盧文潔，王艷青，孫道旺，尹桂芳，王莉花

(云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所/云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 昆明 650205)

【研究意義】蕎麥(Fagopyrumesculentum)屬蓼科蕎麥屬雙子葉植物[1]，起源地為中國(guó)西南部[2]。蕎麥既可作為糧食作物，又可作為藥用作物。蕎麥不僅含蛋白質(zhì)、脂肪等豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)[3]，且含蘆丁、葒草苷等具有藥用價(jià)值的黃酮類物質(zhì)[4]，其中蘆丁對(duì) “三高”和毛細(xì)血管出血疾病具有一定的預(yù)防功效[5]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】國(guó)內(nèi)外已報(bào)道的蕎麥病害主要有核立枯病[6]、白粉病[7]、輪紋病[8]、葉枯病[9]、白霉病[10]、根結(jié)線蟲(chóng)病害[11]、根腐病[12]、霜霉病[13]等。盧文潔等[14]研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥輪紋病病原菌菌絲適宜生長(zhǎng)的溫度和pH范圍分別為20～28 ℃和4～6 ，菌絲利用率最高的碳源和氮源分別為葡萄糖和蛋白胨。蕎麥葉枯病病原菌菌絲適宜生長(zhǎng)的溫度和pH范圍分別為20～28 ℃和6～9 ，菌絲利用率最高的碳源和氮源分別為麥芽糖和硝酸鈉[11]。李瓊等[12]研究發(fā)現(xiàn)，蕎麥白霉病病原菌菌絲適宜生長(zhǎng)的溫度和pH范圍分別為15～25 ℃和5～6，菌絲利用率最高的碳源和氮源分別為可溶性淀粉和蛋白胨。【本研究切入點(diǎn)】隨著蕎麥種植面積的不斷擴(kuò)大，種植品種常年單一化，加上田間管理粗放等因素，蕎麥病害種類不斷增加，危害程度逐年加重。近年來(lái)，在云南省會(huì)澤縣蕎麥試驗(yàn)基地發(fā)現(xiàn)一種發(fā)生普遍的病害—蕎麥褐斑病。發(fā)病始于6月中下旬開(kāi)始，7—8月尤為嚴(yán)重，植株發(fā)病率可達(dá)10%左右，給蕎麥生產(chǎn)造成了嚴(yán)重影響?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】通過(guò)對(duì)云南省蕎麥褐斑病樣品進(jìn)行組織分離、病原菌接種及rDNA-ITS序列分析，明確病原菌的種類，并分析培養(yǎng)基、溫度、光照等對(duì)病原菌生長(zhǎng)的影響，從而為蕎麥褐斑病的發(fā)病規(guī)律、防控技術(shù)及蕎麥抗病育種研究提供有一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 供試蕎麥樣品

在云南省會(huì)澤縣馬路鄉(xiāng)蕎麥試驗(yàn)種植區(qū)采集感染褐斑病的蕎麥葉片，記錄及拍照葉片癥狀，將病葉帶回實(shí)驗(yàn)室于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 蕎麥褐斑病病原菌的分離

采用真菌組織分離法，取蕎麥褐斑病樣品剪大小約5 mm × 5 mm的病葉組織，于75%乙醇浸泡10 s，再用2%次氯酸鈉浸泡5 min，ddH2O沖洗3遍，于滅菌吸水紙上晾干，接種于PDA培養(yǎng)基，25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，將純化菌株移植于PDA斜面25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d，并于4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 蕎麥褐斑病菌株的致病性

將分離純化得到的菌株，接種到活體蕎麥植株進(jìn)行致病性測(cè)定。菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，用打孔器(直徑 6 mm) 打取菌塊，用滅菌接種針輕輕針刺健康葉片3針制造傷口，接種菌塊于傷口處，傷口處接種PDA為對(duì)照(CK)，菌株和CK均接種15個(gè)健康蕎麥葉片，接種24 h后移去菌塊，觀察接種葉片發(fā)病情況。

1.4 蕎麥褐斑病菌株的鑒定

1.4.1 菌株的菌落及孢子形態(tài) 將菌株接種于PDA培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫條件下全黑暗培養(yǎng)3～7 d后，觀察菌落的大小、顏色、形狀等特征。挑取少量的菌絲于載玻片上，于DM400型顯微鏡下觀察分生孢子的大小、生長(zhǎng)方式、形狀等特征。

1.4.2 菌株的rDNA-ITS序列分析 將菌株接種于PDA培養(yǎng)基，置于25 ℃恒溫條件下全黑暗培養(yǎng)3 d，采用真菌基因組DNA提取試劑盒抽提菌絲基因組DNA。采用真菌通用引物ITS1/ITS4進(jìn)行PCR擴(kuò)增[15]，引物由生工生物有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系：ITS1、ITS4各1 μL、菌株DNA 1 μL 、2×MasterMix 12 μL，ddH2O 10 μL，總體積為25 μL 。PCR反應(yīng)條件及DNA片段回收方法參照盧文潔等研究發(fā)表的相關(guān)文獻(xiàn)[9]。菌株rDNA-ITS 序列于NCBI 上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，用MEGA 6.0軟件分析菌株的DNA序列，并構(gòu)建序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.5 蕎麥褐斑病菌株的生物學(xué)特性

1.5.1 溫度對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 取直徑為6 mm的菌塊移植于PDA培養(yǎng)基平板上，分別置于5～35 ℃ 7個(gè)溫度梯度(每個(gè)梯度間隔5 ℃)及28 ℃恒溫條件下全黑暗培養(yǎng)3 d ，每個(gè)溫度處理為5次重復(fù)，測(cè)量菌落直徑采用十字交叉法[9]，測(cè)量方法下同。

1.5.2 菌株的致死溫度 取直徑為6 mm的菌塊于裝有2 mL ddH2O的無(wú)菌試管中，置于35～65 ℃共7個(gè)溫度梯度(每個(gè)梯度間隔5 ℃)的水浴鍋中加熱，每個(gè)溫度加熱10 min，取出冷卻后，將菌塊晾干，接種于PDA培養(yǎng)基平板上，每個(gè)水浴溫度處理為5次重復(fù)，25 ℃恒溫條件下全黑暗培養(yǎng)3 d ，觀察菌絲的生長(zhǎng)情況。

1.5.3 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 取直徑為6 mm的菌塊，分別置于馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基、馬鈴薯蔗糖瓊脂(PSA)培養(yǎng)基、查彼(Czapek)培養(yǎng)基、胡蘿卜瓊脂(CA)培養(yǎng)基、燕麥片瓊脂(OMA)培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂(SDA)培養(yǎng)基、玉米粉瓊脂(CMA)培養(yǎng)基上，以WA培養(yǎng)基作為對(duì)照，每個(gè)處理為5 次重復(fù)，25 ℃ 恒溫條件下全黑暗培養(yǎng)3 d，測(cè)量菌落直徑。

1.5.4 光照對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 取直徑為6 mm的菌塊移植于PDA培養(yǎng)基平板上，分別于全天光照、光暗12 h交替、全天黑暗3種不同的光照條件下，每個(gè)光照處理為5次重復(fù)，25 ℃恒溫條件下培養(yǎng)3 d，測(cè)量菌落直徑。

1.5.5 pH 對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 采用鹽酸溶液(1 mol/L)和氫氧化鈉溶液(1 mol/L)調(diào)節(jié)PDA 培養(yǎng)基溶液的pH至4～12共9 個(gè)梯度(每個(gè)梯度pH為1)，取直徑為6 mm的菌塊移植于不同pH 得PDA培養(yǎng)基平板上，每個(gè)pH處理為5次重復(fù)，25 ℃恒溫條件下全黑暗培養(yǎng)3 d ，測(cè)量菌落直徑。

1.5.6 碳源、氮源對(duì)菌株菌絲生長(zhǎng)的影響 以PDA培養(yǎng)基(葡萄糖的碳元素含量為2%)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用7種碳源等質(zhì)量置換PDA培養(yǎng)基中的碳元素，7種碳源分別為木糖、蔗糖、果糖、可溶性淀粉、乳糖、甘露糖、麥芽糖，以不加碳源的PA培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)；以加入硝酸鉀的PDA培養(yǎng)基(硝酸鉀氮元素含量為0.2%)為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，分別用8種氮源等質(zhì)量置換PDA+硝酸鉀培養(yǎng)基中的氮元素，8種氮源分別為苯丙氨酸、氯化銨、牛肉浸膏、硫酸銨、硝酸鈉、蛋白胨、胱氨酸、尿素，以不加氮源的PDA培養(yǎng)基為對(duì)照(CK)。取直徑為6 mm的菌塊，分別移植于含有不同碳源、氮源的培養(yǎng)基上，每個(gè)碳源、氮源處理均為5 次重復(fù)，25 ℃恒溫條件下全黑暗培養(yǎng)3 d ，測(cè)量菌落直徑。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用Excel、SPSS及復(fù)極差法[9]對(duì)生物學(xué)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥褐斑病癥狀及菌株致病性

在蕎麥大田葉片感染發(fā)病初期，葉部出現(xiàn)不規(guī)則退綠癥狀，隨著病情發(fā)展，葉部出現(xiàn)近圓形或不規(guī)則淡黃色至褐色病斑，邊緣赤褐色，病斑周圍呈現(xiàn)退綠色暈圈(圖1-A,1-B)。病情嚴(yán)重時(shí)，病斑幾乎布滿葉片，高溫高濕條件下，葉片干枯脫落。菌株S62R5接種蕎麥健康葉片7 d 后，接種點(diǎn)可見(jiàn)黃色近圓形病斑，病斑邊緣顏色較深，病斑周圍呈現(xiàn)退綠暈圈，接種癥狀與蕎麥田間自然發(fā)病相似(圖1-C)，菌株致病率高達(dá)98.5%。PDA培養(yǎng)基對(duì)照接種葉片未出現(xiàn)癥狀(圖1-D)。接種發(fā)病葉片經(jīng)再次分離、純化獲得的分離株與接種試驗(yàn)所用的菌株在菌落形態(tài)及分生孢子的形態(tài)特征上完全一致，證明接種分離株即為蕎麥褐斑病的致病菌。

2.2 菌株的形態(tài)學(xué)鑒定

菌株S62R5 的菌落疏松，前期菌絲為白色絨毛狀，氣生菌絲生長(zhǎng)迅速，后期菌落由白色逐漸變?yōu)榛疑?，最后變?yōu)楹谏?圖2-A,2-B))。分生孢子梗單生，多數(shù)直立，具隔膜。分生孢子扁球形或球形，單胞、光滑，生于無(wú)色透明的瓶狀細(xì)胞上，分生孢子初期呈黃褐色(圖2-C,2-D)，后期為黑色(圖2-E,2-F)，大小為10～15 μm，根據(jù)形態(tài)特征初步將菌株S62R5鑒定為半知菌亞門黑孢霉屬(Nigrospora) 真菌[16]。

2.3 菌株的分子鑒定

以菌株S62R5的DNA為模板，采用引物ITS1/ ITS4進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，測(cè)序獲得553 bp (KR002908.1) 的rDNA-ITS序列。該序列通過(guò)在NCBI GenBank上進(jìn)行BLAST 比對(duì)，選取球黑孢菌(Nigrosporasphaerica)、稻黑孢(Nigrosporaoryzae)、海南黑尾孢菌(Nigrosporahainanensis)、巴氏黑孢菌(Nigrosporabambusae)等菌株的序列進(jìn)行多重比較及系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分析，菌株S62R5的rDNA-ITS 序列與稻黑孢菌株R11F1(EU529994.1)的同源性達(dá)100%， 與稻黑孢遺傳距離最小， 聚為一支，且支持率達(dá)99%(圖3)，結(jié)合菌株S62R5的形態(tài)特征， 最終將菌株鑒定為稻黑孢(Nigrosporaoryzae)。

2.4 菌株的生物學(xué)特性

2.4.1 溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌絲在25、28 ℃溫度下的平均菌落直徑分別為85.03 、84.44 mm，二者處理間無(wú)顯著差異，且平均菌落直徑明顯高于其他溫度處理，表明菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25、28 ℃。其次在30 ℃溫度下菌絲生長(zhǎng)較快，平均菌落直徑為77.29 mm，在10、15 、35 ℃溫度下菌絲生長(zhǎng)緩慢，平均菌落直徑分別為20.57、24.14、25.87 mm，在5 ℃下菌絲生長(zhǎng)極為緩慢(圖4)。

菌塊經(jīng)40、45、50、55、60、65 ℃水浴處理10 min后，移植于PDA培養(yǎng)基平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)，經(jīng)觀察發(fā)現(xiàn)，40、45、50 ℃水浴處理的菌塊培養(yǎng)5 d后均能長(zhǎng)出菌絲，55、60、65 ℃水浴處理的菌塊培養(yǎng)10 d后未長(zhǎng)出菌絲；將菌塊分別于51、52、53、54 ℃水浴處理10 min，移植于PDA培養(yǎng)基平板上25 ℃恒溫培養(yǎng)， 51、52 ℃水浴處理的菌塊培養(yǎng)5 d后長(zhǎng)出菌絲，53、54 ℃水浴處理的菌塊培養(yǎng)10 d后未長(zhǎng)出菌絲，由此可知，菌絲的致死溫度為53 ℃，10 min。

A～B: 田間癥狀；C:接種癥狀; D:對(duì)照A-B: Symptom in the field; C:Symptom on inoculated leaves; D:Control圖1 蕎麥褐斑病癥狀Fig.1 Symptoms of buckwheat brown spot

A：PDA正面菌落形態(tài)；B：PDA背面菌落形態(tài)；C～D：未成熟分生孢子；E～F：成熟分生孢子A：Colony morphology of the positive side on the PDA plate；B：Colony morphology of the contrary side on the PDA plate；C-D：Immature conidia；E-F：Mature conidia 圖2 菌株S62R5的菌落及分生孢子形態(tài)特征Fig.2 Colony and conidia morphological characteristics of strain S62R5

圖3 菌株S62R5rDNA-ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree analysis of strain S62R5 of rDNA-ITS sequence

2.4.2 培養(yǎng)基對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌絲在PDA和PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)快，平均菌落直徑分別為84.03、80.53 mm，二者間無(wú)顯著差異，其次菌絲在CA、CMA、OMA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，平均菌落直徑分別為60.74、58.55、57.84 mm，3種處理與PDA、PSA有顯著差異，但三者間無(wú)顯著差異，在Czapek、SDA培養(yǎng)基上平均菌落直徑分別為52.90、50.01 mm(圖5)。菌絲在PDA培養(yǎng)基和PSA培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，且菌落致密，表明PDA培養(yǎng)基和PSA培養(yǎng)基最適生長(zhǎng)。

2.4.3 光照條件對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌絲的平均菌落直徑在全天光照、光暗交替(12 h交替)、全天黑暗3種條件下依次為66.09、63.90、70.0 2 mm，3種處理間無(wú)顯著差異(圖6)，且3種條件下菌絲的

圖中大、小寫(xiě)字母分別表示在0.01和0.05水平的差異顯著性，下同The capital and lowercase letters indicated significant difference at 0.01 and 0.05 levels, respectively, the same as below圖4 溫度對(duì)菌株S62R5菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.4 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different temperatures

平均生長(zhǎng)速率分別為22.03、21.30、23.34 mm/d，菌絲在全黑暗條件下的生長(zhǎng)速率比全光照和光暗交替條件下的生長(zhǎng)速率稍高，由此可見(jiàn)光照對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響較小。

2.4.4 pH對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌絲的平均菌落直徑從pH 4至pH 12依次為47.50、61.00、70.29、65.00、59.32、60.14、46.53、51.41、31.92 mm，各處理間差異顯著。菌絲在9種不同的pH條件下均能生長(zhǎng)，但在pH=12時(shí)菌絲生長(zhǎng)極為緩慢，菌絲在pH=6時(shí)生長(zhǎng)最快，平均生長(zhǎng)速率為23.43 mm/d，菌落致密，表明pH=6最適菌絲生長(zhǎng)(圖7)，因此菌絲在偏酸性的條件下適宜生長(zhǎng)。

圖5 培養(yǎng)基對(duì)菌株S62R5菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.5 Effects of different media on mycelia growth of strain S62R5

圖6 光照對(duì)菌株S62R5菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.6 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different illumination conditions

圖7 pH值對(duì)菌株S62R5菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.7 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different pH values

2.4.5 碳源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌絲在PDA(葡萄糖為碳源)培養(yǎng)基、PSA(蔗糖為碳源)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最快，平均菌落直徑分別為84.03、80.53 mm，二者間無(wú)顯著差異，并顯著高于其他處理，其次在以可溶性淀粉和果糖為碳源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，平均菌落直徑分別為67.34 、64.13 mm，在以木糖為碳源的培養(yǎng)基上菌絲生長(zhǎng)最慢，平均菌落直徑為17.45 mm(圖8)。

2.4.6 氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 菌絲在PDA+氯化銨培養(yǎng)基(以氯化銨為氮源)上生長(zhǎng)最快，平均菌落直徑為81.73 mm；其次在以硫酸銨、硝酸鈉為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較快，平均菌落直徑分別為78.56、74.36 mm，在以尿素為氮源的培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最慢，平均菌落直徑為18.47 mm，菌絲生長(zhǎng)速度顯著低于其他處理，表明尿素明顯抑制菌絲生長(zhǎng)(圖9)。

圖8 碳源對(duì)菌株S62R5菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.8 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different carbon sources

圖9 氮源對(duì)菌株S62R5菌絲生長(zhǎng)的影響Fig.9 Effects of mycelia growth of strain S62R5 by different nitrogen sources

3 討 論

稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)屬半知菌亞門絲孢綱絲孢目暗色孢科黑孢霉屬真菌[16]，是一種寄主范圍廣泛的病原菌。該病原菌能夠引起棉花腐爛病[17]、草地早熟禾葉斑病[18]、蘆薈葉斑病[19-20]、水稻褐斑病[21]、水稻圓斑病[22]、水稻穗部病害[23-25]、西瓜葉斑病[26]、獼猴桃褐斑病[27]、藍(lán)莓葉斑病[28]、鐵皮石斛葉斑病[29]、毛地黃葉斑病[30]等多種植物病害。

通過(guò)對(duì)病原菌進(jìn)行分離純化、致病性測(cè)定、孢子形態(tài)觀察及DNA序列分析，引起蕎麥褐斑病的病原鑒定為稻黑孢菌(Nigrosporaoryzae)。觀察菌株S62R5的菌落和孢子形態(tài)，菌落的形態(tài)、顏色及分生孢子的著生方式、形狀、顏色等與臺(tái)蓮梅等[23]研究報(bào)道的水稻穗褐變病病原菌(N.oryzae)基本一致。

對(duì)生物學(xué)特性研究表明，菌株S62R5的菌絲在溫度10～35 ℃均能生長(zhǎng)，在5 ℃時(shí)菌絲基本停滯生長(zhǎng)，菌絲利用率最高的碳源為葡萄糖和蔗糖，費(fèi)丹等[25]對(duì)水稻穗腐病病原菌(N.oryzae)的研究也有此結(jié)果。菌株S62R5的菌絲在pH=6微偏酸性條件下生長(zhǎng)最快，李茂青等[31]研究稻黑孢(N.oryzae)在pH=5條件下生長(zhǎng)也有相似結(jié)果。菌株S62R5的菌絲利用率最高的氮源為氯化銨，與費(fèi)丹等[25]對(duì)稻黑孢(N.oryzae)氮源利用率的研究結(jié)果存在差異。光照對(duì)菌株S62R5的菌絲生長(zhǎng)影響較小，與李茂青等[31]對(duì)稻黑孢(N.oryzae)的研究結(jié)果有差異。

對(duì)蕎麥褐斑病的防治，可通過(guò)合理的栽培措施，促使植株生長(zhǎng)健壯，抵抗病菌侵染。在病害發(fā)病初期，可施用石灰改變病原菌的生存環(huán)境，抑制病害的擴(kuò)展蔓延。作物收獲后，利用病原菌不耐高溫的特性，收集田間病殘葉，集中高溫處理，以減少次年的病菌初侵染源。

4 結(jié) 論

通過(guò)鑒定病原菌，明確了引起云南省蕎麥褐斑病的病原菌為稻黑孢菌(N.oryzae)。研究生物學(xué)特性表明，該病原菌菌絲生長(zhǎng)的最適培養(yǎng)基為PDA和PSA，最適溫度為25和28 ℃，致死溫度為53 ℃，10 min，最適pH為6；最適碳源為葡萄糖和蔗糖，最適氮源為氯化銨。因此，研究結(jié)果可為生產(chǎn)上有效防控該病菌提供科學(xué)依據(jù)。