米 璐， 甘芝霖， 王 雪， 張星聯， 楊曙明， 邱 靜， 徐貞貞,*

(1.中國農業(yè)大學 食品科學與營養(yǎng)工程學院/國家果蔬加工工程技術研究中心/農業(yè)農村部果蔬加工重點實驗室/食品非熱加工北京市重點實驗室， 北京 100083；2.中國農業(yè)科學院 農業(yè)質量標準與檢測技術研究所/農業(yè)農村部農產品質量安全重點實驗室， 北京 100081；3.北京林業(yè)大學 生物科學與技術學院/林業(yè)食品加工與安全北京市重點實驗室， 北京 100083)

北京油雞是北京地區(qū)獨有的肉蛋兼用的珍稀地方黃羽肉雞品種，已有300余年的養(yǎng)殖歷史，有鳳頭、毛腿和胡子嘴特征。公雞頭部高昂，羽毛色澤亮且鮮艷，多為黑色；母雞體態(tài)較為敦實，頭、尾略微翹，脛較短。相比于白羽肉雞，北京油雞在肉質性狀、營養(yǎng)成分等方面存在得天獨厚的優(yōu)勢[1]，肌間脂肪分布好、肉質細膩且味道鮮美，深受消費者喜愛。氟苯尼考(florfenicol，FF)，是一種動物專用型氯霉素類抗菌廣譜藥物，具有吸收好，體內分布廣，抗菌效果好等特點；不同于已被歐盟[2]和我國列為禁用藥的氯霉素(chloramphenicol，CAP)，氟苯尼考不易產生耐藥性且毒副作用低[3]，被廣泛用于治療畜禽[4](豬、雞、牛等)及水產[5](甲殼類動物、淡水魚、海水魚)等養(yǎng)殖動物的細菌性疾病。目前，有很多關于氟苯尼考的藥代動力學研究，報道顯示，不同的產品類型[6]、給藥方式[7-8]、給藥劑量[9]以及動物的健康狀況[10]都會導致藥物代謝差異。關于氟苯尼考在白羽肉雞[11-12]和雞蛋[13]中的殘留消除規(guī)律已有較多報道，但是，氟苯尼考在北京油雞體內的殘留變化規(guī)律尚不明確，給食品安全問題埋下了隱患。本研究擬針對北京油雞開展氟苯尼考殘留變化規(guī)律研究，評估氟苯尼考殘留標示物(以氟苯尼考和氟苯尼考胺之和計)在北京油雞不同組織中的殘留變化規(guī)律，探明其在北京油雞中的殘留消除時間，希望為北京油雞中抗菌藥氟苯尼考休藥期的制定提供數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

試劑：氟苯尼考粉(質量分數20%)，廣東大華農動物保健品股份有限公司；氟苯尼考標準品溶液(純度99.9%)、氟苯尼考胺標準品溶液(純度99.8%)，美國A ChemTek公司；甲醇、甲酸，均為色譜純，北京迪馬科技有限公司；乙酸乙酯、正己烷，均為色譜純，北京邁瑞達科技有限公司；乙腈，色譜純，美國Thermo Fisher Scientific公司；氨水(質量分數25%)，分析純，北京化工廠；超純水，Milli-Q一體化水凈化系統(tǒng)制備。

標準溶液：氟苯尼考標準品母液(質量濃度10 μg/mL)：準確量取1 mL質量濃度為100 μg/mL的氟苯尼考標準品溶液，用甲醇稀釋至10 mL，-20 ℃保存。氟苯尼考胺標準品母液(質量濃度10 μg/mL)：準確量取1 mL質量濃度為100 μg/mL的氟苯尼考胺標準品溶液，用甲醇稀釋至10 mL，-20 ℃保存。 內標溶液(質量濃度1 μg/mL)：分別準確量取100 μL氟苯尼考標準品母液、100 μL氟苯尼考胺標準品母液以及800 μL甲醇，混勻。

流動相：甲酸乙腈/水(質量分數為0.5%)：準確量取2.5 mL甲酸，用乙腈/水[V(乙腈)∶V(水)=1∶4]溶液定容至500 mL。流動相A(質量分數為0.01%甲酸水)：準確量取50 μL甲酸，用水定容至500 mL。

北京油雞種雞(110日齡)購自北京市畜牧獸醫(yī)研究所，公雞80只，平均體質量(1.92±0.32) kg；母雞80只，平均體質量(1.73±0.45) kg。雞體色均勻、體表無傷、活力好，進食正常，體質健康，隨機抽檢雞肉及其前期食用飼料均無氟苯尼考給藥殘留。試驗預飼2周，飼喂無抗飼料，自由飲水。在預飼期間，對照組每只公雞平均日采食量為80 g，每只母雞平均日采食量為76 g，給藥組每只公雞平均日采食量為72 g，每只母雞平均日采食量為60 g。

1.2 儀器與設備

AcquityTMUltra Performance LC型超高效液相色譜儀，Waters公司；Triple QuadTM4500型三重四級桿質譜儀，美國愛博才思公司；TTL- DC Ⅱ型氮吹儀，北京同泰聯科技發(fā)展有限公司；VX- Ⅲ型高速渦旋儀，北京踏錦科技有限公司；3K15型高速冷凍離心機，德國Sigma公司；分析天平，艾德姆衡器(武漢)有限公司；0.22 μm有機濾膜，安捷倫公司；1～10 μL、20～200 μL、100～1 000 μL可調微量移液器，Eppendorf公司；Milli-Q Advantage A10型純水系統(tǒng)，德國Merck Millipore公司。

1.3 試驗方法

1.3.1試驗動物給藥及樣品采集

試驗雞隨機分為4組，2組為給藥組，2組為對照組。給藥組公母各40只，對照組公雞40只，母雞33只(由于7只母雞在試驗過程中死亡，40只變?yōu)?3只)，試驗前后各組飼養(yǎng)條件相同。試驗雞4只一籠，給藥前分別稱重，編號。本試驗用雞體質量較大，因此按照預飼期間的平均體質量和采食量對拌料濃度進行估算，確定氟苯尼考粉與飼料的拌料質量分數為2.5 g/kg。采用口服飼喂給藥方式給北京油雞用氟苯尼考粉，每隔24 h給藥1次，連續(xù)給藥5 d。參照《中國獸藥典(2015年版)》，按照采食量和體質量計算給藥組的氟苯尼考攝入量，公雞21.6 mg/kg(以體質量計)，母雞21.4 mg/kg(以體質量計)。在給藥前1 d停止喂料并采集組織樣品為空白對照組。按采樣時間點2.5 h、1、3、5、7、9、12、15、21 d時各屠宰6只公雞(給藥組4只、對照組2只)和6只母雞(給藥組4只、對照組2只)，采集肌肉(雞胸肉)、腎臟、肝臟組織后迅速降溫，置于-20 ℃保存?zhèn)溆茫瑫r取空白組織樣品和血液為對照。

1.3.2檢測分析方法

1.3.2.1 提取條件的確定

1)雞胸肉、肝臟樣品處理。樣品自然解凍后，準確稱取5.00 g(精確至0.01 g)已均質的雞胸肉、肝臟樣品于50 mL離心管中。向離心管中加入50 μL質量濃度為1 μg/mL內標溶液，渦旋10 s，再向其中加入15 mL乙酸乙酯和0.5 mL氨水，并加入1顆均質子，渦旋提取3 min，9 000 r/min離心5 min，轉移上清液至另一個50 mL離心管中。按以上步驟重復提取一次，合并上清液。取6 mL上清液于15 mL離心管中，在50 ℃下氮吹至近干，待凈化。

2)腎臟樣品處理。樣品自然解凍后，準確稱取2.00 g(精確至0.01 g)已均質的腎臟樣品于50 mL離心管中。向離心管中加入20 μL質量濃度為1 μg/mL內標溶液，渦旋10 s，再向其中加入6 mL乙酸乙酯和0.2 mL氨水，并加入1顆均質子，渦旋提取1 min，9 000 r/min離心5 min，轉移上清液至另一個50 mL離心管中。按以上步驟重復提取一次，合并上清液。取6 mL上清液于15 mL離心管中，在50 ℃下氮吹至近干，待凈化。

1.3.2.2 凈化條件的確定

用1 mL 質量分數為0.5%甲酸乙腈/水[V(乙腈)∶V(水)=1∶4]溶液復溶，渦旋30 s，加入5 mL飽和正己烷，渦旋1 min，9 000 r/min離心2 min，棄去上層正己烷，收集下層清液。重復操作3次。取清液過0.22 μm微孔濾膜，吸取適量濾液至進樣小瓶，待上機測定。

1.3.2.3 基質標準溶液的配制及測定

分別取對照組的各可食性組織(肌肉、腎臟、肝臟)作為空白樣品，按1.3.2.1和1.3.2.2中步驟操作，得到的濾液用作備用液。用備用液將氟苯尼考和氟苯尼考胺標準溶液分別稀釋成質量濃度為1、2、5、10、20、50、100 ng/mL的基質匹配標準溶液，上機進行超高壓液相色譜串聯三重四級桿質譜(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC- MS/MS)測定。

1.3.2.4 色譜和質譜條件的確定

1)色譜條件。色譜柱為C18(150 mm×3.0 mm，1.8 μm)，流動相為質量分數0.01%甲酸水(A)，乙腈(B)，梯度洗脫條件為0～1 min，98%A，2%B；1～3 min，98%～2%A，2%～98%B；3～5 min，2%A，98%B，5～5.1 min，2%～98%A，98%～2%B；5.1～8 min，98%A，2%B，流速為0.4 mL/min，柱溫30 ℃，進樣體積為10 μL。

2)質譜條件。電噴霧(ESI+/-)離子源；掃描方式為正離子掃描(氟苯尼考胺、氟苯尼考胺- D3)和負離子掃描(氟苯尼考、氟苯尼考- D3)。質譜掃描方式為動態(tài)多反應離子監(jiān)測(dMRM)。正離子掃描方式為氣簾氣35 psi，離子化電壓5 500 V，離子源溫度500 ℃，噴霧器50 ℃，輔助加熱氣50 ℃。負離子掃描方式為氣簾氣35 psi，離子化電壓-4 500 V，離子源溫度500 ℃，噴霧器50 ℃，輔助加熱氣50 ℃。氟苯尼考殘留標示物(氟苯尼考和氟苯尼考胺)特征離子參考質譜條件見表1。

表1 特征離子參考質譜條件Tab.1 Optimized MS/MS parameters for drug

1.3.3方法的檢出限和定量限的確定

添加一定質量濃度的標準溶液于空白樣品(肌肉、肝臟、腎臟組織)中，按照1.3.2.1和1.3.2.2中步驟處理后進行UPLC- MS/MS測定，取信噪比為3和10時的濃度測出檢出限(limit of determination，LOD)和定量限(limit of quantitation，LOQ)。

1.4 數據處理

除方法檢出限和定量限的測定進行6次平行試驗之外，其余試驗均進行4次平行試驗，數據以平均值±標準偏差表示。采用Excel 2010軟件繪制基質標準曲線，采用Graphpad Prism 9軟件繪制藥物濃度變化曲線，采用WT 1.4軟件進行休藥期計算。

2 結果與分析

2.1 標準曲線、方法檢出限和定量限分析

在已建立的質譜條件下，用UPLC- MS/MS法測定基質匹配標準溶液濃度，橫坐標分別為氟苯尼考、氟苯尼考胺基質標準溶液的質量濃度，縱坐標為定量離子的色譜峰面積，得到的基質標準曲線回歸方程見表2。由表2可知，標準曲線在樣品質量濃度為2～100 ng/mL時具有良好線性關系，線性回歸直線擬合優(yōu)度的相關系數R2均大于0.99。氟苯尼考和氟苯尼考胺在北京油雞各可食性組織中的LOD分別為0.5 μg/kg和1.0 μg/kg，LOQ分別為1.0 μg/kg和10.0 μg/kg；選擇空白(肌肉、肝臟、腎臟組織)樣品，在50 μg/kg添加水平下，按照1.3.2和1.3.3中步驟處理，計算得空白添加回收率為101.89%～109.43%，且該方法具有較高回收率[14]。結果表明，本試驗采用的UPLC- MS/MS方法能滿足氟苯尼考、氟苯尼考胺在北京油雞各可食性組織(肌肉、肝臟、腎臟)的殘留檢測需要。

表2 方法學參數Tab.2 Methodological parameters

2.2 氟苯尼考在北京油雞各可食性組織中的殘留變化規(guī)律

氟苯尼考殘留除原型藥物之外，還存在氟苯尼考胺、氟苯尼考醇以及其他尚未明確的代謝物，其中，氟苯尼考胺為其主要代謝物。在動物體內，氟苯尼考的酰胺鍵斷裂轉化為無活性的代謝物氟苯尼考胺[14]。我國食品安全國家標準GB 31650—2019《食品安全國家標準 食品中獸藥最大殘留限量》[15]和歐洲藥品管理局[16]確定的氟苯尼考在動物體內的殘留標示物是氟苯尼考和氟苯尼考胺之和。

2.2.1氟苯尼考殘留變化規(guī)律

停藥之后，北京油雞各可食性組織(肌肉、肝臟、腎臟)中氟苯尼考的殘留變化情況如圖1。由圖1可見，停藥后第2.5 h，北京油雞肌肉組織中氟苯尼考殘留量最高，在公雞肌肉組織中殘留可達(262.56±14.70) μg/kg，在母雞肌肉組織中殘留為(212.56±89.43) μg/kg。停藥后第12 d，公雞各組織中氟苯尼考殘留均低于母雞組織，在公雞、母雞肌肉組織中殘留分別為(1.53±0.90) μg/kg、(2.25±0.85) μg/kg，肝臟組織中殘留分別為(0.48±0.88) μg/kg、(1.51±2.09) μg/kg，腎臟組織中殘留分別為(10.30±0.80) μg/kg、(1.79±2.01) μg/kg。停藥后第21 d，仍能在肌肉組織中檢測到氟苯尼考殘留，其中公雞肌肉組織中氟苯尼考殘留量為(2.28±1.14) μg/kg，母雞肌肉組織中氟苯尼考殘留量為(1.30±0.70) μg/kg，而在腎臟和肝臟組織中氟苯尼考殘留量低于LOD(圖1)。氟苯尼考殘留量在北京油雞的公雞和母雞體內均呈下降趨勢，其消除時間較為緩慢；氟苯尼考的殘留量在肌肉組織大于肝臟組織，該現象與其他動物體內的變化規(guī)律一致[17]，這是由于氟苯尼考藥物通過脂溶性彌散進入細菌細胞內[18]，作用于細菌70S核糖體的50S亞基達到殺菌目的，所以氟苯尼考在肌肉組織中殘留較多。

圖1 氟苯尼考在北京油雞體內各組織的殘留變化規(guī)律Fig.1 Residue depletion curves of florfenicol from Beijing fatty chicken tissues

2.2.2氟苯尼考胺殘留變化規(guī)律

停藥之后，北京油雞各可食性組織(肌肉、肝臟、腎臟)中氟苯尼考胺的殘留變化情況如圖2。停藥后第2.5 h，氟苯尼考胺在北京油雞肝臟組織中的平均殘留量最高，公雞可達(521.04±66.56)μg/kg、母雞可達(781.46±496.00)μg/kg，之后依次是腎臟組織[公雞(265.53±106.44)μg/kg、母雞(177.62±76.12)μg/kg]和肌肉組織[公雞(106.62±31.06)μg/kg、母雞(64.28±26.25)μg/kg]；停藥后第12 d，在母雞腎臟和肌肉組織以及公雞肝臟、腎臟和肌肉組織中氟苯尼考胺的殘留含量均低于LOD，僅能在母雞肝臟組織中檢測出氟苯尼考胺殘留(圖2)。氟苯尼考胺殘留量在北京油雞的公雞和母雞體內呈基本一致的趨勢。研究可知，在藥物代謝過程中，代謝產物氟苯尼考胺大都殘留于肝臟組織中。肝臟中較高的藥物殘留量與前人的報道[19]相一致，該過程可能與藥物的“首過效應”有關，在氟苯尼考口服吸收后，部分藥物還未達到全身循環(huán)之前已經被肝臟代謝，從而導致其代謝物含量升高。

圖2 氟苯尼考胺在北京油雞體內各組織的殘留變化規(guī)律Fig.2 Residue depletion curves of florfenicol-amine from Beijing fatty chicken tissues

2.2.3氟苯尼考殘留標志物變化規(guī)律

停藥之后，北京油雞各可食性組織(肌肉、肝臟、腎臟)中氟苯尼考殘留標志物(以氟苯尼考和氟苯尼考胺之和計)變化情況如圖3。停藥后第2.5 h，氟苯尼考和氟苯尼考胺在北京油雞的肝臟組織中平均殘留量最高，在母雞的肝臟組織中殘留峰值可達(881.88±278.90)μg/kg，在公雞的肝臟組織中殘留峰值也有(585.24±71.01)μg/kg，之后依次是腎臟組織[母雞(343.13±97.97)μg/kg]、公雞[(425.41±126.46)μg/kg]和肌肉組織[母雞(276.83±115.65)μg/kg、公雞(369.18±15.23)μg/kg]；停藥后第12 d，氟苯尼考胺殘留基本不能檢出，氟苯尼考殘留標示物中只剩氟苯尼考存在殘留(圖3)。由于母雞較高的脂肪含量且該藥物的親脂性，導致公雞各組織中的氟苯尼考殘留標志物低于母雞各組織的現象出現。氟苯尼考殘留標示物在肝臟組織中的變化程度比其在腎臟和肌肉組織中明顯，此現象表明，肝臟為氟苯尼考藥物在北京油雞體內的主要代謝器官。

圖3 氟苯尼考殘留標志物在北京油雞體內各組織的殘留變化情況Fig.3 Residue depletion curves of florfenicol and florfenicol-amine from Beijing fatty chicken tissues

由于口服用藥之后，氟苯尼考藥物吸收迅速，在組織內分布廣泛，在體內發(fā)生代謝轉化為氟苯尼考胺等其他代謝物，氟苯尼考胺的殘留上升。相比氟苯尼考，其代謝物氟苯尼考胺在北京油雞的可食性組織中消除較快。同時，在北京油雞體內出現類似于氟苯尼考在水產品[20]等中的“雙峰現象”，該藥物的代謝曲線也在停藥后第2.5天和第3天出現了兩個峰值，且最高峰值均出現在肝臟組織?！半p峰現象”可能與肝腸循環(huán)、胃腸循環(huán)等動物體內循環(huán)以及該藥物多部位吸收的特點有關。原藥經過吸收、分散、代謝等原因被稀釋[21-22]，從而濃度降低，因此其在達峰值降低后會發(fā)生再次回升，該現象受動物類型、給藥方式及實驗條件等因素的影響。

2.3 氟苯尼考在北京油雞體內休藥期的計算

休藥期是指動物停止給藥到許可屠宰或它們的產品許可上市的間隔時間[23]。動物在此期間，藥物在體內不斷地代謝、消除和排出，直至低于最大殘留量(maximum residue limit，MRL)。我國食品安全國家標準GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》和歐洲藥品管理局規(guī)定，氟苯尼考殘留標示物在肌肉(雞胸)、肝臟、腎臟中的MRLs分別為100、2 500、700 μg/kg。

采用WT 1.4軟件，用北京油雞雞胸、腎臟、肝臟組織中氟苯尼考殘留標示物的實測殘留量計算休藥期。結果顯示，北京油雞肝臟和腎臟組織中的氟苯尼考殘留標示物總量均低于MRL值，因此采用北京油雞肌肉(雞胸)組織的氟苯尼考殘留標示物總量計算休藥期。在置信區(qū)間為95%時，推算氟苯尼考在北京油雞的肌肉(雞胸)中休藥期為8.3 d；在置信區(qū)間為99%時，推算氟苯尼考在北京油雞的肌肉(雞胸)中休藥期為11.4 d。結合休藥期計算結果，建議氟苯尼考在北京油雞體內的休藥期不應低于12 d。

目前，我國的國家規(guī)定以及白羽肉雞的研究報道的休藥期均在一周之內。國家規(guī)定氟苯尼考可溶性粉在雞體內休藥期應不低于5 d[24]。Afifi等[11]在研究白羽肉雞體內氟苯尼考殘留消除規(guī)律時，盡管使用了多于本研究劑量[30 mg/kg(以體質量計)]的氟苯尼考藥物，但是在停藥后第3 d時，除了僅能在膽汁檢測到氟苯尼考殘留之外，其余組織和血漿樣本中均未檢出，該研究建議氟苯尼考在白羽肉雞中的休藥期不低于4 d。Anadn等[12]對白羽肉雞連續(xù)3 d口服給藥劑量為40 mg/kg(以體質量計)的氟苯尼考，分別以腎臟和肝臟為靶細胞，分析氟苯尼考殘留消除情況，參照歐盟標準[16]，建議休藥期不少于6 d。北京油雞與白羽肉雞在生長周期[25]、胃腸道消化功能[26]、脂肪含量、營養(yǎng)成分等方面均存在較大差異。北京油雞具有較慢的生長速度，并且不同腸道的結構和適應能力可能會影響藥物吸收和滯留時間，使其藥物代謝存在差異，導致氟苯尼考在北京油雞體內的休藥期明顯長于白羽肉雞，明顯長于我國國家目前規(guī)定的休藥期，這無疑會給該農產品的獸藥殘留抽檢以及消費者安全帶來影響。建議在之后的研究中對北京油雞其他的給藥方式加以驗證，確保不同劑型、不同劑量的氟苯尼考藥物有其對應的休藥期；并且氟苯尼考在其他黃羽肉雞體內的殘留變化規(guī)律也需要深入研究，應根據品種差異選擇合適的休藥期，在生產過程中更加規(guī)范用藥，從而確保食品安全。

3 結 論

本研究用口服飼喂方式給北京油雞用氟苯尼考粉，使用UPLC- MS/MS法檢測氟苯尼考殘留標示物含量，發(fā)現該藥物在北京油雞體內組織分布廣泛，且消除較慢，肝臟為氟苯尼考藥物在北京油雞體內的主要代謝器官。為滿足我國食品安全國家標準GB 31650—2019《食品安全國家標準食品中獸藥最大殘留限量》的相關要求，建議氟苯尼考在北京油雞養(yǎng)殖中執(zhí)行的休藥期應不低于12 d。希望本研究結果可為北京油雞中抗菌藥氟苯尼考休藥期的制定提供數據支撐；同時為響應我國農業(yè)農村部開展的獸用抗菌藥綜合治理活動，規(guī)范用藥，保障包括北京油雞在內的黃羽肉雞產業(yè)發(fā)展提供技術參考。