王 愷，蘇健

(江蘇省南通市食品藥品監(jiān)督檢驗中心，南通 226006)

鹽酸異丙嗪為吩噻嗪類抗組胺藥，臨床主要用于抗過敏和止吐，也可用于治療一些暈動病，包括鎮(zhèn)靜、催眠、鎮(zhèn)痛等[1]。《中國藥典》2015 版二部[2]收錄了該品種，標(biāo)準(zhǔn)中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項下規(guī)定每1 mg 鹽酸異丙嗪中含內(nèi)毒素的量應(yīng)＜3.0 EU，按《中國藥典》2015 年版四部1145 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的常規(guī)方法，在實際檢驗工作中發(fā)現(xiàn)鹽酸異丙嗪注射液對細(xì)菌內(nèi)毒素檢查存在嚴(yán)重干擾，實驗中的供試品陽性對照管不凝，導(dǎo)致試驗無效，給臨床用藥帶來安全隱患。本文通過反復(fù)分析，多次試驗，有效消除了鹽酸異丙嗪注射液細(xì)菌內(nèi)毒素檢查的實驗干擾。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑 ZH-2 BLENDER 自動漩渦混合器(天津藥典標(biāo)準(zhǔn)儀器廠)，MM-2 快速旋渦振蕩器(江蘇沈高康健升華器具廠)，ET-96 內(nèi)毒素凝膠法測定儀(天津市天大天發(fā)科技有限公司)，DHG-9620A電熱鼓風(fēng)干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，經(jīng)250 ℃30 min 處理的玻璃儀器，微量移液槍和無熱原槍頭。藥品：鹽酸異丙嗪注射液(規(guī)格2 mL：50 mg，批號：2008171,20085126,20081591,21010811,20111215,廣東南國藥業(yè)有限公司)。鱟試劑：(1)湛江博康海洋生物有限公司，批號：1906033，規(guī)格：0.1 mL，靈敏度：0.03 EU·mL-1；(2)湛江安度斯生物有限公司，批號：1908123，規(guī)格：0.1 mL，靈敏度：0.03 EU·mL-1；(3)湛江安度斯生物有限公司，批號：2005153，規(guī)格：0.1 mL，靈敏度：0.06 EU·mL-1。鎂離子緩沖液：批號：1901310，規(guī)格：4 mL/支，湛江安度斯生物有限公司；(4)湛江安度斯生物有限公司，批號：2005302，規(guī)格：0.1 mL，靈敏度：0.125 EU·mL-1；(5)湛江安度斯生物有限公司，批號：2005241，規(guī)格：0.1 mL，靈敏度:0.25 EU·mL-1；(6)湛江安度斯生物有限公司，批號：2005261，規(guī)格：0.1 mL，靈敏度：0.5 EU·mL-1。

細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品：中國食品藥品檢定研究院，批號：150601-201885，規(guī)格：80 EU/支。細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水：湛江安度斯生物有限公司，批號：1903120，規(guī)格：5 mL/支。

1.2 方法

1.2.1 常規(guī)方法系列稀釋倍數(shù)的干擾實驗 將鹽酸異丙嗪注射液按最大有效稀釋倍數(shù)(maximum valid dilute double,MVD)150、300、600、1 200、2 400，用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋[3]，制備成系列濃度，并用系列溶液將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品配制成2 λ、λ、0.5 λ、0.25 λ 濃度的系列細(xì)菌內(nèi)毒素溶液(共20 份細(xì)菌內(nèi)毒素濃度)，并與靈敏度為0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL-1的鱟試劑進(jìn)行反應(yīng)，每個濃度實驗重復(fù)4 管，同時做供試品稀釋液和細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水的陰性對照，按《中國藥典》2015 年版四部1145細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法供試品干擾試驗方法進(jìn)行實驗。

1.2.2 新方法供試品稀釋液干擾預(yù)實驗 使用鱟試劑靈敏度為0.03 EU·mL-1，用補(bǔ)充適量鎂離子緩沖液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為供試品稀釋劑[4]，依據(jù)公式MVC=λ/L，式中：MVC，最低有效稀釋濃度(minimum valid concentration)；L，供試品的細(xì)菌內(nèi)毒素限值。MVC 為0.01 mg·mL-1，分別在此濃度前后各增加3 個稀釋級，稀釋后的系列濃度進(jìn)行干擾試驗，濃度分別為0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5、0.001 25 mg·mL-1，此系列濃度溶液標(biāo)記為供試品陰性對照(negative product control,NPC)，并制備該系列濃度的細(xì)菌內(nèi)毒素2λ 供試品陽性溶液，記為供試品陽性對照(positive product control,PPC)，使用兩個不同廠家靈敏度為0.03 EU·mL-1的鱟試劑，分別加入0.1 mL 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水溶解混勻，再與0.1 mL的各稀釋級NPC 和PPC 溶液混勻，同時做陽性對照(positive control,PC)和陰性對照(negative control,NPC)各2 管，37 ℃60 min 后觀察[5]。

1.2.3 正式干擾試驗 使用兩個不同廠家的鱟試劑，靈敏度為0.03 EU·mL-1，用補(bǔ)充適量鎂離子緩沖液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作為供試品稀釋劑，將鹽酸異丙嗪注射液稀釋成0.01 mg·mL-1供試品溶液，同時用此供試品溶液作NPC，以細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水作NC，進(jìn)行干擾試驗，通過供試品3 個批號與2個不同廠家的鱟試劑反應(yīng)，結(jié)果表明Et 值均在0.5～2.0 Es 范圍內(nèi)，認(rèn)為此濃度的供試品溶液符合干擾試驗要求[6]。

2 結(jié)果

2.1 鱟試劑靈敏度復(fù)核檢驗 按《中國藥典》2015年版四部1145 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法，分別對上述6 批鱟試劑進(jìn)行靈敏度復(fù)核,用細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水將細(xì)菌內(nèi)毒素工作標(biāo)準(zhǔn)品稀釋為對應(yīng)鱟試劑靈敏度標(biāo)示值的2.0、1.0、0.5、0.25 λ 系列濃度后進(jìn)行試驗。試驗后各批鱟試劑靈敏度測定值λc 均在0.5～2.0 λ 的范圍內(nèi)，“+”為凝固，“-”為未凝固，結(jié)果表明該6 批鱟試劑均符合《中國藥典》2015 年版四部1145 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查法的要求，見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復(fù)核檢驗結(jié)果

2.2 鹽酸異丙嗪注射液的MVD 確定 依據(jù)公式MVD=cL/λ，式中：c，供試品的濃度；λ，鱟試劑靈敏度?！吨袊幍洹?015 版二部中細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項規(guī)定每1 mg 鹽酸異丙嗪中含內(nèi)毒素的量應(yīng)＜3.0 EU(即L=3.0 EU·mg-1)，目前鱟試劑靈敏度有0.5、0.25、0.125、0.06、0.03 EU·mL-1，其MVD 對應(yīng)為150、300、600、1 200、2 400。

2.3 常規(guī)方法系列稀釋倍數(shù)的干擾實驗結(jié)果 供試品系列稀釋倍數(shù)溶液干擾試驗結(jié)果表明：NPC 和PPC 均為陰性，系列試驗管中鱟試劑與對應(yīng)反應(yīng)溶液均未凝固，供試品的Et 值均不在0.5～2.0 Es 范圍內(nèi)，不符合鱟試劑靈敏度的復(fù)核試驗要求，認(rèn)為供試品系列稀釋倍數(shù)濃度下的供試品溶液均存在較強(qiáng)的干擾作用，需要通過其他適宜的方法排除干擾，避免發(fā)生假陰性結(jié)果。

2.4 新方法供試品稀釋液干擾預(yù)實驗結(jié)果 從表2可見，鹽酸異丙嗪注射液用補(bǔ)充適量的鎂離子緩沖液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水稀釋供試品濃度≤0.01 mg·mL-1時，對2 個廠家的鱟試劑均無干擾，所以采用濃度為0.01 mg·mL-1的稀釋液進(jìn)行正式干擾試驗，見表2。

表2 干擾預(yù)實驗結(jié)果

2.5 正式干擾試驗及結(jié)果 將3 個不同批號的鹽酸異丙嗪注射液稀釋為0.01 mg·mL-1的溶液，用此系列供試品稀釋液將細(xì)菌內(nèi)毒素稀釋為0.06、0.03、0.015、0.007 5 EU·mL-1的系列內(nèi)毒素溶液，同時與2 個不同廠家、靈敏度為0.03 EU·mL-1的鱟試劑進(jìn)行反應(yīng)，結(jié)果表明：NPC 和PPC 均為陰性，3 個不同批號的供試品溶液的Et 值均在0.5～2.0 Es 范圍內(nèi)，符合鱟試劑靈敏度的復(fù)核試驗要求，認(rèn)為供試品在該濃度下的供試品溶液無干擾作用，可按此方法進(jìn)行試驗。

2.6 供試品細(xì)菌內(nèi)毒素檢查 按《中國藥典》2015年版四部1145 細(xì)菌內(nèi)毒素檢查方法，使用含有適量鎂離子緩沖液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為稀釋劑，將鹽酸異丙嗪注射液稀釋成0.01 mg·mL-1供試品溶液，靈敏度為0.03 EU·mL-1的鱟試劑，對5 批供試品進(jìn)行檢查，樣品對實驗均無干擾，重復(fù)性良好，實驗結(jié)果均符合《中國藥典》規(guī)定的要求。

3 討 論

由于《中國藥典》2015 年版四部1145 細(xì)菌內(nèi)毒素檢法的常規(guī)方法凝膠法對于個別注射液存在專屬性差的缺點，對實驗造成一定的干擾，為了降低藥品的安全風(fēng)險,必須對實驗干擾的因素進(jìn)行排查和分析，找到切實可行的該品種的可靠性細(xì)菌內(nèi)毒素檢驗方法，使該產(chǎn)品現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)更為嚴(yán)謹(jǐn)，排除嚴(yán)重威脅百姓的用藥安全隱患,促進(jìn)藥品生產(chǎn)企業(yè)的良性發(fā)展，從根源上控制生產(chǎn)企業(yè)出廠檢驗關(guān)，從源頭保證廣大人民群眾的用藥安全。

采用常規(guī)方法干擾試驗結(jié)果表明，鹽酸異丙嗪注射液對系列不同標(biāo)示靈敏度的鱟試劑與細(xì)菌內(nèi)毒素的凝集反應(yīng)有較強(qiáng)干擾作用，鎂離子緩沖液是一種輔助劑，含有一定量的二價鎂離子，能有效緩沖類枸櫞酸鹽的螯合反應(yīng)[7]，保持鱟試劑的正常靈敏度，還具有較強(qiáng)的pH 緩沖作用，有效維持鱟試劑反應(yīng)時的pH 6.0～8.0。由正式干擾試驗可見，采用補(bǔ)充適量鎂離子緩沖液的細(xì)菌內(nèi)毒素檢查用水為稀釋劑，供試品稀釋為0.01 mg·mL-1時對2 個廠家的鱟試劑均無干擾作用，實驗表明此方法可以作為鹽酸異丙嗪細(xì)菌內(nèi)毒素檢查項下的法定標(biāo)準(zhǔn)檢驗方法，望涉及該產(chǎn)品的企業(yè)質(zhì)管部門以此為鑒，確保藥品的使用安全。