于 睿,高洪蓮,李欣蒙,劉奇奇,張 磊

0引言

在過去的30a里，近視的發(fā)病率顯著增加，預計到2050年，全球?qū)⒂幸话氲娜丝诎l(fā)展為近視[1]。屈光手術有著很大的臨床需求，而準分子激光角膜切削術(photorefractive keratectomy，PRK)經(jīng)過不斷地改良和完善，以其安全高效、術后角膜生物力學穩(wěn)定和無角膜瓣并發(fā)癥風險等優(yōu)勢目前仍在廣泛應用[2-4]。角膜上皮下霧狀混濁(haze)是PRK術后最常見的并發(fā)癥，會引起屈光回退、眩光和對比敏感度下降等問題。目前臨床中常用于控制haze的藥物包括糖皮質(zhì)激素、抗代謝藥物、非甾體類抗炎藥等，上述藥物主要通過抗炎與抗凋亡途徑來抑制haze，但存在繼發(fā)激素性高眼壓、淺層點狀角膜炎和角膜內(nèi)皮毒性損害等不良反應的可能[5]。haze是由于基質(zhì)重建過程中膠原纖維生成與降解的失衡，引起膠原纖維排列紊亂導致的，目前有研究表明調(diào)節(jié)自噬活性可以抑制組織的纖維化程度[6-8]。雷帕霉素(rapamycin)屬于大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，也是一種自噬激活劑，有研究發(fā)現(xiàn)雷帕霉素可以抑制mTOR通路，增強細胞自噬活性，進而抑制腎臟、心肌等組織纖維化程度[9-12]。本研究擬通過建立兔眼PRK手術模型，術后給予雷帕霉素滴眼液治療，觀察其對角膜haze形成的影響，并初步分析自噬因子及相關凋亡基因的表達情況。

1材料和方法

1.1材料實驗動物：健康普通級新西蘭大白兔80只，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5kg，購于濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心，入組前篩查排除無眼部疾病。實驗動物的喂養(yǎng)和使用遵循濱州醫(yī)學院動物管理委員會相關規(guī)定。本研究方案經(jīng)濱州醫(yī)學院附屬醫(yī)院倫理委員會審批。主要試劑：DMSO(北京索萊寶生物科技有限公司)；雷帕霉素(MedChemExpress公司)；小鼠增強聚合物法檢測系統(tǒng)(北京中杉金橋生物科技有限公司)；鼠源性轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶-2(MMP-2)、α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)抗體(英國Abcam公司)；DAB顯色試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；動物組織總RNA提取試劑盒(天根生物科技有限公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒，熒光定量PCR試劑盒(美國Roche公司)。主要儀器：準分子激光儀VISX STAR S4(美國AMO公司)；裂隙燈顯微鏡(瑞士Haag-Streit公司，BQ-900)。

1.2方法

1.2.1兔PRK模型的制作和分組將80只新西蘭大白兔采用隨機數(shù)字表法分為正常對照組、單純手術組、14μmol/L 二甲基亞砜(DMSO)組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組,各16只，均取右眼為實驗眼。單純手術組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組術前3d給予質(zhì)量分數(shù)0.3%氧氟沙星眼膏點眼預防感染，術前耳緣靜脈注射質(zhì)量分數(shù)3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)進行全身麻醉，質(zhì)量分數(shù)0.4%鹽酸奧布卡因滴眼液行眼表麻醉，準分子激光系統(tǒng)下行PRK手術；激光參數(shù)：準分子激光治療性角膜切削術(phototherapeutic keratectomy，PTK)模式去除角膜上皮，能量設置160mJ/cm2，切削深度120μm，光學區(qū)切削直徑6.0mm。術后平衡鹽水沖洗，配戴軟性角膜接觸鏡，術后每天3次質(zhì)量分數(shù)0.3%氧氟沙星眼膏涂眼，預防感染。

1.2.2雷帕霉素滴眼液的配制及給藥方式DMSO助溶雷帕霉素，配制為100mmol/L的雷帕霉素母液，無菌操作下用生理鹽水稀釋為50μmol/L和100μmol/L的雷帕霉素滴眼液，DMSO終濃度為0.1%。14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組分別應用14μmol/L DMSO、50μmol/L雷帕霉素和100μmol/L雷帕霉素點眼，每天3次，每次1滴，連續(xù)給藥7d，單純手術組只行PRK手術，正常對照組不做任何處理。

1.2.3術后角膜上皮愈合時間及haze分級術后每日觀察實驗眼有無感染發(fā)生以及角膜上皮的愈合情況，記錄并進行比較。術后1、4wk進行haze分級。采用Fantes的分級標準：角膜透明為0級；裂隙燈下仔細觀察可見角膜細微混濁為1級；易觀察到輕度混濁為2級；中度混濁，影響觀察虹膜結構為3級；重度混濁，遮擋眼內(nèi)結構為4級[13]。

1.2.4標本采集及石蠟切片制作術后1、4wk各組分別任意選取8只新西蘭大白兔，采用空氣栓塞法處死，處死后迅速取實驗眼角膜，其中4只角膜放入質(zhì)量分數(shù)4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、透明和石蠟包埋后，制成4μm石蠟切片；另外4只放入-80℃冰箱凍存進行PCR。

1.2.5免疫組化檢測α-SMA和TGF-β1及MMP-2的表達石蠟切片烤片，脫蠟，高壓抗原修復，封閉液封閉30min，一抗分別滴加小鼠抗兔α-SMA(1∶100)、TGF-β1(1∶50)、MMP-2(1∶100)，4℃孵育過夜，滴加反應增強液，滴加增強酶標山羊抗小鼠IgG聚合物，DAB顯色(出現(xiàn)棕黃色即為陽性)，蘇木素復染1min，經(jīng)脫水、透明后用中性樹膠封片，光學顯微鏡下觀察并拍照。光學顯微鏡下觀察各標本，400倍鏡下每張切片任意選取3個視野，通過Image Pro Plus 6.0圖像處理分析軟件分析各組染色區(qū)的吸光度(A)值。

1.2.6RealTimePCR法檢測ATG5和ATG12與Bcl-2及Caspase3的mRNA表達水平將角膜置于冰上研磨，用動物組織總RNA提取試劑盒提取總RNA，紫外分光光度計測定提取RNA的濃度；根據(jù)NCBI提供的基因序列，由Takara合成引物序列(表1)。用反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA；以GAPDH為內(nèi)參。按2×SYBR Green qPCR Mix說明書設置PCR反應條件，記錄CT值，使用2-ΔΔCT法進行分析。

表1 引物序列

2結果

2.1各組兔眼術后角膜上皮愈合時間的比較術后每天用手持裂隙燈觀察兔角膜愈合情況，各組角膜上皮均在術后3～4d內(nèi)愈合。單純手術組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組術后角膜上皮愈合時間分別為3.44±0.51、3.50±0.52、3.38±0.50、

3.25±0.45d，各組兔眼術后角膜上皮愈合時間比較，差異無統(tǒng)計學意義(F=0.745，P=0.530)。

2.2各組兔眼術后haze分級比較正常對照組無haze形成。單純手術組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組均在術后1wk出現(xiàn)不同程度haze，術后4wk時haze癥狀最重。術后1、4wk，單純手術組和14μmol/L DMSO組haze癥狀均較嚴重，其次為50μmol/L雷帕霉素組，100μmol/L雷帕霉素組haze癥狀較其他組明顯減輕(圖1)。各組不同時間點haze分級的比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組haze分級較單純手術組和14μmol/L DMSO組明顯降低，100μmol/L雷帕霉素組haze分級較50μmol/L雷帕霉素組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；單純手術組和14μmol/L DMSO組haze分級比較，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表2。

圖1 裂隙燈顯微鏡觀察各組兔眼不同時間點haze情況 A：1wk后正常對照組；B：術后1wk單純手術組；C：術后1wk 14μmol/L DMSO組；D：術后1wk 50μmol/L雷帕霉素組；E：術后1wk 100μmol/L雷帕霉素組；F：4wk后正常對照組；G：術后4wk單純手術組；H：術后4wk 14μmol/L DMSO組；I：術后4wk 50μmol/L雷帕霉素組；J：術后4wk 100μmol/L雷帕霉素組。

表2 PRK術后不同時間點各組haze分級比較 級)

2.3各組兔角膜TGF-β1和MMP-2及α-SMA的表達正常對照組角膜中表達微量MMP-2，無α-SMA和TGF-β1表達。PRK術后1wk，各組均出現(xiàn)TGF-β1、MMP-2、α-SMA表達，在50、100μmol/L雷帕霉素組中表達呈弱陽性，在單純手術組和14μmol/L DMSO組中呈中等陽性；PRK術后4wk，各組TGF-β1、MMP-2、α-SMA表達均增強(圖2～4)。各組兔眼不同時間點TGF-β1、MMP-2、α-SMA 3種因子平均A值比較，差異均有統(tǒng)計學意義(均P<0.01)，其中術后各時間點50、100μmol/L雷帕霉素組TGF-β1、MMP-2、α-SMA 3種因子平均A值均較單純手術組和14μmol/L DMSO組明顯降低；100μmol/L雷帕霉素組TGF-β1、MMP-2、α-SMA 3種因子平均A值較50μmol/L雷帕霉素組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；單純手術組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組MMP-2因子平均A值較正常對照組升高，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；單純手術組和14μmol/L DMSO組TGF-β1、α-SMA 平均A值比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3、4。

表3 各組兔眼術后不同時間點角膜中TGF-β1和α-SMA表達的比較

圖2 免疫組織化學法檢測角膜中TGF-β1情況(DAB) A：1wk后正常對照組；B：術后1wk單純手術組；C：術后1wk 14μmol/L DMSO組；D：術后1wk 50μmol/L雷帕霉素組；E：術后1wk 100μmol/L雷帕霉素組；F：4wk后正常對照組；G：術后4wk單純手術組；H：術后4wk 14μmol/L DMSO組；I：術后4wk 50μmol/L雷帕霉素組；J：術后4wk 100μmol/L雷帕霉素組。

圖3 免疫組織化學法檢測角膜中MMP-2情況(DAB) A：1wk后正常對照組；B：術后1wk單純手術組；C：術后1wk 14μmol/L DMSO組；D：術后1wk 50μmol/L雷帕霉素組；E：術后1wk 100μmol/L雷帕霉素組；F：4wk后正常對照組；G：術后4wk單純手術組；H：術后4wk 14μmol/L DMSO組；I：術后4wk 50μmol/L雷帕霉素組；J：術后4wk 100μmol/L雷帕霉素組。

2.4RT-PCR檢測結果各組不同時間點ATG5、ATG12、Bcl-2和Caspase3 mRNA相對表達量的比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，其中單純手術組、14μmol/L DMSO組、50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組ATG5、ATG12、Caspase3 mRNA相對表達量較正常對照組升高，Bcl-2 mRNA相對表達量較正常對照組降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組ATG5、ATG12、Bcl-2 mRNA相對表達量較單純手術組和14μmol/L DMSO組明顯升高，Caspase3 mRNA相對表達量較單純手術組和14μmol/L DMSO組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；100μmol/L雷帕霉素組ATG5、ATG12、Bcl-2 mRNA相對表達量較50μmol/L雷帕霉素組明顯升高，Caspase3 mRNA相對表達量較50μmol/L雷帕霉素組明顯降低，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；單純手術組和14μmol/L DMSO組ATG5、ATG12、Bcl-2和Caspase3 mRNA相對表達量比較，差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表5。

表5 各組不同時間點ATG5、ATG12、Bcl-2、Caspase3 mRNA相對表達量

圖4 免疫組織化學法檢測角膜中α-SMA情況(DAB) A：1wk后正常對照組；B：術后1wk單純手術組；C：術后1wk 14μmol/L DMSO組；D：術后1wk 50μmol/L雷帕霉素組；E：術后1wk 100μmol/L雷帕霉素組；F：4wk后正常對照組；G：術后4wk單純手術組；H：術后4wk 14μmol/L DMSO組；I：術后4wk 50μmol/L雷帕霉素組；J：術后4wk 100μmol/L雷帕霉素組。

表4 各組兔眼術后不同時間點角膜中MMP-2表達的比較

3討論

PRK后haze形成的過程就是一個角膜創(chuàng)傷過度愈合的過程，這一過程開始于角膜壞死細胞的清除[14-15]。基質(zhì)損傷后，細胞因子的釋放誘導角膜基質(zhì)細胞發(fā)生凋亡，并刺激鄰近細胞增殖和遷移[16]。角膜基質(zhì)細胞在TGF-β1等因子作用下轉(zhuǎn)化為角膜成纖維細胞，分化為角膜肌成纖維細胞，TGF-β1是調(diào)控分化的關鍵因子。肌成纖維細胞可特征性地表達α-SMA，導致膠原纖維排列紊亂。MMPs是Ⅳ型膠原蛋白水解酶，能降解基質(zhì)中的主要骨架。重建基質(zhì)過程中產(chǎn)生的細胞外基質(zhì)(ECM)可以促進肌成纖維細胞的生成，產(chǎn)生粗大膠原纖維，這種降解與生成的失衡導致膠原纖維排列紊亂，從而形成了haze[4,17]。Milani等[18]研究表明應用雷帕霉素后可以抑制α-SMA和TGF-β1的表達；在本研究中發(fā)現(xiàn)，PRK術后每日裂隙燈顯微鏡下觀察50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組haze嚴重程度較其他手術組明顯減輕，術后1、4wk TGF-β1、MMP-2、α-SMA的表達與各組haze嚴重程度相同，說明術后應用雷帕霉素可以減輕TGF-β1、MMP-2、α-SMA的表達，抑制haze的形成。

自噬(autophagy)是一種通過溶酶體對細胞質(zhì)蛋白和細胞器進行精心安排、自我調(diào)節(jié)的細胞內(nèi)降解機制，既往許多研究表明自噬對細胞的正常穩(wěn)態(tài)和健康功能至關重要[19]。自噬是由兩大類信號分子調(diào)控，包括mTOR依賴通路和非mTOR依賴通路，其中前者是主要通路。mTOR是高度保守的Ser/Thr蛋白激酶復合物，調(diào)控細胞生長、存活和代謝。此外，mTOR可以促進蛋白質(zhì)合成[20]，抑制蛋白質(zhì)分解代謝，并通過調(diào)節(jié)自噬和凋亡水平[21]來促進細胞生長發(fā)育過程。參與自噬的基因被稱為自噬相關基因(ATGs)，目前已鑒定出12個ATGs，ATGs的表達水平可以反映自噬的活性,并通過ATG12～ATG5和ATG8(LC3)-PE(磷脂酰乙醇胺)系統(tǒng)[22]調(diào)控自噬體的形成。雷帕霉素可以與mTOR受體結合，抑制mTOR發(fā)揮作用，是一種典型的mTOR通路抑制劑，也是自噬激活劑。Lin等[23]研究表明應用雷帕霉素后可以通過誘導自噬去降低纖維化水平；在本研究中發(fā)現(xiàn)，50μmol/L雷帕霉素組和100μmol/L雷帕霉素組的ATG5和ATG12 mRNA相對表達量較單純手術組和14μmol/L DMSO組明顯上調(diào)，提示自噬增強，且角膜纖維化程度較單純手術組和14μmol/L DMSO組明顯減輕。細胞凋亡是程序性的細胞死亡，是消除功能失調(diào)或受損細胞的生理過程[24]。Caspase家族是調(diào)節(jié)細胞凋亡的關鍵因子，它的級聯(lián)激活誘導細胞凋亡，而Bcl-2調(diào)控Caspase的激活。Lin等[23]研究表明應用雷帕霉素后可以降低細胞凋亡水平；在本研究中發(fā)現(xiàn)，50、100μmol/L雷帕霉素組的Bcl-2 mRNA的相對表達量較單純手術組和14μmol/L DMSO組明顯上調(diào)，Caspase3 mRNA的相對表達量較單純手術組和14μmol/L DMSO組明顯下調(diào)，提示凋亡水平受到抑制，且角膜纖維化程度較單純手術組和14μmol/L DMSO組明顯減輕。在本研究結果中發(fā)現(xiàn)100μmol/L雷帕霉素組自噬活性高于50μmol/L雷帕霉素組，且對haze的抑制程度最強，提示雷帕霉素對PRK術后haze的抑制程度可能存在濃度依賴性。

正常情況下角膜組織中的細胞自噬和凋亡水平處于動態(tài)平衡的狀態(tài)，當受到創(chuàng)傷或感染時，不同信號調(diào)節(jié)通路可能通過激活或抑制自噬來維持細胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[25]。本研究結果顯示，兔眼PRK術后應用雷帕霉素，自噬水平增加，凋亡水平受到抑制，haze形成也受到抑制，提示雷帕霉素可能通過調(diào)節(jié)自噬活性來抑制haze的形成。但是，雷帕霉素的給藥濃度界限需要進一步的實驗進行明確，我們會在接下來的實驗中進行進一步研究。