生產(chǎn)過(guò)程中采用根霉麩曲糖化，大曲發(fā)酵的生產(chǎn)工藝[12]。兼香型主要融合了濃香型和醬香型的生產(chǎn)工藝，在風(fēng)味上形成了濃醬結(jié)合的特點(diǎn)[13]，而馫香型和馥郁香型是典型的三香混合，它們的生產(chǎn)工藝中都或多或少地借鑒了濃、清、醬三種香型的生產(chǎn)工藝。從PCA分析中可以明顯看出，兼香型和醬香型最接近，其次是馫香型，推測(cè)可能是由于在生產(chǎn)過(guò)程都存在高溫堆積這一關(guān)鍵性工藝[14]，高溫堆積是一次風(fēng)味物質(zhì)的富集過(guò)程，不僅為后續(xù)的入池發(fā)酵提供了大量的微生物和風(fēng)味前驅(qū)物，也為最終的醬香特征風(fēng)味奠定了重要基礎(chǔ)，目前在醬香型白酒高溫堆積醅中已經(jīng)檢測(cè)到約一百種揮發(fā)性風(fēng)味化合物[15]。馫香型和馥郁香型在生產(chǎn)工藝上與濃香型最大的差異體現(xiàn)在糖化過(guò)程，馥郁香型敞開(kāi)式糖化是微生物的富集過(guò)程，網(wǎng)羅的微生物參與了后續(xù)的發(fā)酵，這一過(guò)程由于采用堆積的方式也可能產(chǎn)生醬香風(fēng)味的特征前體物質(zhì)。但是與馫香型相比缺少高溫大曲的堆積過(guò)程，這是馥郁香型比馫香型更接近濃香型的原因。

圖2 7種原酒樣品定性結(jié)果PCA分析結(jié)果Fig.2 Principal component analysis results of qualitative results of seven kinds of Baijiu samples

根據(jù)風(fēng)味化合物的種類和相對(duì)含量對(duì)7種白酒進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果如圖3所示。由圖3可知，當(dāng)酒樣被歸為3類時(shí)，類1中包括馫香型、濃香型、兼香型和馥郁香型，類2中包括清香型和小曲清香型，醬香型被單獨(dú)歸為類3。除兼香型外，類1所包含的三種香型在生產(chǎn)工藝中發(fā)酵容器都是泥窖，這使得這一類白酒的香味化合物在種類和含量上明顯區(qū)別于其它香型，結(jié)合圖3中香味化合物的分類，可以看出這一類物質(zhì)包括異正己酸、己酸乙酯、己酸酐、己酸己酯、己酸異丁酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、己酸丁酯、戊酸乙酯、己酸戊酯和乙酸己酯等，其中己酸、己酸乙酯和己酸己酯是窖泥中含量較高的成分[16]，由此可見(jiàn)泥窖發(fā)酵工藝是這三種香型產(chǎn)生相關(guān)性的主要原因。

圖3 7種原酒樣品風(fēng)味化合物熱圖分析Fig.3 Heatmap analysis of flavor compounds of seven kinds of Baijiu samples

2.2 定量結(jié)果分析

7種白酒風(fēng)味化合物定量分析結(jié)果見(jiàn)表2，對(duì)定量結(jié)果進(jìn)行PCA分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。由表2可知，濃香型和醬香型所測(cè)骨架化合物的含量與其余5種差異較大，馫香型、兼香型和馥郁香型之間比較接近，且分布較圖2都更接近清香型，這可能是由于對(duì)骨干化合物進(jìn)行檢測(cè)時(shí)會(huì)導(dǎo)致醬香型和濃香型風(fēng)味化合物種類豐富的優(yōu)勢(shì)難以體現(xiàn)。清香型和小曲清香型相似程度較定性分析有所降低，這可能是由于兩種類型的白酒在風(fēng)味化合物的種類上相似程度高，而在骨干化合物含量上差異較大。由圖4可知，馫香型、馥郁香型基本位于濃、清、醬三種基本香型之間，證明了三香融合的工藝最終會(huì)使得酒體骨架化合物的種類和含量趨近于三種基本香型。仔細(xì)對(duì)馫香型和馥郁香型的位置，發(fā)現(xiàn)馫香型比馥郁香型更接近醬香型，結(jié)合兩種香型的工藝特點(diǎn)分析，兩者都存在堆積培菌這一工藝，但是馥郁香型是在糖化過(guò)程中加入根霉麩曲堆積，而馫香型是在糖化完成后加入高溫大曲和蒸餾取酒后的糟醅堆積，馫香型工藝更接近醬香型的工藝是導(dǎo)致馫香型在骨干化合物的含量上更接近醬香型的重要原因之一。

圖4 7種原酒樣品定量結(jié)果PCA分析Fig.4 Principal component analysis of quantitative results of seven kinds of Baijiu samples

表2 7種原酒樣品風(fēng)味化合物定量結(jié)果比較Table 2 Comparison of quantitative results of flavor compounds of seven kinds of Baijiu samples

續(xù)表

對(duì)7種白酒結(jié)合具體風(fēng)味化合物進(jìn)行熱圖分析，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5的聚類分析可以看出，馫香型和馥郁香型這兩種三香混合的白酒風(fēng)味最為接近。馫香型白酒中肉豆蔻酸乙酯、苯丙酸乙酯、正丁醇的含量較其他6種高，分別達(dá)到了13.17 mg/L、7.95 mg/L和500.64 mg/L，其中肉豆蔻酸乙酯作為馫香型的骨架酯具有甜香和鳶尾油香[17-18]，苯丙酸乙酯具有棗香、蜂蜜甜香[19-20]，兩種化合物都是馫香型的重要香氣化合物；馥郁香型在異丁醇、戊酸乙酯、苯丙酸乙酯、丁酸乙酯和己酸丁酯等多種化合物的含量上都與馫香型比較接近；濃香型中己酸己酯、辛酸乙酯、正戊醇、己酸丁酯、正己醇、庚酸乙酯、己酸乙酯、2-戊酮、異丁醛的絕對(duì)含量明顯高于其他香型，這些物質(zhì)被分為一類，與濃香型的正相關(guān)性最高，β-苯乙醇與濃香型負(fù)相關(guān)性最高；清香型中乙醛含量最高，這可能是由于兩個(gè)原因造成的，一是乙醛和乙縮醛的含量占清香型總羰基化合物的90%以上[21]，二是清香型比起其他6種貯存時(shí)間最短；小曲清香型與β-苯乙醇、癸酸乙酯、乙酯異戊酯、異戊醇、異丁醇正相關(guān)性最高，其中乙酸異戊酯的含量與馫香型十分接近，分別達(dá)到了10.35 mg/L和13.07 mg/L，而此化合物是影響小曲白酒風(fēng)味的關(guān)鍵化合物[22]；兼香型與正戊醇、正丙醇正相關(guān)性最高；醬香型中乳酸乙酯、棕櫚酸乙酯、油酸乙酯、糠醛、DL-白氨酸乙酯、己酸異戊酯、乙偶姻、丙醛含量最高，其中乙偶姻是醬香型白酒的功能化合物四甲基吡嗪的前體物質(zhì)[23]；DL-白氨酸乙酯也是一種關(guān)鍵的香氣化合物，對(duì)陳醋和黃酒的風(fēng)味貢獻(xiàn)較大[24-25]。

圖5 7種原酒樣品骨干化合物聚類分析Fig.5 Cluster analysis of basic compounds of seven kinds of Baijiu samples

3 結(jié)論

白酒釀造工藝和微生物菌落是影響白酒品質(zhì)和風(fēng)味的重要因素。在白酒的生產(chǎn)過(guò)程中，原料、曲種、發(fā)酵容器和地理環(huán)境的差異導(dǎo)致微生物種數(shù)量和種類的差異，從而最終導(dǎo)致了白酒風(fēng)味化合物的差異。本研究最終證明馫香型白酒成功融合了濃、清、醬三種香型的生產(chǎn)工藝，是一種類似于馥郁香型的具有復(fù)合香氣的新型白酒。其中馫香型與醬香型乳酸乙酯含量都相對(duì)較高，且DL-白氨酸乙酯的含量明顯高于其他香型；從泥窖發(fā)酵工藝帶來(lái)的影響分析，馫香型與濃香型都與己酸、己酸乙酯、己酸己酯、己酸異丁酯、庚酸乙酯、己酸乙酯、己酸丁酯、戊酸乙酯、己酸戊酯和乙酸己酯等化合物存在較高的相關(guān)性；從骨干化合物的含量分析，馫香型與小曲清香型中β-苯乙醇、乙酸異戊酯和異戊醇的絕對(duì)含量相差很小且明顯高于其他香型，三種化合物含量分別達(dá)了26.74 mg/L，10.35 mg/L，557.07 mg/L。由此可見(jiàn)，馫香型中風(fēng)味化合物的種類和含量都與濃、清、醬三種香型有一定的相似度，卻又形成了自己獨(dú)特的風(fēng)味。