覃新云　劉桂秀　呂其壯　鄧家華　覃婷　龍金桃　陳旭健

關(guān)鍵詞： 豬繁殖與呼吸綜合征病毒;ORF5基因;遺傳進(jìn)化分析;重組分析

中圖分類號(hào)： S852.65 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： A 文章編號(hào)： 1000-4440（2022）01-0285-04

Key words： porcine reproductive and respiratory syndrome virus;ORF5 gene;genetic evolutionary analysis;recombination analysis

豬繁殖與呼吸綜合征（PRRS），俗稱“豬藍(lán)耳病”，是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）引起的一種急性、具有高度傳染性疾病，其主要臨床癥狀表現(xiàn)為持續(xù)高熱、母豬繁殖障礙以及仔豬呼吸困難和高死亡率[1-2]。PRRS最早發(fā)現(xiàn)于美國(guó)的北卡羅來(lái)納州，隨后世界各國(guó)陸續(xù)報(bào)道，中國(guó)于1996年首次報(bào)道該病。2006年出現(xiàn)了由高致病性PRRSV引起的“豬無(wú)名高熱癥”疫情的大面積暴發(fā)和流行，導(dǎo)致豬群高發(fā)病率及高死亡率，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3]。

PRRSV是一種單股正鏈RNA病毒，其基因組長(zhǎng)度約14 500 bp，編碼區(qū)至少包括10個(gè)開(kāi)放閱讀框（ORF）[4]。其中，ORF5基因可以編碼病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白GP5，該蛋白質(zhì)是一種糖基化囊膜蛋白質(zhì)，也是PRRSV 誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體的主要抗原[5]。研究結(jié)果證實(shí)，GP5蛋白是PRRSV中最容易發(fā)生變異的蛋白質(zhì)之一，常被用作評(píng)價(jià)PRRSV病毒是否發(fā)生變異的主要依據(jù)之一，ORF5基因也因此成為序列分析的典型基因，可作為PRRSV基因分型的重要依據(jù)，在PRRSV流行性株遺傳變異研究中發(fā)揮重要作用[6]。當(dāng)前在中國(guó)境內(nèi)的PRRSV可分為2個(gè)血清型，即PRRSV2 （以VR-2332毒株為代表）和PRRSV1 （以Lelystadvirus毒株為代表），其中PRRSV2又可分為5個(gè)基因亞型（lineage 1、lineage 3、lineage 5、lineage 8、lineage 9），lineage 1包含NADC30、JL580等毒株;lineage 3包含QYYZ、GM2等近年來(lái)在華南地區(qū)流行的低致病毒株;lineage 5包含PRRSV2代表毒株VR-2332;lineage 8包含以TJ、JXA1、TA-12等高致病毒株和以CH-1a等為代表的經(jīng)典毒株及2011年于新疆地區(qū)發(fā)現(xiàn)的lineage 9[7-11]。

為研究中國(guó)近年來(lái)PRRSV流行毒株和變異特征，本研究從GenBank中隨機(jī)取回分離于中國(guó)2010-2019年的877株P(guān)RRSV的ORF5基因序列，并對(duì)其進(jìn)行遺傳進(jìn)化和重組分析，以期為監(jiān)測(cè)中國(guó)豬群中PRRSV的變異情況和防控PRRS提供參考。

1 材料與方法

1.1 PRRSV ORF5基因序列的收集

從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中隨機(jī)取回877株2010-2019年分離于中國(guó)29個(gè)省、市和自治區(qū)的PRRSV的ORF5全基因序列作為分析樣本，同時(shí)，收集24株各PRRSV基因亞型的代表毒株和22株鄰國(guó)毒株作為參考毒株。為了更好地呈現(xiàn)分析結(jié)果，在877株毒株中隨機(jī)選取98株代表毒株用于后續(xù)分析。

1.2 PRRSV ORF5基因的系統(tǒng)發(fā)育分析

采用Neighbour-joining （NJ）方法，參照文獻(xiàn)[12]進(jìn)行參數(shù)設(shè)置，利用軟件MEGA v.10.0.5繪制本研究獲得的877株P(guān)RRSV的ORF5基因序列與參考毒株ORF5基因序列的分子進(jìn)化樹(shù)，應(yīng)用徐錚等[13]提出的基因分型方法對(duì)毒株進(jìn)行類群劃分并分析其進(jìn)化關(guān)系及各基因亞型在中國(guó)的流行情況。

1.3 PRRSV ORF5基因序列分析

利用DNAstar中的MegAlign程序?qū)⑹占腛RF5基因序列與參考毒株的ORF5基因序列進(jìn)行核苷酸同源性分析，并對(duì)ORF5基因推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析，其中以PRRSV2代表毒株VR-2332為氨基酸序列比對(duì)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)毒株[6，8]。

1.4 PRRSV ORF5基因的重組分析

為研究所收集毒株之間的基因重組情況，利用軟件RDP4.0中的7種檢測(cè)算法[RDP （R）、MaxChi （M）、BootScan （B）、GeneConv （G）、3seq （T）、SiScan （S）和Chimaera （C）]對(duì)獲得的ORF5基因進(jìn)行重組分析，并參照文獻(xiàn)[14-15]中的判定依據(jù)對(duì)檢測(cè)出的重組事件進(jìn)行界定。

2 結(jié)果與分析

2.1 PRRSV ORF5基因的核苷酸同源性比對(duì)及遺傳演化分析

分析結(jié)果顯示，PRRSV ORF5基因序列的長(zhǎng)度為600 bp、603 bp和606 bp，核苷酸同源性為59.6%～100.0%，與國(guó)內(nèi)外46株參考毒株的ORF5基因同源性為59.4%～100.0%。ORF5基因進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，877株P(guān)RRSV毒株中有15株為PRRSV1，862株為PRRSV2毒株。PRRSV2又可進(jìn)一步劃分為多個(gè)不同基因亞型，其中高致病性毒株（亞型1）有517株、經(jīng)典毒株（亞型2）有74株、廣東新變異毒株（亞型3）有62株、JXA-R疫苗樣毒株（亞型4）有29株、NADC30/NADC34樣毒株（亞型5）有115株以及分離于新疆地區(qū)的毒株（亞型9）有6株。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，除上述6種已發(fā)表的基因亞型外，又出現(xiàn)幾個(gè)與之明顯不同的分支，將其分別命名為亞型6（32株）、亞型7（4株）、亞型8（23株）。

2.2 不同基因亞型PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列對(duì)比

根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，當(dāng)前PRRSV2 GP5蛋白中存在1個(gè)信號(hào)肽、2個(gè)高變區(qū)（HVR1和HVR2）、3個(gè)跨膜區(qū)（TM1、TM2和TM3）以及5個(gè)表位結(jié)構(gòu)（DE、NE、T1、T2、TM3），另有位于第13位和151位氨基酸位點(diǎn)的2個(gè)毒力相關(guān)位點(diǎn)[6，14-15]。本試驗(yàn)從PRRSV1和PRRSV2毒株1～5基因亞型中隨機(jī)選取代表毒株與本試驗(yàn)獲得的98株代表性分析毒株的GP5蛋白氨基酸序列進(jìn)行對(duì)比分析。結(jié)果表明，中國(guó)PRRSV GP5蛋白的氨基酸序列中普遍存在變異。相比于PRRSV2的代表毒株VR-2332、PRRSV1毒株和亞型7均在第33～34位氨基酸位點(diǎn)處插入2個(gè)氨基酸;相比于PRRSV1的代表毒株，亞型6和亞型7分別在第34位氨基酸位點(diǎn)、58位氨基酸位點(diǎn)處出現(xiàn)1個(gè)氨基酸缺失。而Genotype 1和Subgenotype 7毒株均在33～34位氨基酸位點(diǎn)處插入2個(gè)氨基酸，其余的突變主要表現(xiàn)為各氨基酸位點(diǎn)的點(diǎn)突變。

2.3 PRRSV ORF5基因的重組分析

重組分析共檢測(cè)到11個(gè)重組事件，其中，2個(gè)是明確的重組事件，9個(gè)是潛在的重組事件[16-18]。在明確的重組事件中，重組事件2的重組體是毒株MH422060（NCBI登錄號(hào)：HLJ/HEB/2016/1031b），其主要親本是毒株KX815428（NCBI登錄號(hào)：15SC3），次要親本是毒株MK450614（NCBI登錄號(hào)：2018113Zhangshu6），重組區(qū)域大約發(fā)生在ORF5基因序列的270～570 bp。

3 討論

近年來(lái)，中國(guó)陸續(xù)報(bào)道新的突變毒株，使得中國(guó)的PRRSV流行毒株更加多樣化，變異進(jìn)程加快，防控更加復(fù)雜化[16，19-21]。雖然中國(guó)已采取疫苗免疫的方法進(jìn)行防控，但高致病性毒株減毒活疫苗的無(wú)序使用造成減毒活疫苗病毒的大量傳播，使得PRRS仍然是嚴(yán)重危害中國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的重要疫病之一[22]。通過(guò)對(duì)PRRSV基因組特征和遺傳進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，基于選擇壓力的變化和病毒自身進(jìn)化的需要，PRRSV不斷發(fā)生變異和重組，尤其是在NSP2和GP5? 2個(gè)最易變異的蛋白質(zhì)上面，這給PRRS的防治帶來(lái)了更大困難，因此PRRSV NSP2和ORF5基因也常被用作PRRSV各流行毒株間遺傳進(jìn)化分析的靶基因。

通過(guò)對(duì)新鑒定亞型進(jìn)行地理區(qū)分分析，我們發(fā)現(xiàn)以KY373214、MF133296等為代表的新亞型6主要在廣西、河南、四川、山東等地被檢出;以KC527830、KX815419為代表的新亞型7主要在廣東、浙江等地被檢出;以MK291407、KP998415為代表的新亞型8主要在中國(guó)臺(tái)灣地區(qū)被檢出，且新亞型6與PRRSV1，新亞型7與lineage 3，新亞型8與lineage 1親緣關(guān)系較近，表明目前中國(guó)的 PRRSV呈現(xiàn)多基因亞型并存的局面，且基因亞型的種類有進(jìn)一步增多的趨勢(shì)。

通過(guò)對(duì)PRRSV ORF5基因編碼蛋白質(zhì)的變異分析發(fā)現(xiàn)，其存在多處點(diǎn)突變，個(gè)別基因型或基因亞型還存在堿基插入和缺失的情況，該情況可能導(dǎo)致已有的PRRSV疫苗免疫效果不佳或失敗，更可能導(dǎo)致新型變異毒株的出現(xiàn)。此外，與毒力有關(guān)的第13位和第151位氨基酸位點(diǎn)的比對(duì)結(jié)果顯示，這些毒力位點(diǎn)的突變有可能會(huì)導(dǎo)致PRRSV流行毒株毒力的改變，甚至?xí)霈F(xiàn)新的高致病性毒株。

對(duì)PRRSV ORF5基因的重組分析結(jié)果表明，基于中國(guó)不同地區(qū)的877株P(guān)RRSV ORF5基因共檢測(cè)到11個(gè)可能的重組事件，但是根據(jù)Tomitaka等[18]和Li等 [16]的結(jié)果判斷原則，其中只有2個(gè)是明確的重組事件，雖然重組事件1中重組體MK689083（新亞型6）的主要親本尚不明確，但其次要親本MT036931卻是亞型4，即高致病性PRRSV減毒疫苗毒株或演化毒株。重組事件2中的重組毒株MH422060（亞型2，即經(jīng)典毒株）來(lái)源于KX815428（亞型5，即NADC30-like毒株）和MK450614（亞型1，即高致病性毒株）的重組，這與陳盛楠等[14]和Xie等[19]對(duì)中國(guó)部分地區(qū)PRRSV變異分析的結(jié)果一致，說(shuō)明中國(guó)PRRSV毒株間的重組頻頻發(fā)生是導(dǎo)致新的突變毒株出現(xiàn)的主要原因之一。特別值得注意的是，雖然利用RDP4軟件并未檢測(cè)到PRRSV1與PRRSV2毒株之間存在基因重組的情況，但通過(guò)氨基酸序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，亞型7的第1～56個(gè)氨基酸與PRRSV2代表株高度同源，其第62～201個(gè)氨基酸卻又與PRRSV1代表株高度同源，提示亞型7可能來(lái)源于PRRSV1與PRRSV2毒株間的基因重組。眾所周知，基因重組可能會(huì)導(dǎo)致病毒的抗原表位發(fā)生變化，從而導(dǎo)致病毒發(fā)生變異，這既是病毒發(fā)生變異產(chǎn)生新的亞群的一種方式，也是疫苗特異性免疫失敗的一個(gè)重要原因[23]。對(duì)重組事件進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，所收集877株P(guān)RRSV ORF5基因的重組情況主要分布在廣東、吉林、河南、浙江、江西、黑龍江、安徽等地，其中在河南檢出最多，其次是山東，提示將來(lái)這些地方的PRRSV防控應(yīng)以重組毒株為主。

本研究基于877株中國(guó)2010-2019年 PRRSV ORF5基因序列對(duì)中國(guó)近年來(lái)PRRSV流行毒株的變異情況進(jìn)行了分析，本研究結(jié)果為進(jìn)一步研究中國(guó)PRRSV的遺傳演化，篩選新的疫苗候選株和開(kāi)發(fā)新型疫苗防控PRRS具有重要意義。

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（責(zé)任編輯：陳海霞）

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