馬玉蘭，曹 萍,2,3，馬志杰,3*，陳生梅,2,3，李瑞哲,2,3，劉書杰，郭東風(fēng)

(1.青海大學(xué)畜牧獸醫(yī)科學(xué)院，西寧 810016；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部青藏高原畜禽遺傳育種重點實驗室，西寧 810016；3.青海省高原家畜遺傳資源保護與創(chuàng)新利用重點實驗室，西寧 810016；4.青海省格爾木市唐古拉山鎮(zhèn)獸醫(yī)站，青海 格爾木 816099)

牦牛(Bosgrunniens)是青藏高原及其毗鄰高地的特有牛種，為當(dāng)?shù)啬撩裉峁┤?、奶、毛、絨、皮和燃料等生活必需品，對青藏高原多元民族文化的發(fā)展起著至關(guān)重要的作用[1]。唐古拉山鎮(zhèn)位于青海省西南部，其西、南與西藏那曲藏族自治州毗鄰，東、北隔馬蘭馬拉山與當(dāng)曲和玉樹藏族自治州的治多、雜多兩縣接壤，該地區(qū)地勢高峻,海拔4 500 m以上,屬三江源自然保護區(qū)，年均氣溫-2.8 ℃[2]。據(jù)研究報道[3]，唐古拉山牦牛群體中含野血牦牛的比例高達25%以上，因此，唐古拉山牦牛具有抗逆性強、生長發(fā)育速度快、產(chǎn)肉量高等特點。據(jù)統(tǒng)計結(jié)果顯示[4]，唐古拉山鎮(zhèn)共有草場721.13 hm2，牦牛2萬多頭，其中能繁母畜占50%以上，擁有豐富的牦牛遺傳資源。

線粒體DNA(mitochondrial DNA, mtDNA)具有結(jié)構(gòu)簡單、突變率高和不容易發(fā)生重組等特點，因此被廣泛運用于哺乳動物母系遺傳多樣性、起源進化、群體結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育等研究[5]。當(dāng)前，基于mtDNA D-loop區(qū)、Cyt b和16S rRNA等基因以及mtDNA全序列核苷酸變異對野牦牛及部分家牦牛品種(群體)的母系遺傳多樣性、群體結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系等前人已做了大量的研究。賴松家等[6]、郭松長等[7]、宋喬喬等[8]、Yue X P等[9]、Li G Z等[10]、李靜等[11]基于mtDNA D-loop序列變異對我國多個家、野牦牛品種(群體)分析表明，大多數(shù)牦牛品種(群體)都存在2個高度分化的母系支系且具有豐富的母系遺傳多樣性，提示牦牛存在2個母系起源。與此同時，Wang Z F等[12]、Wang X D等[13]、Ma Z J等[14]和李廣禎等[15]對我國部分牦牛品種(群體)mtDNA全序列遺傳變異的分析表明，家、野牦牛品種(群體)具有豐富的母系遺傳多樣性，但系統(tǒng)發(fā)育分析確定了3個大的母系支系，提示牦牛有3個母系起源。然而,當(dāng)前尚未見對青海省唐古拉山牦牛群體母系遺傳方面的研究報道。本研究對唐古拉山牦牛群體mtDNA D-loop區(qū)序列變異進行母系遺傳多樣性分析，以揭示其群體遺傳結(jié)構(gòu)和系統(tǒng)發(fā)育分析，明確唐古拉山牦牛品種分子遺傳多樣性、遺傳關(guān)系及分化狀況，為開展牦牛分子遺傳資源的評估、保護與利用以及牦牛的品種培育和改良提供基礎(chǔ)材料。

1 材料與方法

1.1 采樣與基因組DNA提取

本實驗采集了來自青海省海西蒙古族藏族自治州格爾木市唐古拉山鎮(zhèn)52頭牦牛的頸靜脈血，ACD抗凝后帶回實驗室。采樣采取隨機抽樣法，樣本采集前詢問牧戶、查閱牦牛群體的系譜記錄，確保樣品具有代表性。使用基因組DNA試劑盒(北京艾德萊生物科技有限公司)提取基因組DNA后，雙重檢測DNA濃度和純度后-20 ℃保存?zhèn)溆谩！?/p>

1.2 引物合成、PCR擴增與測序

參照先前在野牦牛[14]中的研究報道，合成一對引物用以擴增唐古拉山牦牛的mtDNA D-loop區(qū)序列，引物由上海生工生物工程有限公司合成，其中包括上游引物(PF)：5′-CTACAGTCTCACCGTCAACC-3′和下游引物(PR)為5′-GGGGTGTAGATGCTTGC-3′。

PCR擴增體系(25 μL)：超純水9.5 μL，2xPremix 12.5 μL，基因組DNA和上、下游引物各1 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，31個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。用2.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，后送PCR純化產(chǎn)物在北京擎科生物科技有限公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

用BioEdit 7.2.5[16]和DnaSP 5.10.01[17]軟件進行核苷酸多序列比對分析，后確定唐古拉山牦牛群體的核苷酸序列多態(tài)位點。Arlequin 3.5.2.2[18]軟件用來計算其單倍型多樣度和核苷酸多樣度大小，以揭示群體的母系遺傳多樣性水平。使用MEGA 5.05[19]軟件基于鄰接法(neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹以探究唐古拉山牦牛單倍型(組)間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，用以揭示其母系遺傳背景。

2 結(jié)果與分析

2.1 唐古拉牦牛mtDNA D-loop區(qū)序列變異分析

52頭唐古拉山牦牛619 bp mtDNA D-loop區(qū)序列分析顯示，其A+T含量為58.57%，G+C含量為41.43%，存在明顯的核苷酸組成偏倚性。序列比對分析排除2處插入(缺失)位點后，共檢測到31處多態(tài)位點；在31處多態(tài)位點中，包括5處單一多態(tài)位點(即85、174、254、255和445位點)和26處簡約信息位點(即21、60、67、99、114、120、175、182、183、193、202、219、222、224、235、236、237、243、252、260、282、317、318、324、427和465位點)(圖1)。研究確定了13種單倍型，其中20個個體共享H1單倍型，其為優(yōu)勢單倍型。6個個體共享H7和H9單倍型，4個個體共享H2和H10單倍型，3個個體共享H3和H11單倍型，其余單倍型均由1個個體共享。

注：N表示共享同一種單倍型的個體數(shù)；“.”表示與H1單倍型序列中的核苷酸相同；Hg表示單倍型組類型。

2.2 唐古拉山牦牛的母系遺傳多樣性分析

多序列比對分析計算結(jié)果表明，唐古拉山牦牛群體mtDNA D-loop區(qū)核苷酸多樣度和單倍型多樣度分別為0.007±0.004和0.821±0.043。與已報道的野牦牛及我國其他18家牦牛品種相應(yīng)遺傳多樣性指數(shù)值相比(表1)，唐古拉山牦牛群體的遺傳多樣性指數(shù)值均較低，表明其母系遺傳多樣性水平較低。

表1 唐古拉山牦牛與我國其他19個家、野牦牛品種(群體)母系遺傳多樣性指數(shù)值比較

2.3 唐古拉山牦牛的系統(tǒng)發(fā)育分析

以先前報道中代表牦牛3個母系支系的D-loop區(qū)序列(即支系I(GenBank No.：FJ548844)、支系II(GenBank No.：FJ548843)和支系III(GenBank No.：DQ139202))作為參考序列[14]，并將美洲野牛(Bison bison)的D-loop序列(GenBank No：EU177871)作為外群，NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示：唐古拉山牦牛的13種單倍型序列和支系I、支系II的2條參考序列分別聚在一起，形成2個大的母系遺傳分支(圖2)，其中支系Ⅰ包括單倍型H1、H2、H6、H7、H8、H11、H12、H13、H10、H4、H5和H9，占92.3%；而支系Ⅱ包括單倍型H3，占7.6%。13種單倍型屬于4種單倍型組，分別為A、B、D和E(圖2)，且分別占69.2%、15.3%、7.6%和7.7%；其中A單倍型組包括9種單倍型(即H1、H2、H6、H7、H8、H11、H12、H13和H10單倍型)，B單倍型組只有2種單倍型(即H5和H9單倍型)，而D和E單倍型組分別包括單倍型H3和H4。

圖2 唐古拉山牦牛系統(tǒng)發(fā)育分析

3 討 論

遺傳多樣性能夠有效反映動物群體遺傳變異的豐富程度，單倍型多樣度和核苷酸多樣度是衡量動物分子遺傳多樣性水平的重要指標[28]。先前的研究表明，野牦牛及我國多數(shù)家牦牛品種都具有豐富的母系遺傳多樣性，其中野牦牛群體的單倍型多樣度在0.957～0.967之間[9,12,14,27]，而家牦牛品種的單倍型多樣度在0.621～1.000[6-8,10-11,13,19-26]之間。在本研究中，唐古拉山牦牛群體的核苷酸多樣度值和單倍型多樣度分別為0.007±0.004和0.821±0.043。與我國其他家牦牛品種(群體)(即天祝、甘南、九龍、類烏齊、帕里、斯布、昌臺、金川、麥洼、木里、中甸、巴州、青海高原、環(huán)湖、大通、雪多、玉樹、帕米爾)和野牦牛相比[6-14,19-27]，唐古拉山牦牛的群體核苷酸多樣度和單倍型多樣度值均較低，表明唐古拉山牦牛群體具有較貧乏的母系遺傳變異，遺傳多樣性水平較低。究其原因，可能與該群體所處的生存環(huán)境、選育歷史及選擇程度、遺傳漂變等因素相關(guān)，究其原因有待今后作進一步深入探究。

牦牛的系統(tǒng)發(fā)育研究可以明確其進化歷史和遺傳背景，有利于牦牛遺傳資源的保護和開發(fā)利用[14]。先前多數(shù)針對我國野牦牛及家牦牛品種(群體)的系統(tǒng)發(fā)育研究顯示：牦牛擁有2個母系支系，推測可能有2個母系起源[6-8,10-11,13,19-26]。然而，近年來部分研究者如Wang Z F等[12]、Wang X D等[13]和Ma Z J等[14]基于線粒體基因組對我國家、野牦牛的系統(tǒng)發(fā)育分析表明，牦牛擁有3個母系支系，其中共享第Ⅰ、Ⅱ支系的家、野牦牛個體較多，而第Ⅲ支系中僅有少量野牦牛和雪多、格爾木牦牛個體的存在，推測牦牛有3個母系起源。在本研究中，唐古拉山牦牛的13種單倍型分布在A、B、D和E 4種單倍型組中，所占比例依次為69.2%、15.3%、7.6%和7.6%，說明A單倍型組是其優(yōu)勢單倍型組。同時，這13種單倍型聚為2個大的母系支系，故推測唐古拉山牦牛有2個母系起源，這與野牦牛及多數(shù)家牦牛品種(群體)的研究結(jié)果基本一致。

4 結(jié) 論

唐古拉山牦牛群體核苷酸多樣度為0.007±0.004，單倍型多樣度為0.821±0.043，其母系遺傳多樣性水平較低，其中單倍型H2為優(yōu)勢單倍型，A單倍型組是其優(yōu)勢單倍型組，由2個母系支系組成，推測其可能有2個母系起源。