李萌,平鍵,3*,徐列明,3

(1.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬曙光醫(yī)院,上海 201203;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)肝病研究所,上海 201203;3.肝腎疾病病證教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,上海 201203)

原發(fā)性肝癌是我國最常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤之一,不僅嚴(yán)重威脅人民生命健康,也為醫(yī)療資源帶來重大負(fù)擔(dān)。據(jù)統(tǒng)計(jì),肝癌在2020年全球新發(fā)癌癥疾病譜中排名第七位,在癌癥致死人數(shù)中占第三位[1]。原發(fā)性肝癌包括兩種主要的組織學(xué)類型:肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)和肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma,ICC),其中ICC約占原發(fā)性肝癌的15%[2-3]。研究肝癌發(fā)病的機(jī)制既是重點(diǎn)也是難點(diǎn),而選擇適宜的原發(fā)性肝癌動(dòng)物模型則是肝癌機(jī)制研究的必要條件。

Mdr2(multidrug resistance protein2,Mdr2)基因,又名ATP-結(jié)合盒B亞家族成員4(ATP-binding cassette subfamily B member 4,Abcb4),其編碼的Mdr2蛋白作為一種脂質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白,能夠?qū)⒛懼辛字闹饕煞帧字Ｄ憠A(phosphatidylcholine,PC)從肝毛細(xì)膽管膜的內(nèi)側(cè)轉(zhuǎn)移到外側(cè)[2]。小鼠Mdr2基因敲除后,PC無法通過Mdr2蛋白被分泌到膽汁中,從而造成膽汁中磷脂的缺乏[4]。磷脂缺乏時(shí),膽鹽和膽固醇無法與之形成混合膠束,造成膽鹽游離,引起膽管細(xì)胞損傷并導(dǎo)致膽汁淤積[4-5]。

文獻(xiàn)報(bào)道顯示,小鼠Mdr2基因敲除后表現(xiàn)為肝內(nèi)外膽管的狹窄和狹窄所致的節(jié)段性擴(kuò)張、“洋蔥皮樣”膽管周圍纖維化和膽管局部性增生,并且隨時(shí)間推進(jìn),逐漸發(fā)展為肝纖維化、肝硬化,甚至肝癌[6]。因其肝形態(tài)學(xué)變化與人類原發(fā)性硬化性膽管炎(primary sclerosing cholangitis,PSC)相似,Mdr2-/-小鼠也是目前最常用的PSC轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型[7]。已有學(xué)者使用Mdr2-/-小鼠進(jìn)行肝癌機(jī)制研究,但不同遺傳背景的Mdr2-/-小鼠肝癌發(fā)生時(shí)間存在一定差異。為此,本文觀察了C57BL/6背景Mdr2-/-小鼠原發(fā)性肝癌的發(fā)生時(shí)間及發(fā)生率,并對(duì)其組織學(xué)類型進(jìn)行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

9只SPF級(jí)Mdr2基因敲除小鼠C57BL/6-Abcb4tm1,包括雌6只、雄3只,(11.3 ± 4.2)周齡,約22 g。同周齡及體重的SPF級(jí)野生型小鼠C57BL/6野生型小鼠5只(雌3只,雄2只)亦購自蘇州賽業(yè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司【SCXK(蘇)2018-0003】。小鼠飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SYXK(滬)2020-0009】,普通飼料飲食,自由飲水,相對(duì)濕度(55 ± 5)%,溫度25℃,光照遵循晝夜節(jié)律。本實(shí)驗(yàn)通過上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(PZSHUTCM190524006),并且嚴(yán)格遵守實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用的3R原則。

由蘇州賽業(yè)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司采用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建并采用PCR和產(chǎn)物測(cè)序進(jìn)行鑒定。Abcb4基因位于小鼠第5號(hào)染色體上(NCBI參考序列:NM_008830),共鑒定出28個(gè)外顯子,選擇第3 ~ 4外顯子作為目標(biāo)位點(diǎn),設(shè)計(jì)gRNA(gRNA1∶5’-TACCAAGGGCGGTACCTTCAAGG-3’;gRNA2∶5’-GCTCCTTACCACAATGGTACTGG-3’)將此段基因進(jìn)行剪切(見圖1A)。產(chǎn)生的小鼠進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗(yàn)證(引物F2∶5’-CTTTGCAGCTAAATA AAGTGGGAC-3’,引物R1∶5’-TCCACCCTAGACC CTTATTGTCTC-3’),然后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,分析測(cè)序結(jié)果,確認(rèn)基因型(見圖1B)。通過雜合子互配進(jìn)行擴(kuò)增繁殖,并采用PCR(引物F1∶5’-TGTCATCTGGCAATTTAGGCTG-3’,引物R1∶5’-TCCACCCTAGACCCTTATTGTCTC-3’,612 bp;引物F2∶5’-CTTTGCAGCTAAATAAAGTGGGAC-3’,引物R1∶5’-TCCACCCTAGACCCTTATTGTCTC-3’,652 bp;純合子小鼠僅在612 bp處出現(xiàn)條帶)篩選出純合子小鼠用于實(shí)驗(yàn)(見圖1C),其反應(yīng)條件為:94℃ 3 min,(94℃ 30 s,60℃ 35 s,72℃ 35 s)× 35循環(huán),72℃ 5 min。

圖1 Mdr2-/-小鼠構(gòu)建原理與鑒定Note. A. gRNA cleaves the exon 3 ~ 4 region of Mdr2 gene. B. Sequencing showed that the 4751 bp sequence in the target region had been knocked out. C. PCR identifies mice as homozygous. 30, 31. Mouse number. M. Marker. WT. Wild type control. Water. Water control.Figure 1 Construction principle and identification of Mdr2-/- mice

1.1.2 主要試劑與儀器

丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(laninne aminotransferase,ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase,AST)檢測(cè)試劑盒,均為南京建成科技有限公司產(chǎn)品;甲胎蛋白(alpha fetal protein,AFP)檢測(cè)試劑盒為酶聯(lián)生物公司產(chǎn)品;細(xì)胞角蛋白7(cytokeratin-7,CK-7)I抗購自Abcam公司;細(xì)胞角蛋白19(cytokeratin-19,CK-19)I抗購自proteintech公司;通用二步法試劑盒、DAB顯色試劑盒,均購自中杉金橋公司;山羊血清為上海碧云天生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。LEICA ASP300自動(dòng)脫水機(jī)、LEICA EG1160石蠟包埋機(jī)、轉(zhuǎn)輪切片機(jī)RM2035、HI1220烤片機(jī)、均為德國Leica公司產(chǎn)品。M5多功能酶標(biāo)儀,美國Molecular Devices公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 血清采集及肝大體觀察

小鼠飼養(yǎng)65周后,以20%烏拉坦腹腔注射麻醉,腹主動(dòng)脈采血,室溫靜置1 h,以4℃、3000 r/min離心15 min并收取血清。摘取肝后觀察其腫瘤發(fā)生情況并拍照,留取約0.5 × 0.5 × 0.3 cm3大小肝組織、腫瘤及腫瘤旁組織標(biāo)本,予10%甲醛固定。

1.2.2 血清ALT、AST檢測(cè)

按照試劑盒說明檢測(cè)血清ALT、AST。

1.2.3 血清AFP檢測(cè)

采用ELISA法檢測(cè)小鼠血清AFP。按照說明書每樣本孔加入血清50 μL,同時(shí)設(shè)標(biāo)準(zhǔn)品孔、空白孔。各孔中加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的檢測(cè)抗體工作液100 μL,37℃孵育60 min,棄去液體,每孔加入350 μL洗滌液,靜置1 min后吸棄,重復(fù)5次。每孔再加入底物A、B液50 μL,37℃避光孵育15 min后加入50 μL終止液,于450 nm波長處測(cè)定OD值并計(jì)算各樣本濃度值。

1.2.4 肝組織病理學(xué)觀察

將留取的肝組織標(biāo)本10%甲醛固定48 h后逐級(jí)脫水、石蠟包埋,切取4 μm切片。石蠟切片脫蠟至水后進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)染色、天狼猩紅染色并在光學(xué)顯微鏡下觀察照像。

免疫組化染色:將石蠟切片脫蠟至水后置入檸檬酸鹽修復(fù)液(pH = 6.0)中沸煮30 min進(jìn)行抗原修復(fù),內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑孵育10 min、10%山羊血清封閉0.5 h。分別滴加CK-7(1 : 8000)或CK-19(1 : 1000)一抗過夜,洗片后,滴加山羊抗小鼠/兔二抗,孵育0.5 h,洗片后,加入DAB顯色液顯色,以蘇木素染色液復(fù)染后封片觀察。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 兩組小鼠肝大體觀察比較

小鼠飼養(yǎng)65周后取其肝進(jìn)行觀察。正常組小鼠肝形態(tài)均正常,色澤紅潤,質(zhì)地柔軟,表面光滑無腫塊。9只Mdr2-/-小鼠肝表面均可見腫瘤結(jié)節(jié),數(shù)量不等,形態(tài)不一,其余肝組織質(zhì)地柔韌,各肝葉間偶有黏連(見圖2)。

圖2 Mdr2-/-小鼠肝腫瘤形態(tài)Figure 2 Morphology of liver tumors in Mdr2-/- mice

2.2 兩組小鼠肝組織HE及天狼猩紅染色觀察比較

肝組織HE染色顯示:野生型小鼠肝小葉結(jié)構(gòu)清晰,肝細(xì)胞索由中央靜脈向四周呈放射狀排列,無變性壞死,肝竇未見狹窄或擴(kuò)張。Mdr2-/-小鼠肝癌旁組織HE染色顯示,肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂,匯管區(qū)明顯擴(kuò)大,可見淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞等炎性細(xì)胞浸潤。肝腫瘤組織HE染色顯示,腫瘤細(xì)胞大小不一,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,排列結(jié)構(gòu)無序,細(xì)胞核形態(tài)多樣或消失(見圖3)。

天狼猩紅染色觀察:野生型小鼠僅在匯管區(qū)和中央靜脈壁見少量膠原纖維。Mdr2-/-小鼠肝癌旁組織內(nèi)則膠原增生明顯,匯管區(qū)有大量膠原纖維形成并向小葉內(nèi)伸展;肝腫瘤組織天狼猩紅染色顯示,肝腫瘤內(nèi)部無明顯膠原纖維,而在腫瘤邊緣有明顯的膠原組織包繞(見圖3)。

2.3 兩組小鼠血清ALT、AST、AFP水平比較

與野生型小鼠相比,Mdr2-/-小鼠的血清ALT和AST活性均顯著升高(P< 0.01,見表1)。ELISA法檢測(cè)兩組小鼠血清AFP水平,結(jié)果顯示Mdr2-/-小鼠血清AFP水平較野生型小鼠顯著升高(P< 0.01,見表1)。

表1 兩組小鼠血清ALT、AST、AFP水平( ± s)Table 1 Serum ALT、AST、AFP levels of two groups of mice( s)

表1 兩組小鼠血清ALT、AST、AFP水平( ± s)Table 1 Serum ALT、AST、AFP levels of two groups of mice( s)

注:與正常組比較,**P < 0.01。Note. Compared with the normal group,**P < 0.01.

2.4 兩組小鼠肝組織CK-7、CK-19染色觀察比較

免疫組化結(jié)果顯示正常組CK-7、CK-19陽性細(xì)胞多分布于匯管區(qū),形態(tài)規(guī)則呈小管狀,提示膽管細(xì)胞排列規(guī)則,未見膽管增生或缺失。Mdr2-/-小鼠肝癌旁組織CK-7、CK-19陽性細(xì)胞數(shù)量明顯增加,且多聚集于匯管區(qū),有大量結(jié)締組織包繞,提示Mdr2-/-小鼠肝有明顯的膽管增生。而在腫瘤組織中,多數(shù)樣本中均未見CK-7、CK-19陽性細(xì)胞,個(gè)別樣本中有散在的CK-7、CK-19陽性細(xì)胞單個(gè)或小管樣分布,但染色面積均未達(dá)到5%(見圖4)。結(jié)合鏡下觀察及免疫組化染色結(jié)果,所有樣本均被判斷為原發(fā)性肝細(xì)胞癌。

圖4 兩組小鼠肝CK-7、CK-19染色結(jié)果對(duì)比(×100)Figure 4 Comparison of CK-7 and CK-19 staining results in the liver of two groups of mice (×100)

3 討論

目前常見的小鼠原發(fā)性肝癌造模方法有化學(xué)誘導(dǎo)法、腫瘤移植法以及采用基因修飾小鼠等。其中化學(xué)誘導(dǎo)法多采用硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)或二乙基亞硝胺(diethylnitrosamine,DEN)等化學(xué)藥物長期給藥,其建立小鼠原發(fā)性肝癌模型的時(shí)長多為6 ~ 12個(gè)月,誘發(fā)小鼠肝癌的成功率較高[8-9]。但高劑量染毒存在動(dòng)物死亡率較高的風(fēng)險(xiǎn),故在染毒劑量、方法和時(shí)長等方面還需不斷優(yōu)化,尚未形成較統(tǒng)一的造模方案。腫瘤移植法通常將腫瘤組織或細(xì)胞株移植到裸鼠皮下或肝,使其成為荷瘤動(dòng)物模型,其優(yōu)點(diǎn)是成瘤時(shí)間快、造模周期短、易于觀測(cè)。但遺憾的是其無法模擬人類腫瘤的形成過程中組織學(xué)及微環(huán)境的自然癌變特征[10]。在本實(shí)驗(yàn)中,我們構(gòu)建了C57BL/6.Mdr2基因敲除小鼠并觀察其自發(fā)形成肝腫瘤情況。所觀察的9只Mdr2-/-小鼠均自發(fā)形成肝腫瘤,觀察期間未見小鼠死亡,且正常飲食無需染毒,避免了實(shí)驗(yàn)操作誤差及接觸有毒化學(xué)品的風(fēng)險(xiǎn)。并且,該小鼠腫瘤的形成機(jī)制可能與肝細(xì)胞持續(xù)存在慢性損傷和炎癥相關(guān),經(jīng)過長期發(fā)展最終出現(xiàn)肝癌,此過程無需人為干預(yù),與腫瘤發(fā)生的自然特征更為貼近。伴隨基因編輯技術(shù)的不斷進(jìn)步,基于基因修飾造成肝癌的動(dòng)物模型已逐漸被重視和采用。例如Kim等[11]建立的HBV相關(guān)的轉(zhuǎn)基因肝癌小鼠模型,HBx基因轉(zhuǎn)入CD1小鼠后,小鼠在8 ~ 10月齡時(shí)即出現(xiàn)肝腫瘤結(jié)節(jié),并在11 ~ 15個(gè)月時(shí)大多數(shù)雄性小鼠將死于肝透明細(xì)胞癌。而Engelholm等[12]則利用CRISPR/Cas9技術(shù)發(fā)現(xiàn)Dnajb1-Prkaca基因融合足以誘導(dǎo)一種多發(fā)于兒童的肝癌——纖維層狀肝細(xì)胞癌(fibrolamellar hepatocellular carcinoma,FL-HCC)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Mdr2-/-小鼠在連續(xù)飼養(yǎng)65周后均發(fā)生了肝腫瘤,此時(shí)小鼠的平均月齡為17.5個(gè)月,其腫瘤表型為肝細(xì)胞癌。

細(xì)胞角蛋白(cytokeratin,CK)主要分布于上皮細(xì)胞,是角質(zhì)細(xì)胞中的主要骨架蛋白。在正常肝中,膽管上皮細(xì)胞主要表達(dá)CK-7和CK-19,而正常的成熟肝細(xì)胞則不表達(dá),故而CK-7和CK-19對(duì)膽管上皮細(xì)胞和肝內(nèi)膽管細(xì)胞癌具有特異性染色[13]。本實(shí)驗(yàn)中小鼠肝表現(xiàn)出了膽管細(xì)胞增生、管腔寬大畸形等膽管病變,但并未在腫瘤樣本中發(fā)現(xiàn)膽管細(xì)胞癌性病變,結(jié)合組織病理學(xué)觀察及CK-7和CK-19免疫組化結(jié)果,判斷該小鼠自發(fā)腫瘤為肝細(xì)胞癌。結(jié)果表明Mdr2-/-小鼠適宜作為肝細(xì)胞癌的研究模型。

盡管Mdr2-/-小鼠肝癌模型具有造模簡便、成瘤率高及死亡率低的特點(diǎn),但其缺點(diǎn)在于造模周期較長。據(jù)報(bào)道,基于BALB/c背景的Mdr2敲除小鼠在7月齡時(shí)即可觀測(cè)到肝癌發(fā)生,其組織學(xué)類型為肝細(xì)胞癌[6]。本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建了C57BL/6小鼠背景的Mdr2敲除小鼠,在飼養(yǎng)55周時(shí)處死的小鼠未觀察到肝腫塊,而在65周觀察到本實(shí)驗(yàn)9只小鼠全部有肝腫塊形成,可能與不同品系小鼠的差異有關(guān)。此外,已有研究表明,FVB背景的Mdr2-/-雌性小鼠較雄性疾病進(jìn)展更快,表現(xiàn)出更嚴(yán)重的膽汁淤積和肝纖維化癥狀[14-15]。在本實(shí)驗(yàn)中雌性和雄性小鼠腫瘤最早發(fā)現(xiàn)時(shí)間均為71周齡,且血清AFP水平無明顯差異,其原因除了品系差異外,也可能與樣本數(shù)量較少有關(guān)。因此進(jìn)一步探究雌性小鼠是否能更快進(jìn)展為肝癌,或在Mdr2基因敲除的基礎(chǔ)上聯(lián)用化學(xué)藥物干預(yù)能否進(jìn)一步縮短造模時(shí)間,這些問題均需要更多的實(shí)驗(yàn)證據(jù)觀察驗(yàn)證。另外,肝癌模型制備的重要用途之一是用于抗癌藥物的研發(fā),該模型是否可用于藥物療效評(píng)估,也有待于進(jìn)一步探索。

總之,本實(shí)驗(yàn)顯示連續(xù)飼養(yǎng)至(76.3 ± 4.2)周齡的C57BL/6.Mdr2-/-小鼠可自發(fā)形成腫瘤,其表型為肝細(xì)胞癌,該腫瘤模型的形成特征及應(yīng)用前景需繼續(xù)深入研究。