張紅強(qiáng)，張冰，李建奇，瞿海龍

(河北大學(xué)附屬醫(yī)院急診醫(yī)學(xué)科，河北 保定 071000)

冠心病、心力衰竭是心血管疾患最主要的死因，已成為21世紀(jì)心血管領(lǐng)域的重大挑戰(zhàn)。隨著中國(guó)人口老齡化，心力衰竭患病率迅速增加，70歲以上人群患病率達(dá)10%以上[1]。傳統(tǒng)的藥物治療只暫緩心力衰竭癥狀，致使患者反復(fù)住院。而對(duì)心力衰竭的根治性治療“心臟移植”，由于供體缺乏、費(fèi)用高昂，限制了其在臨床中的應(yīng)用。如何實(shí)現(xiàn)心肌細(xì)胞再生、促進(jìn)受損心肌修復(fù)，眾多學(xué)者將目光投向了干細(xì)胞，以期為心力衰竭治療另辟蹊徑。然而2018年P(guān)ieri Anversa的 “心臟干細(xì)胞”實(shí)驗(yàn)不能重復(fù)、存在虛假數(shù)據(jù)，使干細(xì)胞的研究陷入低谷、備受爭(zhēng)議[2]。間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells, MSCs)卻由于其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)而得到更深入研究。人間充質(zhì)干細(xì)胞(human mesenchymal stem cells, hMSCs)可通過(guò)旁分泌機(jī)制實(shí)現(xiàn)其在心肌內(nèi)的遷移、分化與歸巢，而且具有免疫調(diào)節(jié)作用，能夠在心肌受損環(huán)境下生存，使其成為備選干細(xì)胞的種子細(xì)胞。hMSCs是一類(lèi)存在骨髓、脂肪組織、臍帶血、外周血等多種組織內(nèi)具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，體外易分離、傳代擴(kuò)增后生物特性不變，能夠特定表達(dá)某些表面分子標(biāo)志物，具有相對(duì)特異性[3]。hMSCs具有內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞、心肌細(xì)胞的表型特征，同種異體移植后不表達(dá)MHCⅡ類(lèi)分子，具有免疫耐受性[4]。hMSCs移植到梗死心肌后能夠抑制心室重構(gòu)、改善心功能，其機(jī)制為hMSCs可抑制心肌纖維化、減少心肌細(xì)胞凋亡，同時(shí)還有免疫調(diào)節(jié)、促進(jìn)新生血管形成的作用[5]。臨床試驗(yàn)將hMSCs植入心力衰竭患者體內(nèi)6個(gè)月后，患者左室射血分?jǐn)?shù)明顯高于對(duì)照組，其結(jié)果令人鼓舞[6]。然而，hMSCs為多潛能干細(xì)胞，具有形成腫瘤或其他組織的危險(xiǎn)，且hMSCs在心肌炎性環(huán)境中生存時(shí)間短、存活率低，如何實(shí)現(xiàn)其生物學(xué)效應(yīng)長(zhǎng)期化，成為臨床大規(guī)模應(yīng)用必須克服的問(wèn)題。隨著基因修飾、藥物誘導(dǎo)、生物工程等技術(shù)應(yīng)用于hMSCs治療，為hMSCs的臨床應(yīng)用帶來(lái)重大突破。

1 基因工程技術(shù)

機(jī)體發(fā)生心肌梗死、心力衰竭時(shí)局部微環(huán)境會(huì)對(duì)干細(xì)胞產(chǎn)生不利影響，如局部缺血缺氧、高水平的氧化應(yīng)激及促凋亡因子會(huì)加快移植細(xì)胞消亡。增強(qiáng)hMSCs治療潛能的首要策略之一是通過(guò)病毒或非病毒載體調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)。對(duì)hMSCs實(shí)施基因修飾能夠促進(jìn)生存、遷移、黏附和血管形成所必需的細(xì)胞因子或蛋白表達(dá)。絲氨酸-蘇氨酸激酶基因Akt表達(dá)可促進(jìn)hMSCs存活，將此基因修飾的hMSCs移植到缺血心臟時(shí)可修復(fù)受損心肌，抑制心臟重構(gòu)、改善左室射血分?jǐn)?shù)，減少心肌梗死面積[7]。轉(zhuǎn)染Akt基因的hMSCs可表現(xiàn)出更高的抗凋亡能力，而且顯示與宿主心肌細(xì)胞的融合能力增強(qiáng)。對(duì)hMSCs實(shí)施Akt和Ang-1雙重基因修飾可使大量心肌細(xì)胞得到存活，血管形成能力明顯增強(qiáng)，心功能得到顯著改善[8]。對(duì)hMSCs實(shí)施促存活基因Bcl-2轉(zhuǎn)染后心肌細(xì)胞凋亡數(shù)量減少，血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)水平提高，且這一效應(yīng)可持續(xù)很長(zhǎng)時(shí)間。將Bcl-2修飾的MSCs移植到動(dòng)物梗死模型中，心肌梗死范圍減少、毛細(xì)血管密度增加[9]。血紅素加氧酶-1(heme oxygenase-1,HO-1)是另一種保護(hù)基因，在炎癥和內(nèi)毒素血癥環(huán)境下通過(guò)抑制高遷移率組蛋白-1促進(jìn)細(xì)胞存活。轉(zhuǎn)染HO-1的MSCs可促進(jìn)梗死周?chē)鷧^(qū)毛細(xì)血管和小動(dòng)脈密度增加，而且其在體內(nèi)的長(zhǎng)期存活率會(huì)得到顯著的提高[10]。為提高M(jìn)SCs的遷移能力將趨化因子受體轉(zhuǎn)染到其基因中，不僅細(xì)胞遷移能力得到加強(qiáng)，而且還可起到抗凋亡、促血管形成的作用[11]。將整合素連接激酶基因轉(zhuǎn)染到MSCs，可提高其在缺血心肌的黏附性，減少梗死面積及纖維化，促進(jìn)微血管形成，有利于損傷心肌的修復(fù)[12]。

基因修飾的MSCs可有效調(diào)控醫(yī)務(wù)工作者感興趣的相關(guān)因子或蛋白表達(dá)，而且表達(dá)的這些生物活性物質(zhì)具有長(zhǎng)期效益，可增強(qiáng)MSCs的治療效果。然而基因修飾的MSCs安全性成為限制其臨床大規(guī)模應(yīng)用的重要因素，因?yàn)椴《驹谒拗骰蚪M中的整合可增加致瘤作用。因此為保障轉(zhuǎn)染MSCs治療的安全性，仍需從基礎(chǔ)到臨床行進(jìn)一步研究，實(shí)現(xiàn)利益最大化，風(fēng)險(xiǎn)最小化。

2 缺氧和復(fù)氧技術(shù)

氧是細(xì)胞維持存活的基本因素之一，缺氧或無(wú)氧可導(dǎo)致嚴(yán)重的病理生理改變。低氧可降低MSCs的活力與增殖，然而缺氧后實(shí)施復(fù)氧可以增強(qiáng)細(xì)胞的存活能力。這種持續(xù)的缺氧和復(fù)氧過(guò)程可以刺激各種促生存基因的表達(dá)，使MSCs可以耐受體內(nèi)惡劣的微環(huán)境。將低濃度血清培養(yǎng)的MSCs暴露于1%氧濃度下，MSCs顯示出更強(qiáng)的生存能力和血管形成能力，能夠高表達(dá)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子與成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子2[13]。MSCs經(jīng)低氧處理后可使促血管生成、促生存和促分化因子的表達(dá)增加，將此類(lèi)細(xì)胞移植到機(jī)體后可促進(jìn)血管生成因子分泌增加，促凋亡因子caspase-3顯著減少，進(jìn)而改善心功能[14]。MSCs經(jīng)低氧處理后在體內(nèi)歸巢能力明顯增強(qiáng)，可精準(zhǔn)到達(dá)梗死部位。對(duì)MSCs在缺氧條件下培養(yǎng)可促進(jìn)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子信號(hào)通路的主要受體cMet的表達(dá)，可促進(jìn)細(xì)胞向缺血部位遷移[15]。MSCs經(jīng)低氧干預(yù)后可增加鉀通道和黏附斑激酶的表達(dá)水平，從而提高細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力。同時(shí)可促進(jìn)細(xì)胞朊蛋白PrPc表達(dá)，進(jìn)而激活PrPc依賴(lài)的JAK2和STAT3途徑使MSCs的增殖能力增強(qiáng)[16]。此外，PrPc表達(dá)增加也可通過(guò)激活過(guò)氧化氫酶和超氧化物歧化酶使凋亡途徑失活，起到抗凋亡作用。MSCs在體內(nèi)必須具備遺傳穩(wěn)定性和低致瘤潛能。低氧條件培養(yǎng)的MSCs存活時(shí)間延長(zhǎng)，與正常氧濃度下培養(yǎng)的細(xì)胞相比，其DNA損傷減少、染色體畸變減少、端粒酶縮短減少和氧化應(yīng)激減少，表明缺氧在啟動(dòng)MSCs的遺傳和染色體穩(wěn)定性中起著重要的作用[17]。MSCs在移植前給予低氧預(yù)處理可以下調(diào)參與腫瘤發(fā)生的特定基因的表達(dá)，從而使MSCs成為再生治療的安全選擇。

毫無(wú)疑問(wèn)，低氧干預(yù)后的MSCs具有多種積極作用，包括提高其生存能力、增殖能力，促進(jìn)多種血管生成因子分泌和加強(qiáng)其歸巢作用。然而低氧誘導(dǎo)MSCs仍有許多問(wèn)題需要優(yōu)化，如尋找最有效的復(fù)氧濃度、缺氧和復(fù)氧最佳持續(xù)時(shí)間等。

3 藥物制劑

不同藥物制劑通過(guò)激活內(nèi)源性細(xì)胞保護(hù)機(jī)制使MSCs在缺血缺氧環(huán)境中免受損傷，從而提高M(jìn)SCs治療潛能。應(yīng)用曲美他嗪預(yù)處理MSCs可提高其抗氧化應(yīng)激、增加促生存因子的表達(dá)水平，如HIF-1α、Akt、survivin和Bcl-2的表達(dá)，體內(nèi)移植后可觀(guān)察到心功能得到改善[18]。采用阿托伐他汀預(yù)處理MSCs可通過(guò)激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶提高其移植后的存活率，應(yīng)用此類(lèi)MSCs移植后組織修復(fù)能力和心功能顯著改善[19]。經(jīng)催產(chǎn)素干預(yù)的MSCs在缺氧和無(wú)血清的條件下具有較高的存活率，通過(guò)上調(diào)Akt和ERK1/2蛋白的表達(dá)，使細(xì)胞增殖和遷移能力得到提高。黃芪是中國(guó)的傳統(tǒng)中草藥，也是心血管疾病常用中藥。應(yīng)用黃芪甲苷對(duì)MSCs進(jìn)行干預(yù)可中和高糖條件下誘導(dǎo)的TLR4表達(dá)，促進(jìn)MSCs的分化與增殖[20]。研究顯示蘋(píng)果提取物可通過(guò)ERK蛋白的磷酸化促進(jìn)MSCs的增殖，并促進(jìn)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子和白介素-6的表達(dá)[21]。染料木素是一種存在于大豆異黃酮中的活性化合物，它主要參與機(jī)體的抗氧化和抗感染作用。將這種化合物對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理，可以通過(guò)表達(dá)過(guò)氧化物酶體增殖物激活受體增強(qiáng)其增殖能力[22]。應(yīng)用二甲基草酰苷氨酸預(yù)處理MSCs也可以促進(jìn)其遷移到梗死區(qū)域，從而減少梗死面積、加強(qiáng)移植后的心肌修復(fù)[23]。

盡管目前多種藥物可用于對(duì)MSCs干預(yù)以提高其增殖和遷移能力，促進(jìn)其在缺血缺氧條件下生存?？刹煌幬镒饔糜贛SCs的靶點(diǎn)不同，其干預(yù)效果必然參差不齊。采取何種藥物劑量、作用時(shí)間才能發(fā)揮最佳效應(yīng)，仍需進(jìn)一步研究。

4 生物工程技術(shù)

隨著生物力學(xué)和組織工程技術(shù)的進(jìn)步，MSCs的研發(fā)與生物工程越發(fā)緊密結(jié)合。二氧化硅納米顆?？烧T導(dǎo)ERK1/2途徑中的蛋白磷酸化，進(jìn)而加強(qiáng)MSCs的增殖能力[24]。納米螯合劑復(fù)合物GFc7可促進(jìn)MSCs的增殖和歸巢能力，同時(shí)還可提高M(jìn)SCs的抗應(yīng)激能力，抑制其自發(fā)分化。對(duì)聚苯乙烯培養(yǎng)皿表面采用多聚賴(lài)氨酸包被技術(shù)改良后可活化FAK和MAPK蛋白，使MSCs的遷移能力得到顯著提高[25]。應(yīng)用絲素蛋白和聚二丙烯酸酯合成的復(fù)合水凝膠可提高M(jìn)SCs的生存能力和分化能力。研究發(fā)現(xiàn)，在3D培養(yǎng)基上培養(yǎng)MSCs，將細(xì)胞包裹在水凝膠、多孔支架和無(wú)支架球體等生物材料中，可顯著增強(qiáng)MSCs的黏附、遷移、胞外基質(zhì)表達(dá)和旁分泌作用[26]。光生物調(diào)節(jié)也是干預(yù)MSCs的方法之一。應(yīng)用低劑量激光照射MSCs，可使線(xiàn)粒體生物發(fā)生增加、生長(zhǎng)因子基因表達(dá)上調(diào)，從而起到促進(jìn)MSCs增殖的作用[27]。將MSCs暴露于脈沖電磁場(chǎng)時(shí)也可導(dǎo)致其生物學(xué)發(fā)生變化，使細(xì)胞凋亡減少、存活率提高，并呈時(shí)間和劑量依賴(lài)性。其機(jī)制為脈沖電磁場(chǎng)可誘導(dǎo)Akt/Ras信號(hào)通路，上調(diào)Bcl-2和Bad等促生存蛋白的表達(dá)[28]。將MSCs高溫暴露一段時(shí)間也可提高其存活率，其原因?yàn)楦邷乜纱龠M(jìn)具有抗凋亡的熱休克蛋白的表達(dá)[29]。

對(duì)MSCs進(jìn)行物理因素干預(yù)具有成本低、速度快的特點(diǎn)，然而這些因素對(duì)MSCs存在不利影響，如導(dǎo)致細(xì)胞死亡和DNA損傷。而且在選擇最佳類(lèi)型的生物材料和確定其細(xì)胞毒性及生物降解方面，仍需得到進(jìn)一步優(yōu)化，在隨后實(shí)驗(yàn)中需進(jìn)一步關(guān)注這些生物材料影響MSCs的潛在機(jī)制。

5 MSCs體內(nèi)應(yīng)用策略

最近Park等[30]開(kāi)展了一項(xiàng)令人鼓舞的體內(nèi)研究，該團(tuán)隊(duì)將包含MSCs的三維貼片植入心肌梗死模型大鼠心臟。MSCs移植到心臟之前常規(guī)干預(yù)策略效果不會(huì)持續(xù)較長(zhǎng)時(shí)間，通常只有2～3 d。為了延長(zhǎng)MSCs作用時(shí)間，該研究提出了一項(xiàng)“體內(nèi)處理策略”，即將修飾后的hMSCs移植到心臟部位，在體內(nèi)實(shí)現(xiàn)誘導(dǎo)干細(xì)胞的作用。研究人員首先制備表達(dá)肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子的骨髓源性MSCs(hepatocyte growth factor expressing MSCs, HGF-eMSCs)，將其封裝入3D心臟補(bǔ)片內(nèi)，再植入心肌梗死模型的心外膜。其目的是使HGF-eMSCs持續(xù)分泌肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子，促進(jìn)梗死部位血管形成、抑制心肌纖維化。該研究利用心臟來(lái)源的細(xì)胞外基質(zhì)水凝膠制作心肌補(bǔ)片，模擬心臟組織特異性微環(huán)境。將HGF-eMSCs補(bǔ)片移植到大鼠心肌梗死模型后干細(xì)胞存活率提高，存活時(shí)間長(zhǎng)達(dá)8周，可顯著促進(jìn)受損心肌的修復(fù)、免受缺血損傷。該研究將生物工程技術(shù)、3D打印技術(shù)、基因修飾技術(shù)與MSCs實(shí)現(xiàn)完美結(jié)合，為干細(xì)胞體內(nèi)應(yīng)用帶來(lái)新的方法。

6 間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)其他細(xì)胞的影響

MSCs是實(shí)現(xiàn)心臟修復(fù)治療的最佳類(lèi)型細(xì)胞之一，對(duì)其進(jìn)行的不同干預(yù)策略可提高M(jìn)SCs的治療潛能，然而MSCs本身也可增加其他類(lèi)型細(xì)胞的治療作用。將MSCs與心肌細(xì)胞共培養(yǎng)可起到對(duì)心肌細(xì)胞的保護(hù)作用，促進(jìn)存活基因PKB/Akt和p-cAMP的磷酸化，抑制心肌細(xì)胞的凋亡[31]。hMSCs與骨髓源性?xún)?nèi)皮祖細(xì)胞共培養(yǎng)可通過(guò)PDGF和Notch信號(hào)通路促進(jìn)細(xì)胞增殖、增強(qiáng)血管生成能力。將MSCs與軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)可通過(guò)MSCs分泌的營(yíng)養(yǎng)因子促使軟骨的形成，而并非MSCs分化為軟骨細(xì)胞[32]。

Park等[33]將含有hMSCs的3D心臟貼膜植入到大鼠心肌梗死模型的心外膜，將人誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞來(lái)源心肌細(xì)胞(human induced pluripotent stem cells-derived cardiomyocytes, hiPSC-CMs)注射到梗死心肌周?chē)?，這種雙重干細(xì)胞療法可同時(shí)實(shí)現(xiàn)修復(fù)受損心肌和再生血管。hMSCs通過(guò)旁分泌活性促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞存活和再生血管，而hiPSC-CMs與原發(fā)心肌細(xì)胞在特異性基因表達(dá)、離子通道表達(dá)、結(jié)構(gòu)蛋白表達(dá)、自發(fā)性收縮等方面很相似，而且能夠與宿主心肌形成有效的縫隙連接，從而起到再生心肌的作用。由于hMSCs可持續(xù)分泌多種活性因子，因此雙重干細(xì)胞移植可提高h(yuǎn)iPSC-CMs的成熟度及存活率，使干細(xì)胞的作用在體內(nèi)達(dá)到最大化。

總之，隨著對(duì)MSCs研究技術(shù)的不斷進(jìn)步，心臟再生修復(fù)治療日益受到科研及臨床的關(guān)注，盡管目前對(duì)MSCs的認(rèn)知取得了重大成果，但仍需大規(guī)模的臨床試驗(yàn)來(lái)證實(shí)該方法的可行性與安全性。