敖金成 李永梅 李博

摘要：為探明連作與感染根腐病煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化，采用Illumina高通量技術(shù)對(duì)細(xì)菌16S rDNA的V3-V4區(qū)域進(jìn)行測(cè)序，對(duì)比研究連作煙田健株與感染根腐病煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，變形菌門、放線菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門是連作煙田健株和病株根際土壤主要的細(xì)菌優(yōu)勢(shì)種群，相對(duì)豐度累計(jì)總和為89.1%～93.9%，隨連作年限的延長(zhǎng)各優(yōu)勢(shì)種群發(fā)生趨向性變化;隨連作年限的延長(zhǎng)，健株根際土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性呈先增后降趨勢(shì)，病株根際土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性呈降低趨勢(shì)，短期連作（2～4 年）煙田健株和病株根際土壤細(xì)菌群落組成較為相似，與連作8年和撂荒2年以上（CK）土壤樣本的細(xì)菌群落組成差異較大;冗余分析結(jié)果表明，土壤化學(xué)因子與細(xì)菌群落分布關(guān)聯(lián)緊密，其中pH值是影響土壤細(xì)菌群落分布的核心因子，其貢獻(xiàn)度為15.77%。綜上，連作和染病降低了土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性，優(yōu)勢(shì)菌群趨向性演化，有益菌群相對(duì)豐度降低。在生產(chǎn)實(shí)踐中，提高煙田土壤pH值，降低連作年限并及時(shí)清除煙株病殘?bào)w有利于維持土壤微生態(tài)環(huán)境的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：高通量測(cè)序;連作煙田;細(xì)菌群落;冗余分析;根際土壤;多樣性分析

中圖分類號(hào)： S154.36;S154.37文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A

文章編號(hào)：1002-1302（2022）04-0198-07

收稿日期：2021-05-26

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金（編號(hào)：32060445、41807524）;云南省自然科學(xué)基金（編號(hào)：202001AU070114）;廣西中煙工業(yè)有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目（編號(hào)：GXZYCX2019b004）。

作者簡(jiǎn)介：敖金成（1984—），男，云南曲靖人，博士研究生，高級(jí)工程師，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)與病害控制技術(shù)研究。E-mail：89693180@qq.com。

通信作者：李永梅，博士，教授，博士生導(dǎo)師，主要從事植物營(yíng)養(yǎng)與病害控制技術(shù)研究。E-mail：youngmaylee@126.com。

烤煙（Nicotiana tobacum L.）是云南重要的經(jīng)濟(jì)作物，是典型的忌連作作物。受土地資源短缺和其他經(jīng)濟(jì)作物種植面積的擠壓，云南烤煙連作現(xiàn)象十分嚴(yán)重，多個(gè)核心煙區(qū)烤煙連作年限多在10年以上。連作引發(fā)許多土壤問題[1-4]，加上近年來煙葉秸稈就地粉碎還田帶來的弊端[5]，致使連作煙田土傳病害危害、煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)下降等問題持續(xù)加重。煙草病害一直是嚴(yán)重制約世界煙草生產(chǎn)和科研發(fā)展的重要難題[6]。在諸多的土傳病害中，煙草鐮刀菌根腐病是由鐮刀菌屬（Fusarium）病原菌引起的一種典型的土傳病害，常與黑脛病、青枯病、黑根腐病復(fù)合發(fā)生，使得該病具有隱秘性、易混淆、難防治、危害重等特點(diǎn)，近年來全國(guó)各煙區(qū)發(fā)病率呈上升趨勢(shì)。探尋有效防控?zé)煵莞〉姆椒?，是促進(jìn)煙草產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關(guān)鍵。

土壤細(xì)菌是土壤養(yǎng)分循環(huán)重要的驅(qū)動(dòng)者[7]，具有重要的生態(tài)功能[8-9]。連作可以改變根際細(xì)菌的群落結(jié)構(gòu)，降低土壤細(xì)菌物種數(shù)和群落α多樣性[10]。長(zhǎng)期連作嚴(yán)重影響了土壤理化性質(zhì)，進(jìn)而顯著降低了土壤細(xì)菌群落和組成多樣性[11]，并且土壤優(yōu)勢(shì)菌門的相對(duì)豐度和多樣性存在時(shí)空異質(zhì)性[12]，反映了土壤微生態(tài)的復(fù)雜性，易受環(huán)境因子[13-14]、作物類型[15]、施肥[16]等因素的調(diào)控，因而了解土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性對(duì)維持土壤生態(tài)功能具有重要意義。史普酉等研究指出，不同發(fā)病程度煙株根際細(xì)菌群落組成和結(jié)構(gòu)發(fā)生趨向性變化，土壤生物多樣性降低[17]。煙草鐮刀菌根腐病發(fā)病煙株根際真菌群落多樣性顯著降低，病原菌相對(duì)豐度顯著高于健康煙株[18]。鄭元仙等研究也指出，煙株根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)改變及物種多樣性降低是根腐病發(fā)生的重要特征[19]。然而，關(guān)于土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性對(duì)連作條件下煙株感染根腐病的響應(yīng)特征鮮見報(bào)道。鑒于此，本研究以不同連作年限煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤為研究對(duì)象，探索連作條件下健株和病株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性特征，以期為連作煙田煙草根腐病的科學(xué)防治提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 連作土壤采集區(qū)概況

試驗(yàn)點(diǎn)位于云南省紅河州瀘西縣（103°52′26″E，24°40′03″N），地處滇南低山丘陵烤煙區(qū)，地勢(shì)平緩，多數(shù)栽煙區(qū)域海拔在1 100～1 600 m之間，熱量條件優(yōu)越，降水充沛，年均溫為16.0～18.0℃，烤煙大田生育期降水量在1 000.0 mm左右，是云南省典型的清甜香風(fēng)格煙葉核心產(chǎn)區(qū)，植煙歷史悠久。2010—2020年間，試驗(yàn)地區(qū)域年均溫為15.5 ℃，年均降水量為810.0 mm，年均日照時(shí)數(shù)為2 042.0 h，海拔為1 803.0 m。

1.2 樣品采集

試驗(yàn)于2020年7月烤煙成熟期，選取2、4、8 年連作植煙地塊，隨機(jī)取健康（以下簡(jiǎn)稱為“健株”）和感染根腐病煙株（以下簡(jiǎn)稱為“病株”）各4株，去除地表雜物，然后將煙株整株挖起，去除根系外圍土壤，采用抖根法采集根際土[20]，輕輕抖落并收集須根2 mm范圍內(nèi)的土壤。對(duì)照（CK）為同區(qū)域撂荒2年以上未種植烤煙的土壤。每株烤煙根際土為1次重復(fù)，各4次重復(fù)。健株分別編號(hào)為HT2、HT4、HT8，病株分別編號(hào)為ST2、ST4、ST8。試驗(yàn)地塊均為同一農(nóng)戶自己栽種，植煙歷史可考證。供試烤煙品種為云煙87。

1.3 檢測(cè)項(xiàng)目及方法

1.3.1 土壤化學(xué)性狀 取樣后將樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，土壤經(jīng)風(fēng)干、磨細(xì)、過篩后備用。土壤有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量和pH值的測(cè)定參照文獻(xiàn)[21]中的方法。

1.3.2 土壤細(xì)菌高通量測(cè)序 用于高通量測(cè)序的樣本取樣后立即放入冰盒帶回實(shí)驗(yàn)室，于-80 ℃保存?zhèn)溆??；贗llumina高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)分析連作條件下煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的豐度和多樣性。

1.3.2.1 基因組DNA的提取 樣本由廣州基迪奧生物科技有限公司平臺(tái)（https：//www. Omic-smart.com）檢測(cè)。采用HiPure Soil DNA Mini Kits（廣州美基，中國(guó)，cat#3412）土壤DNA提取試劑盒進(jìn)行土壤微生物DNA提取。首先在2 mL 珠管中加入0.25～0.50 g土壤樣品和0.6 mL 緩沖溶液，利用渦旋儀（米歐mix-28+，廣州圍谷潤(rùn)儀器有限公司）充分勻漿裂解，然后70 ℃水浴10 min，并離心收集管壁上的液滴，然后加入200 μL 聚苯乙烯緩沖液 和150 μL 吸收溶液，渦旋混勻20 s，靜置5 min后離心5 min，取上清液至2 mL離心管，加入等體積5′-二磷酸鳥苷二鈉緩沖液，混勻，獲得DNA柱。然后用1%瓊脂糖（Biowest Agarose，西班牙）凝膠電泳（DYY-6C，北京市六一儀器廠）檢測(cè)基因組DNA的完整性及是否發(fā)生蛋白等污染，DNA樣品于 -80 ℃ 保存待用。

1.3.2.2 目的基因擴(kuò)增及Illumina測(cè)序 采用具有條形碼標(biāo)記的引物341F：C C T A C G G G N G G T C W G C A G、806R：G G A C T A C H V G G G T A C T A A T對(duì)細(xì)菌16S rDNA 的V3-V4區(qū)進(jìn)行MiSeq擴(kuò)增子測(cè)序。第1輪擴(kuò)增體系包括：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，25 mmol/L MgSO4 3.0 μL，引物341F（10 μmol/L） 1.5 μL，引物806 R （10 μmol/L） 1.5 μL，KOD酶 1.0 μL，模板X μL（100 ng），用蒸餾水定容至 50 μL。然后利用AMPure XP Beads 進(jìn)行PCR純化，純化后用Qubit 3.0定量。進(jìn)入第二輪擴(kuò)增，擴(kuò)增體系包括：10×Buffer KOD 5 μL，2 mmol/L dNTPs 5.0 μL，25 mmol/L MgSO4 3.0 μL，索引引物（10 μmol/L）1 μL，PCR通用引物（10 μmol/L） 1 μL，KOD酶1 μL，模板 X μL（100 ng），再用蒸餾水定容至 50 μL。使用AMPure XP Beads 對(duì)第二輪擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，用ABI StepOnePlus Real-Time PCR System（Life Technologies，美國(guó)）進(jìn)行定量，根據(jù)Novaseq 6000的樣品要求規(guī)范化操作后，采用PE250模式上機(jī)測(cè)試。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，用IBM Statistics SPSS 19.0進(jìn)行方差分析。利用軟件平臺(tái)Usearch（version 7.0）對(duì)相似度在97%條件下的操作分類單元（OUT）進(jìn)行質(zhì)控拼接和Tag聚類去嵌合體，獲得OTU的豐度和OTU代表序列，生成稀釋曲線，由圖1可知，各樣本的稀釋曲線基本趨于平坦，說明本次測(cè)序數(shù)據(jù)量合理，能夠比較真實(shí)地反映土壤樣本的細(xì)菌群落。利用軟件Mothur（version v.1.30.1）計(jì)算反映群落豐富度的Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)、Ace指數(shù)和反映群落多樣性的Shannon-Wiener指數(shù)、Simpson指數(shù)。然后利用R語言vegan包進(jìn)行群落柱狀圖的統(tǒng)計(jì)和作圖，以及主坐標(biāo)分析（principal coordinate analysis，簡(jiǎn)稱PCoA）、非度量多維尺度分析（nonmetric multidimensional scaling，簡(jiǎn)稱NMDS）、非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，簡(jiǎn)稱UPGMA）分析，利用冗余分析（redundancy analysis，簡(jiǎn)稱RDA）評(píng)價(jià)環(huán)境因子與細(xì)菌群落分布的關(guān)聯(lián)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤的化學(xué)性質(zhì)

由表1可知，不同連作年限煙田健株和病株根際土壤樣本的有機(jī)質(zhì)、堿解氮、速效磷、速效鉀含量及pH值存在顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）差異。與CK相比，健株和病株根際土壤樣本的pH值隨連作年限增加極顯著（P<0.01）降低，有機(jī)質(zhì)和堿解氮含量呈先升后降的趨勢(shì)，速效磷和速效鉀含量呈極顯著（P<0.01）增加的趨勢(shì)。與CK相比，HT2、HT4和HT8樣本的pH值分別下降0.8、0.9、2.5，ST2、ST4和ST8樣本的pH值分別下降0.8、0.7、2.1。除連作8年煙田健株和病株根際土壤樣本的有機(jī)質(zhì)含量均低于CK外，其他處理顯著高于CK或與CK一致?？傮w看，連作2年和連作4年煙田健株和病株根際土壤樣本的土壤養(yǎng)分含量整體一致，而連作8年煙田健株和病株根際土壤樣本的土壤pH值和有機(jī)質(zhì)、堿解氮含量整體較低。健株根際土壤pH值整體低于染病煙株，但速效磷含量均明顯高于染病煙株，短期連作（2～4年）煙田健株根際土壤樣本的速效鉀含量明顯低于病株，連作8年的煙田則以健株稍高。

2.2 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細(xì)菌群落組成分析

在門水平上，不同連作年限煙田健株和病株根際土壤細(xì)菌優(yōu)勢(shì)菌群相對(duì)豐度存在一定差異。由物種分布堆疊圖（圖2）和相對(duì)豐度值（表2）可以看出，變形菌門（Proteobactera）、放線菌門（Actinobacteria）、浮霉菌門（Planctomycetes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）、綠彎菌門（Chloroflexi）是不同連作年限煙田健株和病株根際土壤的6個(gè)優(yōu)勢(shì)菌群，累積相對(duì)豐度總和為89.1%～93.9%。隨連作年限的延長(zhǎng)，HT2、HT4和HT8樣本變形菌門和髕骨細(xì)菌門的相對(duì)豐度呈增加趨勢(shì)，且均大于CK，放線菌門、芽單胞菌門的相對(duì)豐度呈先降后升趨勢(shì)，浮霉菌門、酸桿菌門、擬桿菌門、己科河菌門的相對(duì)豐度呈先升后降趨勢(shì)，綠彎菌門的相對(duì)豐度呈降低趨勢(shì)。ST2、ST4和ST8樣本的變形菌門、放線菌門、髕骨細(xì)菌門的相對(duì)豐度呈增加趨勢(shì)，浮霉菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門、擬桿菌門和己科河菌門的相對(duì)豐度呈降低趨勢(shì)，僅疣微菌門的相對(duì)豐度呈先升后降趨勢(shì)。

2.3 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細(xì)菌群落的α多樣性分析

Sobs指數(shù)是細(xì)菌群落豐富度的實(shí)際觀測(cè)值，Ace指數(shù)和Chao1指數(shù)用于反映細(xì)菌群落豐富度，Shannon-Wiener指數(shù)用于反映群落多樣性。由表3可知，連作煙田健株和病株根際土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性存在差異。HT2、HT4和HT8樣本的Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)及Shannon-Wiener指數(shù)均表現(xiàn)為隨連作年限的增加呈先增后降的趨勢(shì)，說明隨連作年限的延長(zhǎng)，連作煙田健株根際土壤細(xì)菌群落豐富度和多樣性先增后降，其中HT8樣本細(xì)菌群落豐富度和多樣性均明顯小于HT2和HT4樣本。ST2、ST4和ST8樣本的Sobs指數(shù)、Chao1指數(shù)和Ace指數(shù)及Shannon-Wiener指數(shù)均表現(xiàn)為隨連作年限的增加呈降低趨勢(shì)，說明隨連作年限的延長(zhǎng)，煙田病株根際土壤細(xì)菌群落的豐富度和多樣性降低。健株和病株根際土壤樣本間物種覆蓋度均無顯著性差異，均大于0.99，說明樣本測(cè)序飽和度均較高。

2.4 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細(xì)菌群落的β多樣性分析

主成分分析（principal component analysis，簡(jiǎn)稱PCA）和非度量多維尺度分析是基于OTU列表的物種豐度信息反映樣本間群落組成距離關(guān)系的方法。PCA用于研究樣本間的組成距離關(guān)系，NMDS分析可以更好地反映生態(tài)學(xué)數(shù)據(jù)的非線性結(jié)構(gòu)，脅強(qiáng)系數(shù)（stress）越?。ㄐ∮?.1較好），說明模型越可靠。從圖3-a可以看出，第1主成分（PC1）和第2主成分（PC2）對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值為82.18%，且PC1對(duì)樣品差異的貢獻(xiàn)值最高。NMDS分析結(jié)果（圖3-b）顯示，stress為0.050，小于0.1，說明模型可靠性高。圖3-a和圖3-b均表現(xiàn)出短期連作（2～4年）煙田的健株和病株樣本距離較近，群落組成較相似，而與CK、HT8和ST8樣本的距離較遠(yuǎn)，說明群落結(jié)構(gòu)差異較大。進(jìn)一步進(jìn)行Anosim檢驗(yàn)，結(jié)果表明，相同連作年限煙田健株和病株樣本細(xì)菌群落組成無顯著差異，但均與CK樣本有顯著差異（P<0.05）。3種連作年限的煙田健株（HT2、HT4和HT8）樣本、病株（ST2、ST4和ST8）樣本與CK樣本之間，及HT2、HT4和HT8樣本之間，ST2、ST4和ST8樣本之間的細(xì)菌組成均有極顯著差異（P<0.01）。

2.5 連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤理化性質(zhì)對(duì)細(xì)菌群落的影響

為了解土壤理化因子對(duì)連作煙田健株和病株根際土壤微生物群落分布的影響，在屬水平上進(jìn)行冗余分析。從圖4-a可以看出，在屬水平上，RDA的前2個(gè)軸總共解釋了95.60%的群落變化，第1個(gè)軸和第2個(gè)軸分別解釋了85.15%、10.45%的群落變化，說明觀察樣本聚類特征與分組一致。從圖 4-b 和表4可以看出，在門水平上，土壤pH值與變形菌門的相對(duì)豐度呈極顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.505，P<0.01），與酸桿菌門（r=0.578，P<0.01）和綠彎菌門（r=0.581，P<0.01）的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系，與浮霉菌門（r=0.402，P<0.05）和裝甲菌門（r=0.429，P<0.05）的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系，與藍(lán)藻細(xì)菌門的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系（r=-0.417，P<0.05）;土壤有機(jī)質(zhì)含量與擬桿菌門的相對(duì)豐度呈顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.379，P<0.05）;土壤堿解氮含量與細(xì)菌群落的相對(duì)豐度無顯著相關(guān)性;速效磷含量與酸桿菌門（r=-0.395，P<0.05）和綠彎菌門（r=-0.407，P<0.05）的相對(duì)豐度呈顯著負(fù)相關(guān)關(guān)系;土壤速效鉀含量?jī)H與硝化螺旋菌門的相對(duì)豐度呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（r=0.479，P<0.01）。從圖4-c可以看出，在屬水平上，根際土壤有機(jī)質(zhì)、速效磷、速效鉀含量及pH值對(duì)細(xì)菌群落的分布影響以pH值的貢獻(xiàn)度（15.77%）最大，堿解氮和速效鉀含量的貢獻(xiàn)度為負(fù)值，表示對(duì)根際土壤細(xì)菌物種分布無意義。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明，連作煙田健株與感染根腐病煙株根際土壤細(xì)菌群落的相對(duì)豐度及多樣性存在差異。變形菌門、放線菌門、浮霉菌門、酸桿菌門、芽單胞菌門、綠彎菌門為幾種連作煙田土壤健株和病株根際土壤的優(yōu)勢(shì)菌群。研究表明，變形菌門是最為普遍的細(xì)菌門[22]，同時(shí)包含了大量的動(dòng)植物致病菌[23]，其豐度的增加可能引起土壤環(huán)境抗逆性降低，植株發(fā)病率增加。本試驗(yàn)中，隨連作年限的增加，變形菌門的相對(duì)豐度呈明顯增加的趨勢(shì)，且感染根腐病煙株根際土壤變形菌門的相對(duì)豐度明顯高于健株。試驗(yàn)中，除了連作2、4年的健株和連作2年的病株放線菌菌門相對(duì)豐度較低外，其余樣本均較高，且表現(xiàn)出病株大于健株。說明隨連作年限的延長(zhǎng)，土壤變形菌門逐漸演化成優(yōu)勢(shì)菌群。絕大多數(shù)放線菌為腐生菌，但少數(shù)寄生性放線菌則能引起某些動(dòng)植物的病害[24]，其含量的高低可作為土壤健康狀況的評(píng)價(jià)指標(biāo)[25]。隨連作年限的增加，總體上連作煙田健株和病株根煙株根際土壤酸桿菌門、綠彎菌門的相對(duì)豐度呈明顯降低趨勢(shì)，且整體表現(xiàn)為病株下降幅度大于健株。有研究認(rèn)為，土壤細(xì)菌是環(huán)境變化的敏感指標(biāo)，其組成和多樣性與氣溫、降水以及土壤pH值、有機(jī)碳和全氮等含量密切相關(guān)[26]，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)差異可指示土壤環(huán)境的變化[27]。岳思君等研究認(rèn)為，引起硒砂瓜連作障礙的發(fā)生主要因素是隨著連作時(shí)間的增加，放線菌門、綠彎菌門、酸桿菌門、厚壁菌門等有益微生物豐度下降造成的[28]。該研究說明隨連作年限的延長(zhǎng)，土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)趨向性改變，土壤細(xì)菌性病原菌相對(duì)豐度可能增加，而細(xì)菌有益菌群落相對(duì)豐度降低。

有研究表明，土壤中微生物多樣性越高、結(jié)構(gòu)越復(fù)雜，系統(tǒng)的穩(wěn)定性也越高[29]。試驗(yàn)中，烤煙短期連作（2～4年）煙田健株和病株根際土壤細(xì)菌群落豐度和多樣性較高，群落組成較為相近，與撂荒土壤（CK）的距離較遠(yuǎn)，而連作8年煙田健株（ST8）和病株（ST8）根際土壤細(xì)菌群落相對(duì)豐度和多樣性均顯著減小。說明隨連作年限的延長(zhǎng)，土壤微生態(tài)穩(wěn)定性降低，進(jìn)而影響土壤系統(tǒng)抗性。土傳病害的發(fā)生與土壤環(huán)境密切相關(guān)[30-31]，土壤微生物與植物健康的相互關(guān)系研究備受關(guān)注。土壤微生物尤其是根際微生物的組成、結(jié)構(gòu)、多樣性和生態(tài)網(wǎng)絡(luò)關(guān)系與植物土傳病害的發(fā)生密切相關(guān)[32-35]。汪洋等綜述了農(nóng)田管理措施對(duì)土壤微生物的影響，認(rèn)為提高有機(jī)肥和磷肥的施用比例有利于土壤中微生物豐富度的提高和微生物量碳的積累[36]。納小凡等研究認(rèn)為，因?yàn)橥寥纏H值是影響微生物群落結(jié)構(gòu)組成最重要的因素之一[10]，本試驗(yàn)中根際土壤pH值對(duì)健株和病株根際土壤細(xì)菌群落分布影響最大，說明pH值是影響細(xì)菌群落分布及豐富度的核心環(huán)境因子。本研究的供試土壤隨連作年限的延長(zhǎng)，pH值明顯降低。因而針對(duì)連作植煙地塊，生產(chǎn)中可通過撒施生石灰，增施有機(jī)肥、生物質(zhì)炭、過磷酸鈣等方式以提高連作土壤pH值，進(jìn)而改善連作土壤微生態(tài)環(huán)境。

綜上所述，本研究利用Illumina高通量測(cè)序技術(shù)探明了連作煙田健株和感染根腐病煙株根際土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的變化，為連作煙田烤煙根腐病的防治及土壤改良提供了借鑒。然而本研究只關(guān)注了連作煙田健株和病株根際細(xì)菌群落的豐富度、多樣性及其細(xì)菌群落與連作土壤理化因子的關(guān)聯(lián)性，未探明根腐病發(fā)病與相關(guān)細(xì)菌菌群的相關(guān)性，以及真菌群落豐富度、多樣性的變化情況，在今后的研究中將加以完善。

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