王春曉， 李 楠， 裴玉賀， 于秋鴻， 宋希云， 李 軍

(青島農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院, 山東 青島 266109)

0 引言

【研究意義】近年來，作物生長季頻繁發(fā)生的高溫熱害已成為全球重大自然災害之一[1]。研究發(fā)現(xiàn)，21世紀的全球地表平均氣溫比20世紀升高1.4～5.8℃，且溫度每升高1℃，玉米將減產(chǎn)10%～20%[2]，高溫期間往往伴隨干旱，給玉米生產(chǎn)造成的危害更加嚴重[3]。【前人研究進展】WANG等[4]研究發(fā)現(xiàn)，玉米幼苗在遭受熱激處理時體內(nèi)會積累大量的甲基乙二醛(MG)。MG是一類有毒的醛酮類代謝物，對多種細胞成分具有高度反應活性，導致其不可逆地修飾進而形成加合物和交聯(lián)[5]。MG的降解途徑有2條：一是依賴GSH(還原型谷胱甘肽)的途徑，包括乙二醛酶1(GLY1)和乙二醛酶2(GLY2)；二是不依賴GSH的途徑，如乙二醛酶3(GLY3)。乙二醛酶在動物細胞中研究得比較清楚，參與細胞增殖、胚胎發(fā)生、成熟和細胞死亡等生物過程[6-7]。植物乙二醛酶系統(tǒng)首次在花旗松針中報道[8]，之后在單、雙子葉植物中均有報道[9-14]。ZmGly2編碼產(chǎn)物是羥酰谷胱甘肽水解酶，參與MG降解的第二步反應[15]。過表達Gly1和Gly2的轉(zhuǎn)基因煙草、水稻和擬南芥均表現(xiàn)出較強的耐鹽和抗旱能力[16-18]。【研究切入點】然而，迄今對玉米ZmGly2的表達特性和生物學功能還缺乏深入的研究?！緮M解決的關鍵問題】為此，利用生物信息學和qRT-PCR方法的方法對ZmGly2蛋白的結構、理化性質(zhì)和表達差異等進行分析，找出該基因在干旱、高溫脅迫應答中的可能作用，為將來通過CRISPR-Cas9基因編輯技術培育抗旱耐熱玉米新種質(zhì)提供可利用的基因資源。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物 玉米品種為鄭單958，購自河南金博士種業(yè)股份有限公司。

1.1.2 試劑 RNA提取試劑盒購自Takara公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒和熒光定量試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，引物由上海派森諾生物科技股份有限公司合成(表1)。

表1 qRT-PCR用引物

1.2 玉米根莖葉的獲取

將玉米種子播于含有營養(yǎng)土和蛭石(3∶1)的花盆(1粒/盆)中，置于青島農(nóng)業(yè)大學智能溫室內(nèi)(25℃)生長。待幼苗長至三葉期時分別進行干旱(20% PEG600)和高溫(37℃)處理，在處理0 h、12 h、24 h、36及48 h后選取玉米的根、莖和葉，快速置于液氮中保存?zhèn)溆谩Ｃ總€處理含5棵幼苗， 3次重復。

1.3 生物信息學分析

根據(jù)文獻[15]，從NCBI網(wǎng)站(https://preview.ncbi.nlm.nih.gov)檢索到ZmGly2(登錄號：XM_008652743)；利用ProtParam tool(https://web.expasy.org/protparam)分析ZmGly2編碼蛋白的理化性質(zhì)；使用TMHMM Server 2.0進行蛋白跨膜結構預測；利用SWISS-MODEL進行蛋白質(zhì)高級結構分析；利用MEGA 7.0對ZmGly2進行系統(tǒng)進化樹分析。

1.4 總RNA提取、cDNA合成及表達模式分析

利用RNA提取試劑盒說明提取總RNA；按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明合成cDNA；用qRT-PCR分析表達模式，以玉米Actin作為內(nèi)參基因。

2 結果與分析

2.1 ZmGly2蛋白的理化性質(zhì)

經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly2基因的cDNA序列為1 014 bp，編碼337個氨基酸，理論分子量為34.4 KD，等電點為7.66。對氨基酸組成分析發(fā)現(xiàn)，帶負電荷的氨基酸(Asp+Glu)殘基總數(shù)為32個，帶正電荷的氨基酸(Arg + Lys)殘基總數(shù)為33個，Leu含量最高，占10.6%；Trp含量最少；占0.6%。蛋白不穩(wěn)定系數(shù)較低，為35.9，屬于穩(wěn)定蛋白。疏水性較低，為-0.279，表明其為親水性蛋白。利用NCBI數(shù)據(jù)庫中的CD-Search分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly2蛋白有2個結構域，一是N端的金屬-β-內(nèi)酰胺酶結構域；二是C端的羥酰谷胱甘肽水解酶結構域(圖1a)。經(jīng)TMHMM Server分析，該蛋白不含跨膜結構域，可能為細胞質(zhì)蛋白(圖1b)。

圖1 ZmGly2蛋白保守區(qū)分析(a)和跨膜結構域預測(b)

2.2 ZmGly2蛋白的結構

ZmGly2蛋白的空間結構有Fe2+和Zn2+2個金屬結合位點(圖2)。其中，F(xiàn)e2+的結合位點在His252、His142、Asp141和Asp241處，Zn2+的結合位點在His137、His139、His195和Asp214處，說明ZmGly2蛋白是一種金屬酶。

圖2 ZmGly2蛋白質(zhì)空間結構模型(a)和金屬結合位點(b)

2.3 ZmGly2蛋白的系統(tǒng)進化樹

從NCBI數(shù)據(jù)庫中檢索到與ZmGly2蛋白同源的其他植物氨基酸序列，選取氨基酸序列同源性≥60%的13種植物進行進化樹分析表明，ZmGly2蛋白與南荻MlGly2同源性為97.11%，親緣關系最近；與三裂葉薯ItGly2同源性為67.54%，親緣關系最遠(圖3)。

注：TuGly2為烏拉爾圖小麥；MlGly2為南荻；ZmGly2為玉米；SbGly2為高粱；PhGly2為黍；PvGly2為柳枝稷；SvGly2為狗尾草；DeGly2為福尼奧小米；EcGly2為彎葉畫眉草；ObGly2為短花藥野生稻；PdGly2為海棗；CsGly2為亞麻薺；ItGly2為三裂葉薯；McGly2為博落回。

2.5 ZmGly2基因的組織特異性表達

如圖4所示，ZmGly2基因在葉片中的相對表達量最高，莖次之，根中最低。ZmGly2基因在葉中的表達量分別是根和莖中表達量的8.1倍和5.3倍。

圖4 ZmGly2在不同組織的相對表達量

2.6 ZmGly2基因在高溫和干旱逆境脅迫下的表達量

如圖5所示，ZmGly2基因?qū)Ω邷睾透珊得{迫應答呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢。ZmGly2基因在高溫處理24 h后表達量達最高，是處理前的3.5倍，在處理48 h后其相對表達量略有降低，是處理前的2.0倍。ZmGly2基因在干旱處理36 h后表達量達最高，是處理前的5.9倍，在處理48 h后其相對表達量降低，約是處理前的1.8倍。

注：**表 示差異達極顯著(P<0.01)水平。

3 討論

在干旱、熱害等逆境脅迫條件下，植物細胞內(nèi)會積累大量的有毒物質(zhì)如甲基乙二醛(MG)等，乙二醛酶系統(tǒng)在清除過量MG、維持其在細胞內(nèi)的動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[19]。在依賴GSH的降解途徑中，乙二醛酶Ⅰ(GLYⅠ)和乙二醛酶Ⅱ(GLYⅡ)協(xié)同作用，以GSH為輔因子，將MG降解為無毒的乳酸。研究發(fā)現(xiàn)，Gly1是一類依賴金屬離子如Ni2+或Zn2+的蛋白酶[20]。利用生物信息學的方法分析玉米Gly2蛋白(ZmGly2)的理化性質(zhì)和結構特點發(fā)現(xiàn)，ZmGly2含有337個氨基酸，分子量為34.41 KD，為穩(wěn)定的親水性蛋白。由于該蛋白缺乏跨膜結構，猜測ZmGly2可能定位于細胞質(zhì)中。結構域分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly2的N端為金屬-β-內(nèi)酰胺酶結構域，而C端為羥酰谷胱甘肽水解酶結構域。對13種植物的Gly2蛋白氨基酸同源序列分析發(fā)現(xiàn)，ZmGly2與南荻MlGly2同源性為97.11%，親緣關系最近；與Gly1相類似，也是一種金屬酶，含有Fe2+和Zn2+2個結合位點。

已有證據(jù)表明，Gly2基因參與了植物對逆境脅迫的應答。MUDALKAR等[21]發(fā)現(xiàn)，麻風樹(JatrophacarcasL.)具有較強的抗旱和耐鹽能力，與其自身存在較高的乙二醛酶活性有關。NAHAR等[22]研究，多胺處理綠豆幼苗發(fā)現(xiàn)，幼苗中乙二醛酶2的活性顯著增加且耐鹽能力明顯提高。YADAV等[23]發(fā)現(xiàn)，高溫和低溫均誘導水稻Gly2基因的表達，導致內(nèi)源MG含量降低，耐受溫度脅迫的能力加強。ZmGly2基因在不同組織器官中的表達水平存在很大差異，在葉片中的表達量最高，且相對表達量受干旱和高溫的強烈誘導，表現(xiàn)出先升高后降低的趨勢，與YADAV等[23]結果一致。

4 結論

ZmGly2為含有Fe2+和Zn2+2個金屬結合位點的非跨膜金屬酶，且含有N端的金屬-β-內(nèi)酰胺酶結構域和C端的羥酰谷胱甘肽水解酶結構域，與南荻MlGly2的親緣關系最近。且ZmGly2在葉片中的表達受高溫和干旱的強烈誘導，參與玉米對干旱和高溫的脅迫應答，為下階段利用CRISPR-Cas9基因編輯技術深入解析其生物學功能奠定了基礎。