陳章言， 張 偉*

(1. 江蘇農牧科技職業(yè)學院，江蘇 泰州 225300； 2.江蘇姜曲海種豬場， 江蘇 泰州 225300)

0 引言

【研究意義】沉默信息調節(jié)蛋白2(Silent information regulator 2, Sir2)是一種依賴于煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(Adenine dinucleotide, NAD)的去乙酰化酶，廣泛存在于從細菌到人類的各種生物體中[1]。SIRT6是Sir2中重要的同源基因之一，SIRT6的缺失導致動物表型出現顯著的改變。因此，系統地開展豬組織中SIRT6蛋白表達和定位檢測分析，對于豐富豬SIRT6基因的功能特征，進而輔助優(yōu)質豬種的分子生物選育具有重要的意義?！厩叭搜芯窟M展】在真核生物中，Sir2調節(jié)轉錄抑制、重組、細胞分裂周期、微管組織和細胞對DNA損傷因子的反應，Sir2也參與調節(jié)衰老的分子機制[2]。Sir2催化域由2個不同的域組成，分別與NAD和乙酰賴氨酸底物結合。除催化域外，真核生物的Sir2還包含可變的氨基和羧基末端延伸，調節(jié)其亞細胞定位和催化活性[3]。哺乳動物有7個Sir2，分別包括SIRT1～SIRT7同源基因，影響衰老和新陳代謝。這些蛋白能夠結合轉錄因子、信號轉導因子、細胞骨架蛋白等多種因子，通過去乙酰化反應或ADP(Adenosine diphosphate)核糖轉移反應參與能量代謝、基因沉默、DNA損傷修復、細胞周期調控和細胞分化等功能過程，是生物學功能十分廣泛并且作用較為重要的酶類[4]。SIRT6是一種與染色質結合的核蛋白。當SIRT6缺陷小鼠出生時表現正常，但約3周后，出現急性退化過程，并在30 d內死亡。這些缺陷包括嚴重的代謝失衡，血清IGF-1水平降低，皮下脂肪完全喪失，淋巴減少，骨質減少，急性低血糖發(fā)作，最終導致死亡[5]。此外，SIRT6可以促進對DNA損傷和氧化應激的抵抗，并抑制小鼠細胞的基因組不穩(wěn)定性，與SIRT6參與基底切除和DNA修復作用有關。最近的研究表明，SIRT6位于人類細胞的端粒，這些細胞中SIRT6的下調改變端粒結構，導致衰老加速和端粒依賴的基因組不穩(wěn)定[6]。【研究切入點】截至目前，有關豬SIRT6蛋白在組織中表達分布的研究較少，且尚未見在蘇姜豬組織中表達的研究報道。【擬解決的關鍵問題】因此，分析蘇姜豬SIRT6組織表達和定位檢測，通過免疫組織化學與ELISA方法，檢測分析蘇姜豬不同臟器組織中SIRT6蛋白的特定表達部位與表達量差異，旨在深入了解SIRT6基因在豬組織中的表達特征及功能，進而為優(yōu)質豬種的選育提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 蘇姜豬 選取體重約100 kg蘇姜豬6頭(公、母各3頭)。

1.1.2 試劑 DAB顯色試劑盒購自武漢博士德生物公司，SIRT6 ELISA試劑盒購自南京奧青生物技術有限公司。

1.2 蘇姜豬樣品采集及處理

屠宰后立即采集豬的心、肝、脾、肺、腎、大腸、小腸、腹部脂肪、背最長肌、腿肌和胃部組織，采出的各組織樣品在生理鹽水中清洗后，用刀片將組織分別切成均勻小塊，置于凍存管快速轉移到-80℃保存。用于酶聯免疫分析(ELISA)，同時采集各組織樣本置于10%中性福爾馬林溶液中固定，為后續(xù)免疫組織化學檢測提供材料。

1.3 不同組織器官中SIRT6細胞學定位檢測

參照HUANG[7]的方法進行蘇姜豬組織樣中SIRT6免疫組織化學檢測分析。首先將石蠟切片脫蠟水化后，PBS清洗2次后，3%H2O2室溫反應5～10 min，蒸餾水洗3次；用pH 6.0的檸檬酸抗原修復液對組織進行修復，100℃修復持續(xù)3 min，PBS洗3次；滴加正常山羊血清封閉液，室溫30 min，甩去多余液體，滴加SIRT6一抗(CST，1∶250)，4℃過夜，PBS洗3次；滴加生物素化山羊抗兔gG，37℃反應30 min，PBC洗3次；滴加試劑SABC，37℃反應30 min，PBS洗3次；DAB顯色，蘇木素復染；脫水、透明、封片、顯微鏡下鏡檢，觀察SIRT6在蘇姜豬不同組織中的分布定位和表達情況。

1.4 不同組織器官中SIRT6蛋白含量測定

將采集的各組織樣從-80℃冰箱取出，加入PBS(pH 7.4)，用勻漿器充分勻漿，離心20 min(2 000～3 000 r/min)。仔細收集上清，用SIRT6 ELISA試劑盒檢測組織中SIRT6蛋白含量。具體操作按試劑盒說明書進行。

1.5 統計分析

2 結果與分析

2.1 SIRT6在蘇姜豬各組織中的細胞學定位

通過免疫組織化學技術，在公、母蘇姜豬的心、肝、脾、肺、腎、胃、大腸、小腸、腹部脂肪、背最長肌、腿肌等組織中均檢測到SIRT6免疫陽性細胞。從圖1可見，SIRT6免疫陽性顆粒主要定位于心臟的心肌細胞、背最長肌和腿肌的肌細胞、胃組織的肌細胞和腺細胞、小腸和大腸的腸腺細胞、脾臟的紅髓區(qū)細胞、肝臟的肝細胞、肺臟的肺泡和支氣管上皮細胞、腎臟的近曲小管和遠曲小管內皮細胞、腹部脂肪的脂細胞等，各器官組織構成細胞的細胞質中。

圖1 SIRT6在蘇姜豬多種組織內的分布

2.2 蘇姜豬各組織中SIRT6蛋白的表達量

由圖2可見，檢測的公、母蘇姜豬11種組織中，均檢測到SIRT6蛋白的表達，且公豬組織中的表達量均高于母豬，SIRT6蛋白在公豬心臟、腹部脂肪及腿肌組織中的表達水平顯著高于母豬。公豬SIRT6蛋白在胃組織中表達量相對最高，顯著高于心、肝、脾、肺和腹脂組織中表達量。對比母豬不同組織中SIRT6蛋白表達量小腸組相對最高，顯著高于肝、脾、腹脂、背最長肌和腿肌組織中表達量，其次是肺組織中SIRT6蛋白表達量相對較高，顯著高于腹脂和腿肌組織中的表達量。

注：不同大小寫字母分別表示公豬和母豬各組織間表達量差異顯著(P<0.05)；*表示同種組織公母豬之間表達量差異顯著(P<0.05)。

3 討論

蘇姜豬是以姜曲海豬、杜洛克豬為基礎種質培育而成的新型國家級瘦肉品種豬，具有產仔數高、耐粗飼、適應性強、肉質優(yōu)良等特點，國家農業(yè)部2016年將其列為主推豬品種。隨著生活水平的提高，消費者對豬肉的品質及色相有了更高的要求。

SIRT家族基因在哺乳動物細胞中廣泛分布，該基因家族的生物學功能及其與畜禽肉質、生長等性狀息息相關。SIRT家族基因是近年來出現的多種生物過程的關鍵調節(jié)劑，調節(jié)細胞代謝、DNA修復、基因表達和線粒體生物學。因此，在機體內環(huán)境平衡中發(fā)揮著關鍵作用，而這些蛋白的缺陷與多種疾病有關，包括癌癥、神經退行性變和衰老[8]。SIRT6是Sirtuin家族NAD依賴性酶的成員之一，在染色質信號和基因組維護中發(fā)揮重要作用。該研究通過ELISA和免疫組織化學方法在蘇姜豬11個組織中均檢測到SIRT6蛋白表達，表明蘇姜豬組織中SIRT6表達具有廣泛性，與在小鼠[9]、牛[10]等觀察結果一致。

SIRT6酶可以預防與衰老相關的疾病，包括代謝疾病和癌癥，并可以延長小鼠壽命。過去幾年的研究表明，SIRT6是一種具有多種底物和催化活性的復合酶，并發(fā)現了SIRT6在維持機體健康方面的新功能。大量研究表明，SIRT6能夠維持基因組穩(wěn)定(在DNA同源重組中發(fā)揮著重要作用)，并能延長機體壽命，因為熱量限制影響SIRT6基因的蛋白表達量[11]。對饑餓小鼠體內的SIRT6基因進行研究發(fā)現，其蛋白穩(wěn)定性和表達量均增高，促進了基因組穩(wěn)定性，進而延長小鼠壽命；同時，SIRT6基因的過表達能降低關節(jié)炎等炎癥的發(fā)生率[11]，同時其是腫瘤抑制基因，能通過增強基因組的穩(wěn)定性而降低機體腫瘤和衰老的發(fā)生率。該研究顯示，蘇姜公豬胃組織中SIRT6蛋白的表達含量相對最高，而在蘇姜母豬的小腸組織中的表達量相對最高，說明蘇姜公豬胃部的穩(wěn)定性最高，抵抗力也最強；而蘇姜母豬的小腸穩(wěn)定性最高，可能更有利于營養(yǎng)物質的吸收。

在動物機體物質和能量代謝過程中SIRT6也發(fā)揮著重要的作用。通過比較公母2組蘇姜豬各組織中SIRT6蛋白水平，發(fā)現公豬在各組織器官的表達水平均高于母豬，表明該蛋白在性別方面存在差異，這可能與母豬的生長勢較公豬弱(如蘇姜豬成年公豬平均體重204 kg，母豬體重168 kg)的特點相符[3]。

通過免疫組織化學方法，在測定的11種蘇姜豬組織中均檢測到SIRT6免疫陽性顆粒。肝臟是動物機體內重要的代謝器官，是糖代謝的調控具有重要意義。研究發(fā)現，SIRT6是葡萄糖穩(wěn)態(tài)的核心調節(jié)者，其功能對糖異生與糖酵解均有影響。研究發(fā)現，SIRT6能夠強烈調節(jié)PGC-1α乙?；饔?，通過誘導PGC-1α乙?；瑥亩种聘纹咸烟巧蒣12]。該研究在公豬的肝臟中檢測到豐富的SIRT6免疫陽性顆粒。可能與SIRT6抑制糖異生，使更多的葡萄糖轉化為脂肪，進而增加雄性豬的體重有關。機體最大的免疫器官——脾臟含有大量淋巴細胞和巨噬細胞，是機體細胞免疫和體液免疫的中心。通過細胞定位發(fā)現，SIRT6免疫陽性顆粒主要分布于蘇姜豬脾臟的紅髓細胞。肌肉是動物機體能量代謝的主要組織。該研究在蘇姜豬心臟、背最長肌和腿肌的肌細胞中均檢測到SIRT6免疫陽性顆粒，表明SIRT6在蘇姜豬能量代謝過程中也具有重要作用。在消化系統的胃、小腸和大腸組織中，SIRT6免疫陽顆粒主要出現在腺細胞中，表明在腺體分泌過程中具有重要的作用。

4 結論

SIRT6在蘇姜豬組織中具有表達廣泛性，其中，在物質能量代謝較旺盛組織和腺體分泌組織中相對表達量較高，此外，蘇姜公豬組織中SIRT6蛋白表達量相對高于母豬，研究結果為深入開展優(yōu)質肉用豬種的選育提供理論依據。