曹瑞霞, 賈玉萍

(1.齊魯師范學(xué)院 化學(xué)與化工學(xué)院，山東 濟(jì)南 250200；2.山東省藥學(xué)科學(xué)院，山東 濟(jì)南 250101)

癌癥是全球第二大人類死亡誘因，根據(jù)世界衛(wèi)生組織的數(shù)據(jù)，2018年癌癥造成約960萬人死亡[1]。其主要原因是惡性腫瘤細(xì)胞無管制的生長，擴(kuò)散到人體不同的器官[2]。在男性中，癌癥最常發(fā)生在肺、前列腺、結(jié)腸直腸、胃和肝臟器官；而對(duì)于女性，常發(fā)生于乳房、結(jié)腸、肺、宮頸和胃器官[3-4]。近幾年對(duì)癌癥治療的藥物研究引起了世界科學(xué)家極大的關(guān)注[5-6]。

異吲哚酮是許多具有重要生物、藥物活性化合物的基本骨架結(jié)構(gòu)。作為一類雜環(huán)生物堿，它主要存在于天然產(chǎn)物，如Cichorine(1, Chart 1)[7]和Vitedoamine A(2)[8]，以及部分重要的合成藥物中，如Indoprofen(3)[9]和Lenalidomide(4)[10-11]。異吲哚酮結(jié)構(gòu)具有顯著的生物活性，如能抑制腫瘤細(xì)胞生長[12]，抗A型流感病毒(H1N1)活性[13]，抗多種植物病原體活性[14]，潛在治療II型糖尿病等代謝綜合癥活性[15]。因此，異吲哚酮作為母核結(jié)構(gòu)，具有良好的生物活性，在新藥研發(fā)中具有重要的研究價(jià)值[16]。

Chart 1

Chart 2

鄰鹵代甲基或鄰?；郊姿狨ヅc胺類物質(zhì)的縮合反應(yīng)是合成異吲哚酮類化合物的傳統(tǒng)方法[17-21]，鄰苯二甲酰亞胺的選擇性還原以及苯并[c]吡咯酮衍生物的各種有機(jī)轉(zhuǎn)化也被用于合成異吲哚酮衍生物[22]。氮的烷基化或者芳基化合成的產(chǎn)物涉及到包括化工、醫(yī)療、醫(yī)藥及國防等重要科技領(lǐng)域[23]。然而在異吲哚酮結(jié)構(gòu)的N-2位引入不同的烷基或者芳基的報(bào)道較少。以Lenalidomide為先導(dǎo)物，對(duì)N-2位的哌啶-2,6-二酮和4-位胺基進(jìn)行結(jié)構(gòu)修飾，在N-2位通過變換不同的R2基團(tuán)引入不同的芳基和吡啶基，以及引入正已基，4-位胺基分別被不同取代位置的溴基團(tuán)R1修飾，設(shè)計(jì)合成了I，II和III等3個(gè)系列化合物(Chart 2)，有望得到生物活性較好且生物利用度較高的異吲哚酮衍生物。

本文以不同溴代的2-甲基苯甲酸(1a～1c)為原料，使用濃鹽酸催化生成甲酯得到中間體(2a～2c)；然后在偶氮二異丁腈催化下，與N-溴代丁二酰亞胺發(fā)生溴代反應(yīng)，生成不同的芐溴(3a～3c)；最后與不同的苯胺，吡啶胺和正已胺反應(yīng)，得到15個(gè)新的異吲哚酮衍生物(I1～I(xiàn)5,II1～I(xiàn)I5和III1～I(xiàn)II5,Scheme 1)，其結(jié)構(gòu)經(jīng)1H NMR和HR-MS(ESI)表征。并研究了15個(gè)新化合物對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞Colo205、人胰腺癌細(xì)胞PNAC-1和人骨髓瘤細(xì)U266的體外抑制活性。

Scheme 1

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試劑

YRT-3型熔點(diǎn)儀(溫度未校正)；Bruker AV 400 MHz型核磁共振儀(DMSO-d6，CDCl3為溶劑，TMS為內(nèi)標(biāo))；Agilent 6540 Q-TOF(ESI)型質(zhì)譜儀。

3-溴-2-甲基苯甲酸、4-溴-2-甲基苯甲酸、5-溴-2-甲基苯甲酸、N-溴代丁二酰亞胺(NBS)、偶氮二異丁腈(AIBN)、間溴苯胺、正己胺、2-溴-6-氨基吡啶、鄰甲苯胺、間甲基苯胺、4-氨基苯甲酸乙酯、甲醇、二氯甲烷和濃鹽酸均為分析純或化學(xué)純；A549、Colo205、PNAC-1和U266，中科院上海細(xì)胞庫；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1)2a～2c的合成通法[24]

將原料1a～1c0.093 mol和3 mL濃鹽酸加入200 mL甲醇中，加熱回流反應(yīng)8 h(TLC檢測(cè))。冷卻至室溫，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相依次用飽和NaHCO3溶液洗滌3次，無水Na2SO4干燥，濃縮蒸干得中間體2a～2c，收率96%。

(2)3a～3c的合成通法

將中間體2a～2c0.029 mol，AIBN 0.0029mol和NBS 0.032 mol加入100 mL二氯甲烷溶液中，加熱回流反應(yīng)4 h(TLC檢測(cè))。待原料反應(yīng)完后，冷卻至室溫，用二氯甲烷萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌3次，無水Na2SO4干燥，濃縮蒸干得中間體3a～3c(不經(jīng)純化，直接用于下步反應(yīng))。

(3)I1～I(xiàn)5,II1～I(xiàn)I5和III1～I(xiàn)II5的合成通法

將中間體3a～3c0.003 mol和不同的芳香胺或者正已胺 0.003 mol 在20 mL 甲醇溶液中，攪拌下于60 ℃反應(yīng)至終點(diǎn)(TLC檢測(cè))。冷卻至室溫，用乙酸乙酯萃取，有機(jī)相用飽和食鹽水洗滌3次，無水Na2SO4干燥，濃縮蒸干，殘余物經(jīng)硅膠柱層析(洗脫劑:乙酸乙酯/石油醚，V/V=1/5)純化得化合物I1～I(xiàn)5,II1～I(xiàn)I5和III1～I(xiàn)II5。

4-溴-2-(2-甲基苯基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(I1): 淡黃色固體，收率52.10%, m.p.106.5～109.5 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 2.367(s, 3H), 4.949(s, 2H), 7.030(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.330(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.528(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.723(s, 1H), 7.788(m, 2H), 7.897(d,J=8.0 Hz, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H13NOBr{[M+H]+}302.0175, found 302.0169。

4-溴-2-(3-甲基苯基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(I2): 淡黃固體，收率68.60%，108.5～110.5 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 2.368(s, 3H), 4.949(s, 2H), 7.030(d,J=7.2 Hz, 1H), 7.330(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.529(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.724(s, 1H), 7.802(m, 2H), 7.902(d,J=4.4 Hz, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H13NOBr{[M+H]+}302.0175, found 302.0178。

4-溴-2-(3-溴苯基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(I3): 淡黃色固體，收率52.68%，m.p.148.5～151.6 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 4.982(s, 2H), 7.399(m, 2H), 7.531(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.820(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.903(s, 1H), 7.918(d,J=2.4 Hz, 1H), 8.243(s, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H10NOBr2{[M+H]+}365.9124, found 365.9121。

4-溴-2-(6-溴吡啶基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(I4): 淡黃色固體，收率51.44%, m.p.218.5～221.6 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 4.956(s, 2H), 7.466(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.547(t,J=7.6 Hz,1H), 7.862(m, 2H), 7.951(d,J=8.0 Hz, 1H), 8.510(d,J=8.4 Hz, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C13H9N2OBr2{[M+H]+}366.9076, found 366.9073。

4-溴-2-已基-2,3二氫異吲哚-1-酮(I5): 淡黃色固體，收率48.65%，m.p.86.5～89.3 ℃;1H NMR(CDCl3, 400 MHz)δ: 0.889(t,J=6.8 Hz, 3H), 1.359(m, 6H), 1.682(m, 2H), 3.627(d,J=7.6 Hz, 2H), 4.298(s, 2H), 7.361(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.645(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.793(d,J=7.6 Hz, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H19NOBr{[M+H]+}296.0645, found 296.0649。

5-溴-2-(2-甲基苯基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(II1): 淡黃色固體，收率62.48%, m.p.185.60～187.65 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 2.358(s, 3H), 5.006(s, 2H), 7.019(d,J=7.2 Hz, 1H), 7.327(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.729(m, 4H), 7.916(s, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H13NOBr {[M+H]+}302.0175, found 302.0178。

5-溴-2-(3-甲基苯基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(II2): 淡黃色固體，收率77.84%，m.p.181.80～184.60 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 2.361(s, 3H), 5.011(s, 2H), 7.022(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.329(t,J=7.6 Hz, 1H), 7.727(dd,J=8.4 Hz,J=12.8 Hz, 4H), 7.920(s, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H13NOBr{[M+H]+}302.0175, found 302.0172。

5-溴-2-(3-溴苯基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(II3): 淡黃色固體，收率70.81%, m.p.140.50～143.60 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 5.046(s, 2H), 7.403(m, 2H), 7.741(t,J=8.4 Hz, 2H), 7.849(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.935(s, 1H), 8.209(s, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H10NOBr2{[M+H]+}365.9124, found 365.9119。

5-溴-2-(6-溴吡啶基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(II4): 白色固體，收率54.50%, m.p.219.50～222.50 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 5.066(s, 2H), 7.449(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.760(s, 2H), 7.852(t,J=8.0 Hz, 1H), 8.008(s, 1H), 8.517(d,J=8.4 Hz, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C13H9N2OBr2{[M+H]+}366.9076, found 366.9069。

4-(5-溴-1-羰基-1,3-二氫異吲哚-2-基)苯甲酸乙酯(II5): 白色固體，收率64.20%, m.p.220.10～223.50 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 1.339(t,J=6.8 Hz, 3H), 4.323(dd,J=6.8 Hz,J=13.6 Hz, 2H), 5.080(s, 2H), 7.754(s, 2H), 7.956(s, 1H), 8.049(dd,J=8.4 Hz,J=12.0 Hz, 4H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C17H15NO3Br{[M+H]+}360.0230, found 360.0235。

6-溴-2-(2-甲基苯基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(III1): 黃色固體，收率57.95%, m.p.169.10～171.50 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 2.360(s, 3H), 4.996(s, 2H), 7.027(d,J=7.2 Hz, 1H), 7.334(m, 1H), 7.645(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.711(t,J=3.6 Hz, 2H), 7.864(dd,J=1.6 Hz,J=8.0 Hz, 1H), 7.904(d,J=1.6 Hz, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H13NOBr{[M+H]+}302.0175, found 302.0173。

6-溴-2-(3-甲基苯基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(III2): 淡黃色固體，收率61.96%, m.p.173.50～175.60 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 2.360(s, 3H), 4.991(s, 2H), 7.026(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.332(m, 1H), 7.642(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.705(s, 2H), 7.861(dd,J=1.6 Hz,J=8.0 Hz, 1H), 7.900(d,J=1.6Hz, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C15H13NOBr{[M+H]+}302.0175, found 302.0171。

6-溴-2-(3-溴苯基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(III3): 淡黃色固體，收率50.06%，m.p.207.20～210.60 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 5.030(s, 2H), 7.427(t,J=7.6 Hz, 2 H), 7.655(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.874(t,J=8.8 Hz, 2H), 7.932(s, 1H), 8.219(s, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H10NOBr2{[M+H]+}365.9124, found 365.9127。

6-溴-2-(6-溴吡啶基)-2,3二氫異吲哚-1-酮(III4): 白色固體，收率64.50%，m.p.219.40～222.60 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 5.015(s, 2H), 7.439(d,J=7.6 Hz, 1H), 7.699(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.839(t,J=8.0 Hz, 1H), 7.895(d,J=8.0 Hz, 1H), 7.933(s, 1H), 8.487(d,J=8.4Hz, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C13H9N2OBr2{[M+H]+}366.9076, found 366.9071。

6-溴-2-已基-2,3二氫異吲哚-1-酮(III5): 白色固體，收率71.50%, m.p.84.50～86.60 ℃;1H NMR(DMSO-d6, 400 MHz)δ: 0.856(t,J=6.8 Hz, 3H), 1.271(m, 6H), 1.584(m, 2H), 3.501(t,J=7.2 Hz, 2H), 4.447(s, 2H), 7.571(d,J=8.4 Hz, 1H), 7.765(d,J=2.0 Hz, 1H), 7.787(s, 1H); HR-MS(ESI)m/z: Calcd for C14H19NOBr{[M+H]+}296.0645, found 296.0649。

1.3 性能或活性測(cè)試

采用MTT法[25]測(cè)試了目標(biāo)化合物對(duì)不同腫瘤細(xì)胞的增殖抑制作用。將目標(biāo)化合物(I1～I(xiàn)5,II1～I(xiàn)I5和III1～I(xiàn)II5)配制成5個(gè)不同濃度，分別測(cè)定作用48 h后對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞Colo205、人胰腺癌細(xì)胞PNAC-1和人骨髓瘤細(xì)胞U266增殖的影響。在酶標(biāo)儀570 nm測(cè)定吸光度值，并計(jì)算抑制率。

2 結(jié)果與討論

2.1 合成

本文以不同溴代的2-甲基苯甲酸(1a～1c)為原料，在甲醇溶液中加入濃鹽酸催化，生成中間體(2a～2c)，該反應(yīng)簡單，后處理容易。本文沒有采用二氯亞砜生成甲酯的方法，因?yàn)槎葋嗧坑挟愇?，易潮解，存在潛在危險(xiǎn)。

在第二步反應(yīng)中，大部分文獻(xiàn)報(bào)道使用四氯化碳作溶劑[26-35]，四氯化碳對(duì)身體損害比較大,并且對(duì)大氣污染危害嚴(yán)重。依據(jù)《蒙特利爾協(xié)議》的有關(guān)規(guī)定，我國于2007年起在全國境內(nèi)全面禁止四氯化碳的使用，至2014年我國必須全部停用[36]。隨著協(xié)議在我國的執(zhí)行，購買四氯化碳必須出具國家環(huán)?？偩趾灠l(fā)的采購證明。所以，尋找四氯化碳的替代品成為了當(dāng)務(wù)之急。在最近的芐溴化反應(yīng)研究中，也有采用新戊酸甲酯、二氯甲烷、氯仿、氯苯及二硫化碳等替代四氯化碳溶劑進(jìn)行芐溴化反應(yīng)[37]。本文嘗試使用二氯甲烷作溶劑，在AIBN催化下，與NBS發(fā)生溴代反應(yīng)，反應(yīng)收率很好。為芐溴化反應(yīng)溶劑的選擇，提供了一條可靠的參考依據(jù)。

最后一步不同的芐溴和不同的胺關(guān)環(huán)，生成15個(gè)新的異吲哚酮衍生物(I1～I(xiàn)5,II1～I(xiàn)I5和III1～I(xiàn)II5)，此反應(yīng)需要在甲醇中加熱，用TLC檢測(cè)反應(yīng)，直到原料消失。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，以此法制備目標(biāo)化合物，反應(yīng)能較好地進(jìn)行，且后處理方便。

2.2 體外細(xì)胞抑制活性

測(cè)試了目標(biāo)化合物(I1～I(xiàn)5,II1～I(xiàn)I5和III1～I(xiàn)II5)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞Colo205、人胰腺癌細(xì)胞PNAC-1和人骨髓瘤細(xì)胞U266增殖的影響，結(jié)果見表1。

表1 化合物的體外細(xì)胞抑制活性

由表1可知，對(duì)人肺癌細(xì)胞A549抑制活性順序是:II4>I1>I2>III2>II2>III3>III1>III5，化合物II4(IC50=15.49 μM)抑制活性最好; 對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞Colo205有3個(gè)化合物有抑制作用，其順序?yàn)镮I4>I1>III5，化合物II4(IC50=15.54 μM)活性最好; 對(duì)人胰腺癌細(xì)胞PNAC-1有最好抑制活性的是化合物II4(IC50=37.07 μM)；對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞U266有抑制活性順序?yàn)镮I5>III2>I1>III1>II2>II1，化合物II5(IC50=75.27 μM)抗腫瘤活性最好。

取代基R2的種類和位置對(duì)化合物的抑制活性有明顯影響。I系列中I1(R2=2-CH3, X=C)和I2(R2=3-CH3, X=C)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549的抑制活性較好，IC50分別為35.61 μM和56.56 μM。I1對(duì)人結(jié)腸癌細(xì)胞Colo205和人骨髓瘤細(xì)胞U266也有一定的抑制活性，其他化合物活性較弱；II系列中II4(R2=6-Br, X=N)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞Colo205和人胰腺癌細(xì)胞PNAC-1具有很好的抑制活性，II2(R2=3-CH3, X=C)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549有抑制活性，IC50為90.96 μM，II5(R2=4-COOEt, X=C)對(duì)人骨髓瘤細(xì)胞U266抗腫瘤活性最好，IC50為75.27 μM；III系列中I2(R2=3-CH3，X=C)和I3(R2=3-Br, X=C)對(duì)人肺癌細(xì)胞A549有較好的抑制活性，IC50分別為56.99 μM和94.86 μM，其他取代基對(duì)4種腫瘤細(xì)胞的抑制活性較弱。

對(duì)比化合物I1～I(xiàn)5,II1～I(xiàn)I5和III1～I(xiàn)II5對(duì)人肺癌細(xì)胞A549、人結(jié)腸癌細(xì)胞Colo205和人胰腺癌細(xì)胞PNAC-1的抑制活性發(fā)現(xiàn)，II4(R2=6-Br, X=N)抑制活性最好，在異吲哚環(huán)N-2位引入吡啶環(huán)，能夠增強(qiáng)其生物活性。

探索了異吲哚酮衍生物合成方法。該反應(yīng)路線原料易得，操作方便。對(duì)溴化反應(yīng)的溶劑進(jìn)行了改進(jìn)，嘗試了文獻(xiàn)報(bào)道較少的二氯甲烷替代四氯化碳，給該類反應(yīng)提供了可靠的參考依據(jù)。初步的生物活性研究表明，在N-2位引入芳香雜環(huán)取代時(shí)，化合物的抑制活性更強(qiáng)。芳香雜環(huán)有利于化合物電荷的分散而穩(wěn)定，進(jìn)一步增強(qiáng)化合物的抑制活性，具有進(jìn)一步研究的價(jià)值。