宋繼政,邱 磊

齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生物工程學(xué)院,生物基材料與綠色造紙國家重點實驗室,濟(jì)南 250353

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae) Ndt80是減數(shù)分裂特異轉(zhuǎn)錄因子,也是Ndt80家族最先被研究的蛋白,在有性孢子形成缺陷突變株的遺傳篩選中被鑒定[1]。自Ndt80蛋白的功能在釀酒酵母首次被鑒定以來,Ndt80蛋白家族在其他真菌中的功能也相繼被鑒定。例如,通過對粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)菌絲融合后的非自我識別系統(tǒng)的遺傳分析鑒定出了Ndt80家族轉(zhuǎn)錄因子VIB-1[2]。在構(gòu)巢曲霉(Aspergillusnidulans)中,通過對胞外蛋白酶對碳、氮和硫饑餓反應(yīng)的調(diào)控遺傳分析,鑒定了Ndt80家族基因xprG[3]。近年來,Ndt80蛋白家族在人類病原真菌白色念珠球菌(Candidaalbicans)[4]、植物病原真菌稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)[5]等真菌中的生物學(xué)功能相繼被報道。大多數(shù)真菌譜系中都存在編碼Ndt80蛋白的基因,但在許多擔(dān)子菌門中并不存在。不同真菌中編碼Ndt80蛋白的基因從0到7個不等[6]。在昆蟲病原真菌白僵菌(Beauveriabassiana)中有3個編碼Ndt80蛋白的基因,目前只有一個被鑒定。Ndt80家族蛋白Ron1在球孢白僵菌侵染宿主的過程中的作用目前仍不清楚。球孢白僵菌是目前實際應(yīng)用廣泛的昆蟲病原真菌,其作為一種研究真菌與宿主互作的模式真菌也被廣泛研究[7]。本文在球孢白僵菌中對Ndt80家族蛋白Ron1缺失突變體進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組分析,并依據(jù)Ndt80家族蛋白在致病真菌中的作用對Ndt80蛋白在昆蟲病原真菌生物防治潛力的貢獻(xiàn)進(jìn)行分析與展望。

1 實驗材料與方法

1.1 試驗菌株

本實驗所用的野生型球孢白僵菌為本實驗室所保存的BeauveriabassianaARSEF 2860菌株(WT),基因缺失菌株(ΔRon1)在此菌株的基礎(chǔ)上構(gòu)建。

1.2 基因敲除

本實驗通過農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefacien)介導(dǎo)的真菌轉(zhuǎn)化的方法來構(gòu)建BbRon1基因的缺失突變體。具體方法參照Wang等[8]。

1.3 轉(zhuǎn)錄組測序

球孢白僵菌在模仿真菌宿主表皮的幾丁質(zhì)培養(yǎng)基中培養(yǎng)五天后,采用TRIzol法提取菌絲中的RNA并處理。首先,利用DNA探針雜交rRNA,RNaseH選擇性消化DNA/RNA雜交鏈,DNaseI消化掉DNA探針,純化后即得到所需RNA。然后,用打斷buffer把上述所得RNA片段化,之后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,再合成cDNA二鏈形成雙鏈DNA。把合成的雙鏈DNA末端補平并5’端磷酸化,3’端形成突出一個“A”的粘末端,再連接一個3’端有凸出“T”的鼓泡狀的接頭。所得產(chǎn)物通過特異的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增產(chǎn)物熱變性后用橋式引物將單鏈DNA環(huán)化得到單鏈環(huán)狀DNA文庫并上機(jī)測序。測序得到的數(shù)據(jù)經(jīng)過濾后比對到參考基因組上,并對差異表達(dá)基因進(jìn)行富集和聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 顯著差異基因的數(shù)量

對本實驗中的6個樣品(三個野生型菌株和三個BbRon1基因缺失菌株)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄本對比發(fā)現(xiàn),共有4 864個差異表達(dá)基因(|Log2FC|>1,Q≤0.001),占球孢白僵菌基因總數(shù)的49.4%。其中上調(diào)基因1 036個,下調(diào)基因3 828個,如圖1所示。

圖1 差異表達(dá)基因的數(shù)量

2.2 差異表達(dá)基因的聚類分析

根據(jù)分子功能(molecular function)、細(xì)胞組分(cellular component)和生物過程(biological process)三大功能類將4 864個差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分類(Gene Ontology),共有37個二級條目,如圖2所示。其中,注釋為分子功能的差異表達(dá)基因分布在11個二級分類條目中。在這11個二級分類條目中,催化活性(catalytic activity)條目包含的差異表達(dá)基因最多,有1 891個。其次是結(jié)合(binding)、轉(zhuǎn)運活性(transporter activity)和轉(zhuǎn)錄調(diào)控活性(transcription regulator activity)三個二級條目各有1 412、203和195個差異表達(dá)基因。注釋為細(xì)胞組分的差異表達(dá)基因分布在12個二級分類條目中,注釋為膜(membrane)、膜的一部分(membrane part)和細(xì)胞(cell)條目的差異表達(dá)基因最多,分別有1 218、1 176和946個。注釋為生物過程的差異表達(dá)基因分布在最多的14個二級條目中,其中代謝過程(metabolic process)、細(xì)胞過程(cellular process)和定位(localization)三個二級條目所包含的差異表達(dá)基因最多。

圖2 差異表達(dá)基因的GO分類

根據(jù)Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes (KEGG)注釋結(jié)果以及官方分類,我們將差異基因進(jìn)行生物通路分類。一共可分為5大類,分別是:細(xì)胞過程(Cellular Processes)、環(huán)境信息處理(Environmental Information Processing)、遺傳信息處理(Genetic Information Processing)、代謝(Metabolism)和有機(jī)系統(tǒng)(Organismal Systems)。如圖3所示,差異表達(dá)基因主要分布在代謝分支中。其中碳水化合物代謝(Carbohydrate metabolism)、氨基酸代謝(Amino acid metabolism)和脂質(zhì)代謝(Lipid metabolism)是真菌生命活動所必須的。

圖3 差異表達(dá)基因的KEGG分類

Ron1的缺失導(dǎo)致大量的調(diào)控真菌代謝相關(guān)的基因的表達(dá)量下降,這表明Ron1在真菌各種代謝的過程中有著十分重要的作用。

3 討 論

3.1 Ron1參與真菌無性發(fā)育

Ndt80家族蛋白在許多真菌中參與無性發(fā)育的調(diào)控。我們之前的研究發(fā)現(xiàn),在球孢白僵菌中編碼Ndt80蛋白的基因BbTFO1的缺失導(dǎo)致了分生孢子在前期產(chǎn)生的減少[8]。Dementhon等[9]研究發(fā)現(xiàn)粗糙脈孢菌Ndt80蛋白編碼基因vib-1的突變導(dǎo)致分生孢子稀疏,氣生菌絲的伸長受到阻礙。煙曲霉菌(Aspergillusfumigatus) Ndt80蛋白編碼基因xprG缺失突變體產(chǎn)生的分生孢子梗更小,分生孢子更少,更脆弱[10]。然而,xprG在里氏木霉(Trichoderma reesei)中的同源基因Ron1的敲除導(dǎo)致分生孢子的產(chǎn)量上升[11]。這表明Ndt80蛋白可能從正向或負(fù)向調(diào)控不同真菌的無性生殖。本實驗中,經(jīng)過轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn),在Ron1缺失突變體中大量調(diào)控真菌無性孢子發(fā)育和成熟的基因表達(dá)水平都顯著下降。這表明Ron1在球孢白僵菌中參與調(diào)控真菌的無性發(fā)育。

3.2 Ron1參與真菌胞外水解酶的產(chǎn)生

在很多Ndt80蛋白家族編碼基因缺失的真菌中存在胞外水解酶產(chǎn)生的缺陷。在構(gòu)巢曲霉中,通過對胞外蛋白酶對碳、氮和硫饑餓反應(yīng)的調(diào)控的遺傳分析,鑒定了Ndt80家族基因xprG[3]。人類病原真菌煙曲霉菌中,xprG的缺失導(dǎo)致在真菌蛋白酶產(chǎn)量的下降,蛋白酶是真菌在宿主體內(nèi)成功定殖必不可少的[10]。xprG在里氏木霉里的同源基因Ron1并不參與胞外蛋白酶的產(chǎn)生。Hutchison等[12]研究發(fā)現(xiàn)粗糙脈孢菌中Ndt80蛋白vib-1在碳源和氮源匱乏的條件下參與調(diào)控蛋白酶的產(chǎn)生。在白色念珠球菌的三個編碼Ndt80蛋白的基因中,只有Ndt80參與調(diào)控蛋白酶的活性[13]。

Ndt80蛋白不僅參與真菌胞外蛋白酶的產(chǎn)生,在一些真菌中還參與調(diào)控其他胞外水解酶的產(chǎn)生,例如纖維素酶和幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生。Xiong等[14]研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)有外界纖維素誘導(dǎo)時,Ndt80蛋白vib-1通過調(diào)控下游基因Cre-1的表達(dá)參與調(diào)控粗糙脈孢菌纖維素酶的產(chǎn)生。vib-1的敲除導(dǎo)致纖維素酶產(chǎn)生受到抑制進(jìn)而難以降解植物細(xì)胞壁。在里氏木霉中,對vib-1基因超表達(dá)使得真菌纖維素酶活性增加了3倍并且其他部分水解酶的活性也隨之上升,例如木聚糖酶[15]。Katz等[16]研究發(fā)現(xiàn)構(gòu)巢曲霉Ndt80蛋白xprG能夠調(diào)控幾丁質(zhì)酶基因ChiB的表達(dá)。在本研究中,轉(zhuǎn)錄分析發(fā)現(xiàn)在球孢白僵菌Ron1缺失突變體中大量幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)量都顯著下調(diào),如表1所示。這表明在球孢白僵菌中,Ndt80家族蛋白Ron1參與了真菌幾丁質(zhì)酶的產(chǎn)生。

表1 ΔRon1菌株中下調(diào)的幾丁質(zhì)酶基因

3.3 Ron1參與N-乙酰氨基葡萄糖的代謝

在植物中,N-乙酰氨基葡萄糖以游離的形式存在或者在蛋白質(zhì)的O-和N-糖基化后與GPI錨定連接[17]。在昆蟲中,N-乙酰氨基葡萄糖大量存在于昆蟲的角質(zhì)層,這些N-乙酰氨基葡萄糖大多以幾丁質(zhì)的形式存在。此外,幾丁質(zhì)也是真菌細(xì)胞壁的主要成分。N-乙酰氨基葡萄糖也是脊椎動物組織細(xì)胞外基質(zhì)中的一種糖。對于大多數(shù)病原真菌,N-乙酰氨基葡萄糖時其侵染宿主過程中的重要營養(yǎng)來源。

在子囊菌門中,一般有一個Ndt80家族蛋白是N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝途徑基因的轉(zhuǎn)錄激活因子。Bhatt等[5]通過酵母單雜交實驗在稻瘟病菌驗證了轉(zhuǎn)錄因子Ndt80能夠直接與N-乙酰氨基葡萄糖分解代謝基因MoDac、MoDeam和MoHex啟動子前端的順式作用元件結(jié)合來激活它們的表達(dá)。在里氏木霉中,Ndt80家族蛋白Ron1在N-乙酰氨基葡萄糖的誘導(dǎo)下激活N-乙酰氨基葡萄糖利用所需要的基因[11]。在白色念珠球菌中,Ron1的缺失導(dǎo)致真菌無法在乙酰氨基葡萄糖為碳源的培養(yǎng)基上生長[18]。在本研究中Ron1的缺失不僅導(dǎo)致幾丁質(zhì)酶的活性下降,而且也導(dǎo)致參與乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)運和代謝的基因轉(zhuǎn)錄水平下降,如表2所示。

表2 ΔRon1菌株中下調(diào)的N-乙酰氨基葡萄糖代謝相關(guān)基因

3.4 Ron1參與真菌真菌毒力調(diào)控

近年來,Ndt80蛋白家族對真菌毒力的研究在人類機(jī)會病原真菌白色念珠球菌中被廣泛報道。其中兩種蛋白Ndt80和Rep1首次被鑒定為藥物外排轉(zhuǎn)運蛋白CDR1和MDR1的調(diào)節(jié)因子[18-19]。Ndt80基因的缺失使得白色念珠球菌對抗真菌藥物的抗性降低,進(jìn)而使得它在宿主中的致病能力下降。此外,白色念珠球菌從芽殖酵母(budding yeast)狀態(tài)轉(zhuǎn)換為菌絲生長的能力對真菌入侵宿主十分重要[20]。研究發(fā)現(xiàn)Ndt80和Ron1的缺失會影響白色念珠球菌的絲狀生長。這是由于CaNdt80能夠激活菌絲生長特異性基因的表達(dá)[13]。在白色念珠球菌中,CaNdt80蛋白對真菌毒力的作用是Ndt80蛋白家族中唯一被直接測試的蛋白,Ndt80缺失突變體在小鼠感染模型中毒力顯著降低[13]。在另一種動物病原真菌煙曲霉菌中,Ndt80樣蛋白XprG的缺失在免疫正常的小鼠中并沒有導(dǎo)致真菌毒力的下降[10]。在本實驗中,Ron1的缺失導(dǎo)致球孢白僵菌部分控制真菌毒素的基因表達(dá)量下降,如BBA_08222 (log2FC=-3.274,Q=0.000 01)。這表明在球孢白僵菌中,Ron1參與了真菌毒素的產(chǎn)生。

4 展 望

自從轉(zhuǎn)錄因子Ndt80的功能在釀酒酵母中被鑒定為有絲分裂特異調(diào)控因子以來,Ndt80蛋白家族在動物病原真菌和植物病原真菌中的作用也逐漸清晰。它們在有性繁殖、細(xì)胞凋亡、N-乙酰氨基葡萄糖傳感和分解代謝、次級代謝以及產(chǎn)生胞外水解酶等方面發(fā)揮著重要作用。但是大部分Ndt80家族蛋白在昆蟲病原真菌中的作用及其作用機(jī)制目前還沒有被報道。

對于昆蟲病原真菌,決定其生物防治潛力的關(guān)鍵因素之一是真菌能否順利水解并浸透由蛋白質(zhì)、幾丁質(zhì)和脂質(zhì)組成的宿主角質(zhì)層。這些大分子物質(zhì)經(jīng)過進(jìn)一步分解又是昆蟲病原真菌侵染過程的營養(yǎng)來源。其中幾丁質(zhì)水解后產(chǎn)生的N-乙酰氨基葡萄糖被認(rèn)為是刺激真菌菌絲生長的重要信號分子,其分解代謝過程在部分真菌中已經(jīng)被證明受到Ndt80家族蛋白Ron1的調(diào)控。之前的研究證明了Ndt80家族蛋白與胞外水解酶的產(chǎn)生密切相關(guān),但其具體作用機(jī)制并不清楚。通過轉(zhuǎn)錄組測序、酵母單雜和CHIP-seq等手段研究Ndt80在昆蟲病原真菌侵染宿主過程中的作用機(jī)制,對通過基因過程手段提高昆蟲病原真菌的生防潛力具有重要意義。