李 靜，任其龍，潘遠(yuǎn)江

(1.浙江大學(xué)化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，生物質(zhì)化工教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310027；2.浙江大學(xué)衢州研究院，浙江 衢州 324000； 3.浙江大學(xué)化學(xué)系，浙江 杭州 310027)

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜(MALDI-TOF MS)具有靈敏度高、檢測(cè)限低、鹽類容忍度高、制樣簡(jiǎn)便等優(yōu)勢(shì)[1]，廣泛應(yīng)用于蛋白質(zhì)、DNA、磷脂、聚合物、藥物及其代謝物等多種類型化合物的分析中[2-4]。基質(zhì)在MALDI-TOF MS分析過程中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，其吸收激光能量氣化后將樣品分子帶入氣相，并將能量和質(zhì)子轉(zhuǎn)移給樣品分子，使樣品分子離子化。隨著MALDI應(yīng)用的增加，基質(zhì)的發(fā)展和選擇在優(yōu)化該技術(shù)方面尤其重要[5-6]。MALDI基質(zhì)通常是具有低蒸汽壓的弱有機(jī)酸，其中α-氰基-4-羥基肉桂酸(HCCA)是應(yīng)用最廣泛的基質(zhì)之一，其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，質(zhì)子化后的質(zhì)譜信息不會(huì)對(duì)待測(cè)物的解析產(chǎn)生干擾，可以用于檢測(cè)多種化合物。但是，在有些情況下，基質(zhì)與待測(cè)物發(fā)生反應(yīng)，生成的新物質(zhì)給待測(cè)物的檢測(cè)和解析造成困擾[7-10]。因此，MALDI基質(zhì)與待測(cè)物之間的反應(yīng)研究是非常重要的。

電噴霧電離質(zhì)譜(ESI-MS)具有溶劑適用性廣、電離效率高、所需樣品量少、質(zhì)量范圍寬等特點(diǎn)，是生物大分子分析領(lǐng)域不可或缺的工具[11]。通常，一級(jí)質(zhì)譜只能得到生物樣本的分子質(zhì)量信息，無法獲得結(jié)構(gòu)信息，可通過串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)獲取。碰撞誘導(dǎo)裂解(CID)技術(shù)通過引入碰撞氣體至碰撞室與母離子碰撞，使母離子裂解產(chǎn)生碎片，從而獲得結(jié)構(gòu)信息[12]。ESI-MS與CID技術(shù)的結(jié)合不僅可以分析大量不同種類的化合物，而且在有機(jī)和生物化合物的結(jié)構(gòu)解析方面發(fā)揮著不可替代的作用。

半胱氨酸側(cè)鏈上的巰基是構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸殘基中最活潑的基團(tuán)，以自由的—SH、離子化的硫醇或氧化的—S—S—形式存在[13]。這使得半胱氨酸成為最活潑的天然氨基酸，是肽和蛋白質(zhì)發(fā)揮功能的關(guān)鍵單元。半胱氨酸具有固定細(xì)胞色素中血紅素的功能，參與一系列翻譯后修飾、形成二硫鍵，在很多金屬蛋白中可以起到結(jié)合金屬離子、抗氧化等作用[14-15]。由于參與多種生理過程，半胱氨酸及其殘基一直是生物和生物化學(xué)領(lǐng)域重要的研究對(duì)象。

本工作擬以含有巰基的氨基酸、肽、蛋白質(zhì)作為研究對(duì)象，采用MALDI-TOF MS中常用基質(zhì)HCCA與研究對(duì)象發(fā)生反應(yīng)。通過ESI-MS結(jié)合CID技術(shù)分析HCCA與含巰基的氨基酸、肽及蛋白質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，并研究此類化合物產(chǎn)生的加成反應(yīng)機(jī)理。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與裝置

LCQ質(zhì)譜儀：美國(guó)Thermo Fisher公司產(chǎn)品，配有電噴霧離子源；AutoflexⅢ基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(配有基質(zhì)輔助激光解吸離子源)、microTOF QII(Q-TOF)高分辨質(zhì)譜儀(配有電噴霧離子源)：德國(guó)布魯克儀器有限公司產(chǎn)品；Milli-Q超純水純化系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司產(chǎn)品。

1.2 材料與試劑

本研究所用分析物和MALDI基質(zhì)的結(jié)構(gòu)式示于圖1。豬胰島素(A3)：美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；半胱氨酸、α-氰基-4-甲氧基肉桂酸(M)、五肽RCDAA(A1)、五肽RCEAA(A2)、二硫蘇糖醇(DTT)：北京百靈威科技有限公司產(chǎn)品；α-氰基-4-羥基肉桂酸、2,5-二羥基苯甲酸(DHB)、反式-3-吲哚酸(IAA)、芥子酸(SA)：德國(guó)Bruker Daltonics公司產(chǎn)品；甲醇(色譜純)：德國(guó)Merck公司產(chǎn)品；實(shí)驗(yàn)用水：由Milli-Q純水系統(tǒng)制備。

圖1 基質(zhì)以及分析物的結(jié)構(gòu)和分析物序列Fig.1 Structures of the matrices and HCCA derivatives, and amino acid sequence of analytes

1.3 實(shí)驗(yàn)條件

1.3.1MALDI基質(zhì)與分析物反應(yīng)條件 半胱氨酸、A1、A2、A3與MALDI基質(zhì)DHB、IAA、SA、HCCA及HCCA衍生物M的孵化條件：酸性(pH 3.0)、弱酸性(pH 6.0)、堿性(pH 9.0)；分析物與基質(zhì)的反應(yīng)摩爾比為1∶500；A3二硫鍵還原試劑為二硫蘇糖醇(DTT)；分析物與基質(zhì)反應(yīng)溫度為室溫。

1.3.2質(zhì)譜條件 LCQ質(zhì)譜儀：電噴霧離子源，正、負(fù)離子模式采樣；檢測(cè)電壓4.5 kV；氮?dú)鈮毫?.5 MPa；樣品流速5 μL/min；離子傳輸管溫度250 ℃；碰撞氣體為高純氬氣；二級(jí)質(zhì)譜碰撞能量20%；一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量采集范圍m/z100～1 000；二級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量采集范圍m/z100～1 000；數(shù)據(jù)采集處理：取50次掃描平均值。

MALDI-TOF MS質(zhì)譜儀：基質(zhì)輔助激光解吸離子源，正離子模式采樣；氮激光波長(zhǎng)355 nm；進(jìn)樣靶板SCOUT MTP 96；激光能量范圍30%～70%；激光累計(jì)次數(shù)1 500；離子加速電壓1 kV；一級(jí)質(zhì)譜質(zhì)量采集范圍m/z100～8 000；采用BSA胰蛋白酶酶切產(chǎn)物進(jìn)行質(zhì)量矯正。

Q-TOF高分辨質(zhì)譜儀：電噴霧離子源，正離子模式采樣；樣品流速180 μL/h；進(jìn)樣泵進(jìn)樣；氮?dú)饬魉? L/min，氮?dú)饬魉賶毫?.4×105Pa；離子源溫度180 ℃；檢測(cè)電壓3.5 kV；采用三氟乙酸鈉聚合物進(jìn)行高分辨質(zhì)量矯正。

2 結(jié)果與討論

2.1 MALDI-TOF MS結(jié)果分析

2.1.1半胱氨酸與基質(zhì)加合物的鑒定 選擇半胱氨酸(C)作為模型化合物，研究其與MALDI基質(zhì)的加成反應(yīng)?；|(zhì)HCCA的MALDI-TOF質(zhì)譜圖示于圖2a，離子峰m/z172.1、190.2、212.2、379.4 和568.2分別為[HCCA-H2O+H]+、[HCCA+H]+、[HCCA+Na]+、[2HCCA+H]+、[3HCCA+H]+。在酸性條件(pH 3.0)下，HCCA與半胱氨酸反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)譜圖示于圖2b，基峰m/z122.3為準(zhǔn)分子離子峰[C+H]+，半胱氨酸與HCCA加成產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰m/z311.2為[C+HCCA+H]+，相對(duì)強(qiáng)度較弱。在弱酸性條件(pH 6.0)下，半胱氨酸與HCCA加成產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰m/z311.4[C+HCCA+H]+相對(duì)強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，示于圖2c。在堿性條件(pH 9.0)下，加成產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰m/z311.1[C+HCCA+H]+相對(duì)強(qiáng)度最大，成為圖2d中的基峰。以上結(jié)果表明，半胱氨酸與HCCA的加成反應(yīng)受pH值的影響，堿性條件下此反應(yīng)最完全。HCCA基質(zhì)適合半胱氨酸的檢測(cè)，但二者反應(yīng)產(chǎn)物的離子峰對(duì)質(zhì)譜圖的解析造成干擾。

注：a.50%乙腈；b.pH 3.0;c.pH 6.0;d.pH 9.0圖2 HCCA(a)和HCCA-C加合物(b,c,d)的MALDI-TOF 質(zhì)譜圖Fig.2 MALDI-TOF mass spectra of the HCCA (a) and HCCA-cysteine adducts (b, c, d)

本研究同時(shí)考察了半胱氨酸與MALDI其他常用基質(zhì)DHB、SA、IAA的反應(yīng)，分別示于圖3～5。在圖3a中，m/z137.3、155.1、177.3、193.4和273.1分別為[DHB-H2O+H]+、[DHB+H]+、[DHB+Na]+、[DHB+K]+和[2DHB-2H2O+H]+。半胱氨酸與DHB在酸性、弱酸性和堿性條件下反應(yīng)所得的質(zhì)譜圖分別示于圖3b～3d，圖中基峰均為[C+H]+m/z122.2，沒有觀察到[C+DHB+H]+的出現(xiàn)。

注：a.50%乙腈；b.pH 3.0；c.pH 6.0；d.pH 9.0圖3 DHB(a)和DHB-C加合物(b,c,d)的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.3 MALDI-TOF mass spectra of the DHB (a) and DHB-cysteine adducts (b, c, d)

基質(zhì)SA的MALDI-TOF質(zhì)譜圖示于圖4a，其與半胱氨酸在酸性、弱酸性、堿性條件下反應(yīng)所得的質(zhì)譜圖分別示于圖4b～4d。m/z207.1、225.1分別為[SA-H2O+H]+和[SA+H]+，質(zhì)譜圖中均未觀察到[C+H]+和[C+SA+H]+的出現(xiàn)。

在圖5a中，m/z142.3、170.4、188.4、210.4、226.3、283.1、329.1、375.1、397.2和584.0分別為[IAA-H2O-CO+H]+、[IAA-H2O+H]+、[IAA+H]+、[IAA+Na]+、[IAA+K]+、[2IAA-2H2O-2CO2+H]+、[2IAA-CO2-H2O+H]+、[2IAA+H]+、[2IAA+Na]+和[3IAA+Na]+。在不同pH值條件下，IAA與半胱氨酸反應(yīng)所得的質(zhì)譜圖中均未檢測(cè)到[C+H]+和[C+IAA+H]+。

注：a.50%乙腈；b.pH 3.0；c.pH 6.0；d.pH 9.0圖4 SA(a)和SA-C加合物(b,c,d)的MALDI-TOF 質(zhì)譜圖Fig.4 MALDI-TOF mass spectra of the SA (a) and SA-cysteine adducts (b, c, d)

注：a.50%乙腈；b.pH 3.0；c.pH 6.0；d.pH 9.0圖5 IAA(a)和IAA-C加合物(b,c,d)的MALDI-TOF 質(zhì)譜圖Fig.5 MALDI-TOF mass spectra of the IAA (a) and IAA-cysteine adducts (b, c, d)

以上結(jié)果表明，基質(zhì)DHB、SA、IAA在酸性、弱酸性、堿性條件下均不與半胱氨酸發(fā)生加成反應(yīng)，且SA和IAA無法使含巰基的氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生命物質(zhì)電離從而被檢測(cè)。

2.1.2HCCA與DTT還原A3加成產(chǎn)物的鑒定 二硫鍵還原后A3與HCCA反應(yīng)產(chǎn)物的MALDI-TOF質(zhì)譜圖示于圖6。m/z2 381.1為[chain A+H]+，m/z3 399.1為[chain B+H]+。m/z2 570.6、2 759.3、3 588.2分別為[chain A+HCCA+H]+、[chain A+2HCCA+H]+、[chain B+HCCA+H]+，分別產(chǎn)生1個(gè)189.1 u、2個(gè)189.1 u和1個(gè)189.1 u質(zhì)量數(shù)的遷移。結(jié)果表明，多肽結(jié)構(gòu)中巰基與HCCA發(fā)生加成反應(yīng)。

圖6 堿性條件下，DTT還原豬胰島素與HCCA反應(yīng)產(chǎn)物的MALDI-TOF質(zhì)譜圖Fig.6 MALDI-TOF mass spectrum of reaction product of reduced insulin from porcine pancreas and HCCA under alkaline condition

2.2 ESI-MS結(jié)果分析

2.2.1半胱氨酸與HCCA反應(yīng)產(chǎn)物的高分辨質(zhì)譜鑒定 堿性條件下，半胱氨酸與HCCA反應(yīng)產(chǎn)物的正離子模式高分辨質(zhì)譜圖示于圖7，準(zhǔn)分子離子峰m/z122.026 6為[C+H]+。通過分析m/z311.070 6的元素組成(誤差3.3×10-6)，可以確認(rèn)其為加成產(chǎn)物的準(zhǔn)分子離子峰[C+HCCA+H]+，列于表1。高分辨質(zhì)譜結(jié)果證實(shí)了MALDI-TOF質(zhì)譜結(jié)果，半胱氨酸與HCCA確實(shí)發(fā)生了加成反應(yīng)，HCCA的質(zhì)量數(shù)遷移了189.0 u(1分子半胱氨酸)。

圖7 堿性條件下，半胱氨酸與HCCA反應(yīng)產(chǎn)物正離子模式高分辨質(zhì)譜圖Fig.7 Accurate mass spectrum of cysteine-HCCA mixture under alkaline condition in positive ion mode

表1 半胱氨酸與HCCA反應(yīng)產(chǎn)物元素分析(m/z 311.070 6)Table 1 Elemental composition of cysteine and HCCA reaction product at m/z 311.070 6

2.2.2M與半胱氨酸、A1、A2反應(yīng)產(chǎn)物的鑒定 本實(shí)驗(yàn)考察了HCCA衍生物α-氰基-4-甲氧基肉桂酸與半胱氨酸的反應(yīng)，示于圖8，m/z122.0、325.4分別對(duì)應(yīng)[C+H]+、[C+M+H]+。五肽RCDAA和RCEAA與M的反應(yīng)產(chǎn)物去質(zhì)子化質(zhì)譜峰分別為m/z736.1[A1+M-H]-和750.3[A2+M-H]-。由于A1和A2中存在天冬氨酸和谷氨酸，這2個(gè)加合產(chǎn)物離子峰均為負(fù)離子模式檢測(cè)。

注：m/z 325.4 對(duì)應(yīng)的是半胱氨酸與M的加合產(chǎn)物圖8 正離子模式下，半胱氨酸與M的加成產(chǎn)物電噴霧質(zhì)譜圖(pH 9.0)Fig.8 ESI mass spectrum of cysteine and M adduct under alkaline condition in positive ion mode

2.3 半胱氨酸與HCCA加成產(chǎn)物的質(zhì)譜碎裂研究

本研究所有質(zhì)子化和去質(zhì)子化的分析物-基質(zhì)加成產(chǎn)物的碎片離子列于表2。前期研究中，在分析物與基質(zhì)所得產(chǎn)物的MS/MS質(zhì)譜圖中，主要為分析物與基質(zhì)加合物的信號(hào)峰，表明基質(zhì)與分析物的反應(yīng)產(chǎn)物以非共價(jià)鍵結(jié)合的形式存在[16-17]。本研究中，在質(zhì)子化或去質(zhì)子化的分析物與基質(zhì)加成產(chǎn)物的MS/MS質(zhì)譜圖中，基質(zhì)、分析物的信號(hào)峰均未出現(xiàn)或以很低豐度的形式出現(xiàn)，碎片峰都是全新的離子峰，說明基質(zhì)與分析物發(fā)生了加成反應(yīng)，以共價(jià)化合物的形式存在。以半胱氨酸與HCCA質(zhì)子化加成產(chǎn)物(表2中C&HCCA)的MS/MS質(zhì)譜圖為例，對(duì)裂解機(jī)理進(jìn)行研究，示于圖9。母離子為m/z311.1，產(chǎn)生碎片離子m/z294.0、276.0、226.1。在線路1中，加成產(chǎn)物的羰基氧原子捕獲1個(gè)質(zhì)子，形成離子a(m/z311.1)，然后丟失1分子H2O和—C3HNO，形成碎片離子b(m/z226.1)。在線路2中，加成產(chǎn)物的氨基捕獲1個(gè)質(zhì)子，形成離子c(m/z311.1)，然后丟失1分子氨，形成離子d(m/z294.0)，離子d發(fā)生電荷遷移，形成離子e(m/z294.0)，最后丟失1分子H2O，形成離子f(m/z276.0)。

表2 CID質(zhì)譜圖中質(zhì)子化和去質(zhì)子化加成產(chǎn)物碎片離子Table 2 Fragment ions of protonated and deprotonated adducts in CID mass spectra

圖9 質(zhì)子化半胱氨酸與HCCA加成產(chǎn)物可能的碎裂機(jī)理Fig.9 Proposed fragmentation mechanisms of the protonated cysteine and HCCA adduct

對(duì)碎片離子和碎裂途徑的研究不僅能為反應(yīng)產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)確定提供參考，還可以根據(jù)基質(zhì)與分析物加成產(chǎn)物的MS/MS質(zhì)譜圖中基質(zhì)與分析物信號(hào)峰均未出現(xiàn)或豐度很低確定α,β-不飽和基質(zhì)與含巰基的氨基酸、肽和蛋白是通過共價(jià)鍵結(jié)合的。

3 結(jié)論

本工作采用MALDI-TOF MS和ESI-MS研究含巰基的生命物質(zhì)(氨基酸、肽及蛋白質(zhì))與MALDI常用基質(zhì)α-氰基-4-羥基肉桂酸在酸性、弱酸性、堿性條件下的加成反應(yīng)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，堿性條件下極易發(fā)生含巰基生命物質(zhì)與HCCA的加成反應(yīng)，質(zhì)譜圖中會(huì)出現(xiàn)189.1nu(n表示巰基的數(shù)目)的質(zhì)量數(shù)遷移。HCCA與半胱氨酸的加成產(chǎn)物得到了高分辨質(zhì)譜的確認(rèn)。此外，使用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì)此加成產(chǎn)物進(jìn)行碰撞誘導(dǎo)裂解研究，通過MS/MS結(jié)果推測(cè)出碎裂機(jī)理，確認(rèn)此加成產(chǎn)物為共價(jià)鍵結(jié)合。在此基礎(chǔ)上開展了HCCA衍生物α-氰基-4甲氧基肉桂酸與含巰基生命物質(zhì)加成反應(yīng)的拓展研究。此研究加深了MALDI基質(zhì)與含巰基生命物質(zhì)之間加成反應(yīng)的理解，對(duì)含有巰基分析物的質(zhì)譜測(cè)試和分析具有借鑒意義，同時(shí)為基質(zhì)的選擇提供了參考。