賴田甜，趙 華，姚夢(mèng)柯，朱 晨，張 敏，楊貞耐*

（北京工商大學(xué) 北京食品營(yíng)養(yǎng)與健康高精尖創(chuàng)新中心 北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048）

乳酸菌胞外多糖（exopolysaccharides，EPS）是乳酸菌代謝產(chǎn)生的以緊密結(jié)合于菌體表面或松散附著的粘液形式分泌于細(xì)胞外的高分子聚合物[1]。乳酸菌EPS具有多種生理活性，如抗氧化[2]、抗腫瘤[3]、調(diào)節(jié)免疫[4-5]等；同時(shí)，作為一種天然高分子化合物還具有良好的穩(wěn)定性和增稠性。產(chǎn)EPS乳酸菌在發(fā)酵乳制品加工中得到了越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。

發(fā)酵乳是以鮮乳為原料，經(jīng)巴氏殺菌后，添加發(fā)酵劑發(fā)酵而制成的發(fā)酵乳制品[6]。利用功能性乳酸菌作為發(fā)酵劑可以改善發(fā)酵乳的功能特性和發(fā)酵性能。HAN X等[7]研究發(fā)現(xiàn)，以產(chǎn)EPS乳酸菌作為發(fā)酵劑可以獲得具有良好口感、質(zhì)地及風(fēng)味的發(fā)酵乳；BURNS P等[8-9]研究發(fā)現(xiàn)，將產(chǎn)EPS的發(fā)酵劑應(yīng)用于發(fā)酵乳中可以有效提高其黏度和穩(wěn)定性，能夠抑制發(fā)酵乳凝膠斷裂和乳清的析出，提高凝乳的持水性。

前期研究表明，植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NMGL2具有良好的耐低溫、耐酸、耐膽鹽以及抑菌特性，并產(chǎn)生EPS[10]。利用該菌株制備發(fā)酵乳，其在冷藏過(guò)程中可有效地保持菌株的活性及產(chǎn)品的功能性[11]。本研究進(jìn)一步針對(duì)植物乳桿菌NMGL2產(chǎn)的EPS，通過(guò)提取獲得此多糖，研究其對(duì)菌株NMGL2的生長(zhǎng)、菌體形態(tài)和穩(wěn)定性的影響；并在此基礎(chǔ)上，將EPS應(yīng)用于植物乳桿菌NMGL2發(fā)酵乳加工中，研究其對(duì)發(fā)酵乳加工特性的影響，為植物乳桿菌NMGL2應(yīng)用于發(fā)酵乳制品的生產(chǎn)提供技術(shù)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）NMGL2：分離自傳統(tǒng)內(nèi)蒙古干酪；鮮牛奶：北京三元食品股份有限公司；脫脂乳粉：新西蘭恒天然集團(tuán)；MRS肉湯培養(yǎng)基：北京奧博星生物技術(shù)有限公司；瓊脂粉（生化試劑）：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；氯化鈉（分析純）：西隴科學(xué)股份有限公司；硫酸亞鐵、氯化鋅、甲醇、三氯乙酸、無(wú)水乙醇、氯化鈣（均為分析純）：福晨化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HITACHI掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope，SEM）：日立高新技術(shù)公司；EDC均質(zhì)機(jī)：上海依肯機(jī)械設(shè)備有限公司；BCN-1360B超凈工作臺(tái)：北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；HZQ-Q恒溫培養(yǎng)箱：上海一恒科學(xué)儀器有限公司；MLS-3750高壓蒸汽滅菌鍋：日本Sanyo公司；Master光學(xué)法微流變儀：法國(guó)Formulaction公司；iCinac乳品發(fā)酵檢測(cè)儀：法國(guó)AMS-alliance公司；Brookfield CT3質(zhì)構(gòu)儀：美國(guó)Brookfield公司；CR21Ⅲ低溫冷凍離心機(jī)：美國(guó)Bio-Rad公司；Infinite M200 PRO NanoQuant酶標(biāo)儀：瑞士Tecan公司；MS3000馬爾文粒度粒徑分析儀：美國(guó)布魯克儀器公司；R30A電動(dòng)攪拌器：南京庚辰科學(xué)儀器有限公司；Beta 1-8 Ldplus冷凍干燥機(jī)：德國(guó)Marin Christ公司。

1.3 方法

1.3.1 植物乳桿菌NMGL2胞外多糖的制備

將保存于-80 ℃甘油管的植物乳桿菌NMGL2在室溫下融化，按2%（V/V）的接種量接種到已滅菌的MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃靜置培養(yǎng)12 h作為活化菌液；按2%（V/V）接種量進(jìn)行傳代培養(yǎng)，37 ℃培養(yǎng)12 h，發(fā)酵完成后將發(fā)酵液于4 ℃冰箱冷藏備用。

EPS的提取方法參照WANG J等[12]稍作改動(dòng)。采用4%三氯乙酸對(duì)植物乳桿菌NMGL2發(fā)酵液（1 L）進(jìn)行處理，離心（9 500 r/min，30 min，4 ℃）去除細(xì)胞和蛋白。加入兩倍體積體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇，4 ℃沉淀、離心（9 500 r/min，30 min，4 ℃）、透析（截留分子質(zhì)量8 000～14 000 Da，4 ℃）、濃縮、冷凍干燥獲得EPS，于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.3.2 胞外多糖EPS對(duì)植物乳桿菌NMGL2生長(zhǎng)、形態(tài)及穩(wěn)定性的影響

將植物乳桿菌NMGL2活化菌液按2%（V/V）的接種量接種到100 mL MRS液體培養(yǎng)基中，分別添加2%和4%的EPS，設(shè)置為EPS-2組和EPD-4組，以不添加EPS為對(duì)照組，37 ℃靜置培養(yǎng)。

（1）菌株生長(zhǎng)的測(cè)定：每隔2 h取樣，測(cè)定菌體OD600nm值，連續(xù)測(cè)定32 h。采用平板菌落計(jì)數(shù)法，選取適宜的稀釋梯度，計(jì)算樣品培養(yǎng)24 h時(shí)的活菌數(shù)。

（2）形態(tài)觀察：以EPS-4為實(shí)驗(yàn)組，不添加EPS為對(duì)照組，37 ℃培養(yǎng)24 h后，采用MIN W H等[1]方法，并略有改動(dòng)，使用掃描電子顯微鏡（SEM）對(duì)植物乳桿菌NMGL2的形態(tài)進(jìn)行觀察。在樣品中加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)2.5%、pH6.8的戊二醛溶液進(jìn)行固定，4 ℃冷藏過(guò)夜，置于液氮中冷凍，取出后用刀片切斷橫截面，并用pH6.8的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）沖洗3次，每次10 min。采用體積分?jǐn)?shù)分別為30%、50%、70%、80%、90%、100%的乙醇進(jìn)行梯度脫水，每次10 min。用氯仿脫脂2 h，同時(shí)間間隔振蕩，以叔丁醇置換乙醇，用無(wú)水乙醇沖洗10 min，無(wú)水乙醇∶叔丁醇=1∶1（體積比）沖洗6 min，純叔丁醇沖洗6 min。真空冷凍干燥，選擇要觀察的面進(jìn)行固定，鍍金后進(jìn)行SEM觀察。

（3）Zeta電位分析：以EPS-4為實(shí)驗(yàn)組，不添加EPS為對(duì)照組，37 ℃培養(yǎng)24 h后，取10 μL溶于40 mL相同pH的去離子水中，加入馬爾文Zeta電位分析儀的電極杯中潤(rùn)洗2次，運(yùn)行程序5個(gè)循環(huán)，選取循環(huán)測(cè)定時(shí)電位正負(fù)值穩(wěn)定的結(jié)果記錄，每個(gè)樣品測(cè)定3次[13]。

1.3.3 植物乳桿菌NMGL2發(fā)酵乳的制備

鮮牛乳（蛋白質(zhì)3.1%、脂肪3.7%）預(yù)熱至60～75 ℃，分別加入2%和4%的EPS，設(shè)置為EPS-2組和EPS-4組，以未加EPS為對(duì)照，40 MPa條件下均質(zhì)，95 ℃殺菌5 min，冷卻至37 ℃，并按5%（V/V）的接種量將植物乳桿菌NMGL2接入鮮牛乳中，于37 ℃條件下發(fā)酵至pH4.5，迅速置于冷水中冷卻至4 ℃，并置于4 ℃冷藏備用。

1.3.4 發(fā)酵乳指標(biāo)的測(cè)定

pH值的測(cè)定：將樣品轉(zhuǎn)移至iCinac乳品發(fā)酵監(jiān)控儀中，37 ℃下對(duì)發(fā)酵過(guò)程中pH的變化進(jìn)行監(jiān)測(cè)，每隔1 h記錄一次樣品的pH值。

微流變特性指標(biāo)的測(cè)定：采用微流變儀在37 ℃條件下監(jiān)測(cè)發(fā)酵凝膠形成過(guò)程中微流變學(xué)參數(shù)即彈性指數(shù)（elasticityindex，EI）、宏觀黏度指數(shù)（macroscopic viscosity index，MVI）及流動(dòng)性指數(shù)（fluidity index，F(xiàn)I）隨時(shí)間的變化情況，每隔1 h記錄一次數(shù)據(jù)。

質(zhì)構(gòu)指標(biāo)的測(cè)定：發(fā)酵乳樣品于4 ℃冰箱儲(chǔ)存24 h后，用Brookfield CT3質(zhì)構(gòu)儀測(cè)定發(fā)酵乳的硬度、黏性和內(nèi)聚性。測(cè)定條件為：采用TA10平底柱形探頭，直徑2.5 cm，測(cè)定速度1.0 mm/s，刺入深度10 mm，返回速度1.0 mm/s。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

每個(gè)樣品至少測(cè)定3次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Origin2018作圖，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。采用方差分析檢驗(yàn)各樣本間的顯著性差異，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2的影響

2.1.1 胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2生長(zhǎng)的影響

胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2生長(zhǎng)的影響見(jiàn)圖1。

圖1 胞外多糖添加量對(duì)植物乳桿菌NMGL2 OD600nm值（a）及活菌數(shù)（b）的影響Fig.1 Effect of exopolysaccharides addition on OD600nm value (a) and the viable counts (b) of Lactobacillus plantarum NMGL2

發(fā)酵液在波長(zhǎng)600 nm處的吸光度值反映了細(xì)菌的生長(zhǎng)狀況，與發(fā)酵液中菌體總數(shù)成直線正相關(guān)關(guān)系[14]。由圖1a可知，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，植物乳桿菌NMGL2在不同EPS添加量的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)趨勢(shì)大致相同，均經(jīng)歷了遲緩期、對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期及穩(wěn)定期[15]。在培養(yǎng)4～10 h時(shí)，EPS的添加量與菌株NMGL2的生長(zhǎng)速率呈正相關(guān)，分析原因可能是EPS能被植物乳桿菌NMGL2利用，為菌株的生長(zhǎng)繁殖提供物質(zhì)基礎(chǔ)，從而一定程度上促進(jìn)菌株生長(zhǎng)[16]。由圖1b可知，添加EPS的培養(yǎng)基中的活菌數(shù)顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），且當(dāng)EPS添加量為4%時(shí)，活菌數(shù)最高，達(dá)4.3×109CFU/mL，表明EPS可以顯著改善植物乳桿菌NMGL2的存活能力[16]，與之前有關(guān)植物乳桿菌YW11 EPS促進(jìn)菌株存活作用的研究結(jié)果一致[17]。為了更好地觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)均采用EPS-4為實(shí)驗(yàn)組。

2.1.2 胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2形態(tài)特征的影響

胞外多糖對(duì)植物乳桿菌株NMGL2形態(tài)特征的影響見(jiàn)圖2。

圖2 掃描電鏡觀察胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2菌體形態(tài)的影響Fig.2 Effects of exopolysaccharides on the morphology of Lactobacillus plantarum NMGL2 by scanning electron microscopy

通常乳酸菌產(chǎn)生的EPS具有一定的黏性，依據(jù)其產(chǎn)量的高低對(duì)菌株的自聚集具有不同程度的影響[18]。由圖2可知，植物乳桿菌NMGL2呈桿狀，菌體邊緣清晰，分布均勻，形態(tài)規(guī)則；而添加EPS后在菌體表面形成黏稠層，菌體之間出現(xiàn)黏連現(xiàn)象，并導(dǎo)致細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化。早期研究報(bào)道了不同植物乳桿菌菌株產(chǎn)的EPS具有不同的微觀結(jié)構(gòu)，并具有較高的黏性及持水能力，對(duì)菌體形態(tài)具有不同的影響[1，12，19]。進(jìn)一步采用高放大倍數(shù)SEM觀察，發(fā)現(xiàn)空白組的菌體間存在一定的間隙，而添加EPS后菌體排列緊湊，EPS填充在細(xì)胞間隙中，分布極不均勻。這表明EPS對(duì)菌株自聚集性具有促進(jìn)作用，與之前有關(guān)唾液乳桿菌（Lactobacillus salivarius）EPS促進(jìn)菌體聚集的研究結(jié)果一致[18]。除EPS外，菌株自聚集性還與菌體表面特性有關(guān)。如約氏乳桿菌（Lactobacillus johnsonii）EPS的產(chǎn)生和菌體自聚集呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)EPS產(chǎn)量下降使菌體覆蓋層減少時(shí)，菌體表面潛在蛋白暴露，從而提高菌株自聚集[20]。

2.1.3 胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2穩(wěn)定性的影響

通過(guò)Zeta電位分析可以推測(cè)膠狀分散體中分散系的穩(wěn)定性，Zeta電位數(shù)值的絕對(duì)值越大，體系的穩(wěn)定性越好[21]。與膠體懸浮液中惰性顆粒表面相比，細(xì)菌細(xì)胞的表面復(fù)雜，細(xì)胞表面物質(zhì)、培養(yǎng)基及其pH和離子強(qiáng)度等多種因素會(huì)影響菌體的Zeta電位及菌體穩(wěn)定性[22]。胞外多糖EPS對(duì)植物乳桿菌NMGL2穩(wěn)定性的影響見(jiàn)圖3。

由圖3可知，植物乳桿菌NMGL2及其胞外多糖EPS均具有相對(duì)較高的Zeta電位絕對(duì)值，但是將EPS添加于植物乳桿菌NMGL2菌株體系，此混合體系的Zeta電位絕對(duì)值降低，表明EPS添加降低了菌株體系的穩(wěn)定性。這可能由于EPS覆蓋在菌體表面上，屏蔽了部分的表面電荷，從而降低了Zeta電位[23-24]。并且過(guò)量的胞外多糖分子可能會(huì)造成的空間位障，削弱體系中粒子之間的靜電相互作用，進(jìn)而造成體系穩(wěn)定性降低[25-26]。

圖3 Zeta電位分析胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effect of exopolysaccharides on the stability of Lactobacillus plantarum NMGL2 by Zeta potential

2.2 胞外多糖對(duì)發(fā)酵乳的影響

2.2.1 胞外多糖對(duì)發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中pH變化的影響

胞外多糖對(duì)發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中pH變化的影響見(jiàn)圖4。

圖4 不同胞外多糖添加量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵乳pH變化的影響Fig.4 Effect of different exopolysaccharides addition on pH of fermented milk during fermentation

由圖4可知，對(duì)于不同EPS添加量的各組樣品，相同時(shí)間點(diǎn)的pH值略有差異，但是整體上各組樣品pH變化趨勢(shì)大致相同，都是先下降后趨于平衡。在發(fā)酵前期，菌株生長(zhǎng)處于遲緩期，pH緩慢降低，分析原因可能是菌株自身進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，還沒(méi)有大量產(chǎn)酸；到5 h左右，pH下降加快，此時(shí)菌株生長(zhǎng)進(jìn)入對(duì)數(shù)期，在快速生長(zhǎng)的同時(shí)也大量產(chǎn)酸；到12 h左右，隨著營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消耗，菌體的生長(zhǎng)和代謝水平下降，pH下降趨于平緩，此時(shí)菌株進(jìn)入穩(wěn)定期和衰亡期[27]。因此，不同添加量的EPS對(duì)于植物乳桿菌NMGL2發(fā)酵過(guò)程中pH的變化趨勢(shì)的影響不明顯。

2.2.2 胞外多糖對(duì)發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程微流變特性變化的影響胞外多糖對(duì)發(fā)酵乳發(fā)酵過(guò)程中微流變特性變化的影響見(jiàn)圖5。

圖5 不同胞外多糖添加量對(duì)發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵乳彈性指數(shù)（A）、宏觀黏度指數(shù)（B）、流動(dòng)性指數(shù)（C）的影響Fig.5 Effect of different exopolysaccharides addition on elasticity index (A),macroscopic viscosity index (B) and fluidity index(C) of fermented milk during fermentation

由圖5可知，添加EPS組發(fā)酵乳的EI、MVI、FI變化整體趨勢(shì)相同，但是和對(duì)照組之間存在較大的差異。在發(fā)酵前期，菌株幾乎不產(chǎn)酸，pH下降緩慢，此時(shí)樣品處于低彈性、低黏度、高流動(dòng)的狀態(tài)；當(dāng)菌株開(kāi)始大量產(chǎn)酸，pH開(kāi)始急速下降時(shí)，發(fā)酵乳的黏度和彈性開(kāi)始上升，流動(dòng)性開(kāi)始下降，逐漸開(kāi)始形成高彈性、高黏度、低流動(dòng)的穩(wěn)定的凝膠體系。

由圖5A可知，與對(duì)照組相比，添加EPS組發(fā)酵乳的彈性上升速度較快，且EPS-4組酸乳彈性上升速度最快；發(fā)酵結(jié)束后，EPS-4組樣品的彈性介于對(duì)照組和EPS-2組之間，表明適量添加EPS可以增加酸乳的彈性。但蔡淼等[28]研究發(fā)現(xiàn)，植物乳桿菌EPS-YW11的添加會(huì)降低酸乳彈性。這可能與不同菌株胞外多糖的特性不同有關(guān)，在發(fā)酵過(guò)程中EPS與乳蛋白之間相互作用時(shí)對(duì)凝膠特性產(chǎn)生不同的影響[29]。

由圖5B可知，在發(fā)酵過(guò)程中，隨著乳酸菌大量地增殖產(chǎn)酸，pH不斷降低，發(fā)酵乳中的蛋白質(zhì)分子表面活性降低，形成微小的亞膠體分子團(tuán)，進(jìn)而增加液體的黏度。添加EPS組發(fā)酵乳的黏度高于對(duì)照組，可能是因?yàn)镋PS填充于酪蛋白網(wǎng)絡(luò)空隙，使發(fā)酵乳組織結(jié)構(gòu)更加致密，增加了發(fā)酵乳的凝聚力。發(fā)酵過(guò)程MVI變化趨勢(shì)與前述EI變化大致相同。發(fā)酵結(jié)束后，EPS-4組樣品的黏度介于對(duì)照組和EPS-2組之間，表明適當(dāng)?shù)腅PS添加量可以提高酸乳樣品的黏稠度。

由圖5C可知，對(duì)照組發(fā)酵乳的流動(dòng)性始終要高于添加EPS組，可能是因?yàn)镋PS使發(fā)酵乳中蛋白交聯(lián)作用加強(qiáng)。但不同添加量的EPS對(duì)發(fā)酵乳的流動(dòng)性影響差異不大。因此，推測(cè)EPS和植物乳桿菌NMGL2能夠協(xié)同促進(jìn)發(fā)酵乳凝膠結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。

2.2.3 胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性的影響

胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性的影響見(jiàn)表1。

表1 不同添加量的胞外多糖對(duì)植物乳桿菌NMGL2發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)特性的影響Table 1 Effect of different exopolysaccharides addition on the texture of fermented milk with Lactobacillus plantarum NMGL2

由表1可知，與對(duì)照組相比，EPS-2和EPS-4組發(fā)酵乳樣品的硬度分別下降7.11%和8.33%，黏性分別提高23.64%和42.66%，內(nèi)聚性均提高了7%。EPS-2和EPS-4組發(fā)酵乳樣品的內(nèi)聚性差異不顯著（P＞0.05），達(dá)0.46左右。這與發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）Lf2和植物乳桿菌YW11胞外多糖對(duì)發(fā)酵乳質(zhì)構(gòu)影響的研究結(jié)果一致[28，30]，分析原因可能主要與胞外多糖和乳基質(zhì)中蛋白質(zhì)之間的相互作用有關(guān)[31]，EPS降低了蛋白質(zhì)分子之間相互作用引起的大分子聚集，改善發(fā)酵乳的質(zhì)構(gòu)特性[32]。

3 結(jié)論

植物乳桿菌NMGL2胞外多糖與菌株NMGL2混合培養(yǎng)促進(jìn)了菌株的生長(zhǎng)，顯著提高了活菌數(shù)。掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)添加胞外多糖后菌體之間出現(xiàn)黏連現(xiàn)象，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生不規(guī)則變化，且EPS附著在菌株NMGL2菌體細(xì)胞表面，降低了體系Zeta電位及穩(wěn)定性。將植物乳桿菌NMGL2應(yīng)用于發(fā)酵乳加工，在發(fā)酵過(guò)程中，不同添加量的胞外多糖對(duì)菌株NMGL2的產(chǎn)酸及發(fā)酵乳的內(nèi)聚性影響不顯著（P＞0.05），但能顯著提高發(fā)酵乳的彈性和黏性，顯著降低流動(dòng)性和硬度（P＜0.05）。本研究結(jié)果表明產(chǎn)EPS植物乳桿菌NMGL2對(duì)發(fā)酵乳加工特性的有效改善作用，具有良好的應(yīng)用前景。