賈娟，梁思，陳恒利，王紅杰，2，3

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院，河北 保定 071000；2.河北大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000；3.河北省慢性腎臟病骨骼代謝生理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

慢性腎臟病(chronic kidney disease, CKD)嚴(yán)重危害人類身心健康，已經(jīng)成為全世界主要的健康問題之一。CKD 3期及以上患者[即腎小球?yàn)V過率(eGFR)<60 mL/(min·1.73 m2)]隨著腎功能下降，全因死亡率及心血管死亡風(fēng)險(xiǎn)顯著升高[1]。Cano-Megías等[2]通過對(duì)137例終末期CKD患者進(jìn)行為期10年的隨訪發(fā)現(xiàn)，CKD患者的總病死率為58%，其中40%是由心血管事件導(dǎo)致。調(diào)整年齡、性別等混雜因素后，鈣磷代謝異常是導(dǎo)致CKD患者冠狀動(dòng)脈鈣化的危險(xiǎn)因素之一[3]。Gravesen等[4]將尿毒癥大鼠鈣化的血管移植到正常大鼠，脫離了尿毒癥和高磷血癥環(huán)境后血管組織中的鈣含量無明顯變化，進(jìn)一步說明預(yù)防血管鈣化的重要性，血管鈣化一旦形成，很難逆轉(zhuǎn)。因此,充分了解及研究血管鈣化的機(jī)制，預(yù)防并阻止血管鈣化的發(fā)生極其重要。近期隨著蛋白組學(xué)的發(fā)展，越來越多研究發(fā)現(xiàn)，高磷環(huán)境的刺激可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化。主要表現(xiàn)為促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞向成骨樣細(xì)胞轉(zhuǎn)化的相關(guān)因子如成骨因子Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(runt related gene 2, Runx2)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein 2, BMP-2)、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)、核轉(zhuǎn)錄因子-κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κBligand,RANKL)等表達(dá)增加，抑制血管鈣化的因子如骨保護(hù)素(osteoprotegerin, OPG)等表達(dá)下降。微小RNA(microRNA, miRNA)可通過在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控促進(jìn)或抑制鈣化形成的因子，進(jìn)而起到調(diào)控血管鈣化的作用，因此將與高磷誘導(dǎo)的血管鈣化相關(guān)的miRNA進(jìn)行綜述，希望為高磷誘導(dǎo)的CKD患者血管鈣化的治療提供新的方案。

1 高磷狀態(tài)下，抑制血管鈣化的miRNA

1.1 miR-26a

Wu等[5]發(fā)現(xiàn),在β磷酸甘油干預(yù)下，miR-26a和OPG在血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)降低，RANKL及ALP表達(dá)增加。過表達(dá)miR-26a后，RANKL及ALP表達(dá)下降，血管鈣化減輕。結(jié)果表明，miR-26a可能通過調(diào)節(jié)成骨相關(guān)基因及蛋白的表達(dá)，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)血管鈣化的作用[5]。

1.2 miR-29a/b

關(guān)于miR-29a/b在高磷誘導(dǎo)的血管鈣化中發(fā)揮的作用，結(jié)論尚未統(tǒng)一。Lee、Panizo和Sudo等認(rèn)為miR-29a/b起到促進(jìn)血管鈣化的作用。Lee等[6]在存在血管鈣化的透析患者循環(huán)中發(fā)現(xiàn)，miR-29a/b水平與鈣化的程度呈正相關(guān)，且與透析患者的病死率密切相關(guān)。Panizo等[7]研究顯示，高磷狀態(tài)下，miR-29b表達(dá)增加與Runx2表達(dá)呈正相關(guān)，認(rèn)為miR-29b可能通過促進(jìn)成骨樣細(xì)胞因子的表達(dá)，起到促進(jìn)血管鈣化的作用。Sudo等[8]研究顯示，在高磷狀態(tài)下，miR-29表達(dá)增加，同時(shí)血管平滑肌細(xì)胞彈性蛋白的表達(dá)下降，血管鈣化加重，抑制miRNA-29后，可恢復(fù)彈性蛋白的表達(dá)，認(rèn)為miR-29可能通過抑制彈性蛋白的表達(dá)，從而促進(jìn)血管鈣化。但是，Du等[9]認(rèn)為，miR-29a/b起到抑制血管鈣化的作用。軟骨寡聚基質(zhì)蛋白(cartilage oligomeric matrix protein, COMP)缺乏可導(dǎo)致血管鈣化，而解聚蛋白樣金屬蛋白酶-7(a disintegrin-like and metalloproteinase with thrombospondin motifs 7, ADAMTS-7)可降解損傷血管中的COMP，進(jìn)而促進(jìn)血管鈣化的發(fā)生。Du等[10]還認(rèn)為，miR-29a/b與ADAMTS-7的表達(dá)成負(fù)相關(guān)，抑制miR-29a/b后，ADAMTS-7表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)COMP降解，加重血管鈣化。目前，對(duì)于miR-29a/b在血管鈣化中發(fā)揮的作用尚不完全清楚，仍需進(jìn)一步研究。

1.3 miR-30b

在高磷環(huán)境的刺激下，血管平滑肌細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激，線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential, MMP)增加，自噬相關(guān)蛋白LC3II/LC3I及Beclin1表達(dá)增加，從而誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生自噬。miR-30b與MMP、LC3II/LC3I、Beclin1表達(dá)呈正相關(guān)，過表達(dá)miR-30b后，MMP及自噬相關(guān)蛋白(LC3、Beclin1)表達(dá)上調(diào)，成骨細(xì)胞相關(guān)蛋白R(shí)unx2和肌節(jié)同源盒基因同系物2(muscle segment homeobox, Msx2)表達(dá)下降，血管鈣化減輕[11]。性別決定區(qū)Y-box9(Sox9)基因在軟骨細(xì)胞發(fā)育和肥大軟骨細(xì)胞的變化中起著重要作用[12]。通過熒光素酶測(cè)定證實(shí)，miR-30b的作用靶點(diǎn)為Sox9，增加miR-30b表達(dá)后可顯著降低Sox9的表達(dá)。此外，在鈣化的人冠狀動(dòng)脈中BMP-2可通過下調(diào)miR-30b/c導(dǎo)致Runx2表達(dá)增加，促進(jìn)血管鈣化[13]。而miR-30b/c是通過與Runx2的3′非編碼區(qū)結(jié)合，調(diào)節(jié)Runx2的表達(dá)。

1.4 miR-34b

高磷狀態(tài)下，miR-34b在細(xì)胞水平、動(dòng)物水平及尿毒癥患者中表達(dá)均受到抑制，且與鈣化的程度呈負(fù)相關(guān)[14]。miR-34b表達(dá)下調(diào)是因?yàn)镈NA甲基轉(zhuǎn)移酶3a(DNA methyltransferase 3a, DNMT3a)表達(dá)增加，導(dǎo)致miR-34b DNA上游CpG位點(diǎn)甲基化，予以甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-aza-2′-脫氧胞苷(5-aza)降低miR-34b甲基化速率后，可恢復(fù)miR-34b表達(dá)。當(dāng)敲除DNMT3a后，發(fā)現(xiàn)3.5 mmol/L磷對(duì)血管平滑肌細(xì)胞鈣化無影響，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，Notch1的3′非編碼區(qū)序列包含一個(gè)與miR-34b序列互補(bǔ)的序列。miR-34b過度表達(dá)可降低Notch1表達(dá)，抑制后可增加Notch1表達(dá)[14]。由此認(rèn)為，miR-34b發(fā)揮抑制血管鈣化的作用受上游DNA甲基化和下游靶基因Notch1的調(diào)節(jié)。

1.5 miR-103

高磷狀態(tài)下，血管平滑肌細(xì)胞miR-103表達(dá)水平下降，Runx2表達(dá)上調(diào)，ALP活性增強(qiáng)，血管鈣化加重，過表達(dá)miR-103后，Runx2表達(dá)下降，ALP活性降低，血管鈣化減輕[15]。miR-103可能通過負(fù)向調(diào)節(jié)Runx2表達(dá)發(fā)揮抑制血管鈣化的作用。

1.6 miR-125b

高磷干預(yù)下，miR-125b在人主動(dòng)脈血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)與鈣化的程度呈負(fù)相關(guān)，Goettsch等[16]認(rèn)為,miRNA-125b發(fā)揮作用一部分是通過靶向調(diào)節(jié)成骨轉(zhuǎn)錄因子SP7實(shí)現(xiàn)，一部分是通過抑制Runx2和ALP表達(dá)實(shí)現(xiàn)。Chen等[17]認(rèn)為，miR-125b在CKD大鼠胸主動(dòng)脈中表達(dá)下降，但是Drosha酶及Dicer酶表達(dá)無差異，推測(cè)其表達(dá)下降可能與細(xì)胞內(nèi)加工的改變無關(guān)。Wen等[18]認(rèn)為，可調(diào)控整合素、血管內(nèi)皮鈣黏蛋白等與細(xì)胞黏附和內(nèi)皮細(xì)胞遷移相關(guān)的Ets1[19]是miR-125b的靶向目標(biāo)。

1.7 miR-133/miR-145/miR-205

研究[7，17，20-21]表明，高磷狀態(tài)下，miR-133a/b、miR-145及miR-205在血管平滑肌細(xì)胞的表達(dá)顯著下降，與此同時(shí)Runx2表達(dá)增加,血管鈣化加重。Liao等[20]認(rèn)為，在敲除Runx2基因的細(xì)胞中miR-133a抑制劑不能起到促進(jìn)血管鈣化的作用,證明miR-133a的直接作用靶點(diǎn)為Runx2。Chen等[17]認(rèn)為，miR-145在CKD大鼠血管平滑肌細(xì)胞中表達(dá)下降，但是Drosha酶和Dicer酶的表達(dá)無顯著變化，miR-145表達(dá)下降可能與細(xì)胞內(nèi)加工無關(guān)。Qiao等[21]研究表明，miR-205可能靶向抑制Runx2和smad1表達(dá)水平而減輕高磷誘導(dǎo)的血管鈣化。

1.8 miR-182

Sortilin1(SORT1)與動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展相關(guān)。Zhang等[22]認(rèn)為，在β磷酸甘油干預(yù)下血管平滑肌細(xì)胞miR-182表達(dá)下降，并且與SORT1表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。在體外實(shí)驗(yàn)中，通過下調(diào)SORT1表達(dá)后可抑制β磷酸甘油誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化。通過熒光素酶分析證實(shí)SORT1是miR-182的直接靶點(diǎn)，提示miR-182可通過調(diào)節(jié)SORT1調(diào)節(jié)血管鈣化。

1.9 miR-204

高磷刺激下，血管平滑肌細(xì)胞miR-204表達(dá)下調(diào)，Runx2表達(dá)顯著增加。Cui等[23]通過熒光素酶分析得出，miR-204的直接作用靶點(diǎn)是Runx2。此外，Lin等[24]在細(xì)胞、動(dòng)物及透析患者中通過測(cè)序得出，miR-204基因上游的CpG位點(diǎn)發(fā)生高甲基化，DNMT3a可加重高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞miR-204甲基化，予以5-aza可恢復(fù)miR-204表達(dá)，由此推測(cè)DNMT3a是miR-204的靶點(diǎn)。

1.10 miR-302b

miR-302b在CKD大鼠中表達(dá)下調(diào)，增加其表達(dá)后，可降低BMP-2/Runx2/osterix信號(hào)的表達(dá)，改善CKD大鼠鈣磷代謝及減輕血管鈣化[25]。因此認(rèn)為，miR-302b改善血管鈣化，可能通過抑制BMP-2/Runx2/osterix信號(hào)通路的表達(dá)實(shí)現(xiàn)。

2 高磷狀態(tài)下，促進(jìn)血管鈣化的miRNA

2.1 miR-32

Liu等[26]研究表明，在β磷酸甘油干預(yù)下，小鼠平滑肌細(xì)胞miR-32表達(dá)增加，并且增強(qiáng)BMP-2、Runx2、ALP表達(dá)，促進(jìn)了鈣化。miR-32一方面通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase, PI3K)信號(hào)通路，另一方面通過調(diào)控磷酸酶和張力蛋白同源mRNA的3′非編碼區(qū)增加血管平滑肌細(xì)胞Runx2的表達(dá)和磷酸化，從而調(diào)控血管鈣化。Liu等[26]同樣在冠狀動(dòng)脈鈣化的患者血漿中發(fā)現(xiàn)miR-32水平高于非冠狀動(dòng)脈鈣化患者,認(rèn)為miR-32可作為診斷冠狀動(dòng)脈鈣化的潛在標(biāo)志物。

2.2 miR-3960/miR-2861

Xia等[27]在實(shí)驗(yàn)中得出，高磷狀態(tài)下，miR-3960和miR-2861在血管平滑肌細(xì)胞中的表達(dá)顯著增加。過表達(dá)miR-3960與miR-2861后，顯著促進(jìn)了血管平滑肌細(xì)胞的成骨作用，反之亦然。miR-3960與miR-2861可分別通過組蛋白去乙酰化酶5(histone deacetylase 5，HDAC5)或Homeobox A2促進(jìn)Runx2蛋白產(chǎn)生，進(jìn)而加重血管鈣化。

2.3 miR-134

在高磷干預(yù)下，大鼠血管平滑肌細(xì)胞中miR-134-5p表達(dá)增加，同時(shí)成骨細(xì)胞相關(guān)因子Runx2和BMP-2表達(dá)增加，OPG表達(dá)下降。過表達(dá)HDAC5后，可減輕miR-134-5p誘導(dǎo)的鈣沉積。通過生物學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，HDAC5的3′非編碼區(qū)是miR-134-5p的作用靶點(diǎn)。結(jié)果表明，高磷誘導(dǎo)的血管平滑肌細(xì)胞鈣化，可能通過促進(jìn)miR-134-5p增加，而抑制HDAC5產(chǎn)生發(fā)揮作用[28]。

2.4 miR-223

Rangrez等[29]研究表明，在高磷環(huán)境下，血管平滑肌細(xì)胞miR-223的表達(dá)增高。過表達(dá)miR-223可促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞增殖和遷移，并且減少血管平滑肌細(xì)胞特異性蛋白SMα-actin表達(dá)。miR-223主要通過下調(diào)miR-223靶點(diǎn)Mef2c和RhoB表達(dá)而實(shí)現(xiàn)促進(jìn)血管平滑肌細(xì)胞表型轉(zhuǎn)變。

3 展望

血管鈣化是心血管疾病的病理基礎(chǔ)。心血管疾病是慢性腎臟病患者的主要死亡原因。近年來，隨著蛋白組學(xué)的發(fā)展，miRNA在血管鈣化中的研究日益深入，越來越多miRNA被發(fā)現(xiàn)參與了血管鈣化的過程。然而，miRNA是一個(gè)龐大的家族，且其確切的功能仍需要繼續(xù)深入研究。因此，研究miRNA基因?qū)Ω吡渍T導(dǎo)的血管鈣化的具體機(jī)制仍任重道遠(yuǎn)。因此深入研究miRNA在高磷誘導(dǎo)的血管鈣化中的作用機(jī)制，有望為CKD患者血管鈣化的診斷和干預(yù)提供新的靶點(diǎn)。