員 浬，柏彩紅，徐文芬，王 波，陸 祥，孫慶文

(貴州中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

人字果系毛茛科(Ranunculaceae)人字果屬(Dichocarpum)植物蕨葉人字果Dichocarpumdalzielii(J.R.Drummond & Hutchinson) W.T.Wang & P.K.Hsiao的干燥全草。具有清熱解毒、消腫止痛等功效，常用于跌打腫痛、無(wú)名腫毒等病癥[1]。其原植物分布于四川、貴州、廣西、廣東、江西等地[2]?，F(xiàn)為《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》修訂研究新增補(bǔ)品種。但目前針對(duì)蕨葉人字果除分類(lèi)學(xué)研究[3-8]外，涉及其化學(xué)成分及藥理作用研究幾乎處于空白。人字果藥材主要依賴于野生資源，野外藏量中等，貴州民間常代替黃連入藥，但不同產(chǎn)地其藥材質(zhì)量參差不齊，十分不利于藥材的合理應(yīng)用及質(zhì)量控制。加之其分布范圍較廣，其主產(chǎn)地(黔、桂)由于特殊喀斯特地貌形成了許多環(huán)境特異的小生境，而環(huán)境因子在藥用植物的生長(zhǎng)及品質(zhì)形成過(guò)程中又起著決定性作用。故此，確定環(huán)境因子對(duì)人字果藥材化學(xué)成分的影響對(duì)于揭示人字果藥材品質(zhì)形成機(jī)制顯得十分重要。

藥用植物往往分布在不同地區(qū)，在不同地區(qū)異質(zhì)生境下藥用植物獲得溫光水汽熱的機(jī)會(huì)通常差異較大，藥用植物通過(guò)適應(yīng)于不同環(huán)境下功能性狀的可塑性促進(jìn)了植物性狀的分化，導(dǎo)致不同產(chǎn)地藥材產(chǎn)量和質(zhì)量存在差異。在藥材質(zhì)量評(píng)價(jià)中有效成分含量的高低是其中最重要的指標(biāo)，課題組前期研究表明木蘭花堿為人字果藥材的主要成分，且其具有良好的抗心律失常、抗炎、抗抑郁、降壓等作用[9-15]。因此，本文采用HPLC法與多元統(tǒng)計(jì)分析方法相結(jié)合，以木蘭花堿的含量為指標(biāo)，對(duì)不同產(chǎn)地人字果藥材內(nèi)在成分與環(huán)境因子的相關(guān)性進(jìn)行分析，為藥材的資源合理開(kāi)發(fā)利用及提高藥材質(zhì)量提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Thermo UltiMate-3000型高效液相色譜儀，DAD檢測(cè)器(美國(guó)賽默飛公司)；Pntulips BP-C18柱(上海譜寧分析技術(shù)有限公司)；AG135型電子天平(瑞士Mettler-Toledo公司)；KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)等。

1.2 材料

乙腈、甲醇(均為美國(guó)天地有限公司，色譜純)；磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)；三乙胺(天津市瑞金特化學(xué)品有限公司，分析純)；甲醇(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，分析純)；乙醇(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，分析純)；木蘭花堿對(duì)照品(購(gòu)于成都曼思特生物科技有限公司，批號(hào)為MUST-17071711，純度為99.02%)。

供試樣品采于貴州省各主要分布區(qū)，經(jīng)貴州中醫(yī)藥大學(xué)孫慶文教授鑒定為毛茛科植物蕨葉人字果Dichocarpumdalzielii(J.R.Drummond & Hutchinson) W.T.Wang & P.K.Hsiao，所有樣品經(jīng)40 ℃烘干，粉碎過(guò)三號(hào)篩，置干燥器中備用。人字果藥材樣品采集信息詳見(jiàn)表1。

表1 人字果藥材采集信息Tab.1 The collection information of Dichocarpum dalzielii

2 方法與結(jié)果

2.1 環(huán)境因子查詢

人字果不同產(chǎn)地氣候因子數(shù)據(jù)(精度1 km)，從全球氣候數(shù)據(jù)庫(kù)World Clim(http：//www.worldclim.org/)下載，利用ArcGIS軟件對(duì)各采集點(diǎn)氣候數(shù)據(jù)進(jìn)行提取，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 本實(shí)驗(yàn)所用的20個(gè)環(huán)境因子Tab.2 The 20 environmental factors investigated in the test

2.2 木蘭花堿含量測(cè)定[16]

2.2.1 色譜條件

色譜柱：Pntulips BP-C18柱(250×4.6 mm，2.5 μm)；流動(dòng)相：乙腈(A)與0.1%磷酸-0.1%三乙胺(B)，梯度洗脫(0～10 min，5%～20%A，95%～80%B；10～30 min，20%～40%A，80%～60%B)；流速：1 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)：270 nm；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。

2.2.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱取木蘭花堿對(duì)照品適量，置容量瓶中，加75%甲醇溶液制成濃度為0.4003 mg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.2.3 供試品溶液的制備

取本品粉末約1.0 g，精密稱定，置50 mL具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇溶液25 mL，稱定重量，超聲提取(功率100 W，頻率40 Hz)45 min，取出，放冷，用75%甲醇溶液補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，取15 mL續(xù)濾液，用25 mL石油醚(30～60 ℃)萃取3～4次，至上層顏色無(wú)明顯變化后，得下層萃取液，即為供試品溶液。

2.2.4 專屬性考察試驗(yàn)

為考察供試品溶液的提取溶劑和流動(dòng)相的干擾情況，精密吸取上述對(duì)照品溶液、供試品溶液及空白溶液，按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，如圖1所示，空白溶液在相應(yīng)位置處未見(jiàn)色譜峰，供試品溶液色譜中待測(cè)目標(biāo)峰與木蘭花堿對(duì)照品色譜峰保留時(shí)間和UV光譜圖一致，分離度大于1.5且達(dá)到基線分離，峰純度分別為999.96和999.99。表明該方法專屬性良好。

圖1 人字果專屬性試驗(yàn)的HPLC色譜疊加圖Fig.1 The HPLC overlapping chromatogram of the specificitytest of Dichocarpum dalzielii

2.2.5 線性關(guān)系考察

分別精密吸取上述木蘭花堿對(duì)照品溶液0.1 mL、0.5 mL、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL，置5 mL容量瓶中，加入75%甲醇溶液至刻度，搖勻，配制成系列濃度對(duì)照品溶液，依法分別注入高效液相色譜儀測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，峰面積值為縱坐標(biāo)Y，計(jì)算回歸方程和相關(guān)系數(shù)，得：Y=21.796X-0.6441，r=0.9999。結(jié)果表明木蘭花堿進(jìn)樣量在0.2002～10.01 μg范圍內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取0.4003 mg·mL-1木蘭花堿對(duì)照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，依法測(cè)定，記錄木蘭花堿色譜峰的峰面積，計(jì)算峰面積的RSD值為0.47%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗(yàn)

取人字果藥材(GXG002)粉末約1.0 g，精密稱定，共6份，分別制備供試品溶液，依法分別進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算木蘭花堿的平均含量為4.54 mg/g，RSD值為1.1%，表明該法測(cè)定的重復(fù)性良好。

2.2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

人字果藥材(GXG002)粉末約1.0 g，精密稱定，制備1份供試品溶液，按照上述色譜條件，于0 h、2 h、4 h、8 h、12 h、24 h、48 h分別進(jìn)樣測(cè)定，記錄木蘭花堿色譜峰的峰面積，計(jì)算其峰面積的RSD為0.60%，結(jié)果表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.9 加樣回收試驗(yàn)

取人字果藥材(GXG002)粉末9份，每份約0.5 g，精密稱定，分別按1∶0.5、1∶1、1∶1.5比例加入木蘭花堿對(duì)照品，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定，并記錄木蘭花堿色譜峰的峰面積，計(jì)算木蘭花堿的平均回收率為100.66%，RSD值為2.6%，表明該法測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確度高。結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果(n=9)Tab.3 Results of the spiked recovery tests(n=9)

2.2.10 樣品測(cè)定

分別取23批人字果藥材粉末，按 “2.2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按照上述色譜條件，分別進(jìn)樣測(cè)定，并記錄木蘭花堿色譜峰的峰面積，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算干品藥材中木蘭花堿的含量，結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 23批人字果藥材干品中木蘭花堿測(cè)定結(jié)果(n=3)Tab.4 Determination results of magnoflorine in 23batches of Dichocarpum dalzielii(n=3)

由表4可知，23批干品人字果藥材中木蘭花堿含量在0.16%～1.49%之間，其中貴州獨(dú)山甲定鄉(xiāng)產(chǎn)藥材中(JDX001)木蘭花堿含量最高，為1.49%，貴州綏陽(yáng)觀音巖產(chǎn)藥材中(GYY002)含量最低，為0.16%。

2.3 木蘭花堿含量與環(huán)境因子相關(guān)性分析

2.3.1 雙變量關(guān)聯(lián)分析結(jié)果(BCA)

采用SPSS 26軟件對(duì)木蘭花堿含量及19個(gè)環(huán)境因子提取值進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，選擇Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行雙側(cè)檢驗(yàn)分析，所得結(jié)果：Altitude、Bio2(平均氣溫月較差)、Bio3(等溫性)、Bio13(最濕月降水量)、Bio16(最干季降水量)、Bio17(最濕季降水量)、Bio18(最熱季降水量)、Bio19(最冷季降水量)與木蘭花堿含量呈正相關(guān)，Bio4、Bio7呈負(fù)相關(guān)，而與Bio1(年平均氣溫)、Bio5(最熱月的最高氣溫)、Bio6(最冷月的最低氣溫)、Bio8(最濕季平均氣溫)、Bio10(最熱季平均氣溫)、Bio12(年降水量)、Bio14(最干月降水量)、Bio15(降水量的季節(jié)性變化)無(wú)顯著性關(guān)系(P<0.05)，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，篩選出對(duì)木蘭花堿含量影響具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的環(huán)境因子12個(gè)，見(jiàn)表5。其中木蘭花堿含量與環(huán)境因子的Pearson相關(guān)系數(shù)排列順序?yàn)椋築io18>Bio16>Bio3>Bio4>Bio2>Bio7>Bio13>Altitude>Bio17=Bio19>Bio9=Bio11。

表5 23批人字果藥材不同產(chǎn)地的環(huán)境因子提取值Tab.5 The extracted values of environmental factors of the 23batches of Dichocarpum dalzielii from different producing areas

2.3.2 灰色關(guān)聯(lián)度分析(GRA)

BCA所得結(jié)果顯示，其中8個(gè)環(huán)境因子與木蘭花堿含量無(wú)顯著相關(guān)性，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，將篩選出的12個(gè)與木蘭花堿含量呈顯著相關(guān)的環(huán)境因子所得值導(dǎo)入灰色關(guān)聯(lián)度軟件，選擇鄧氏灰色關(guān)聯(lián)度，得到每個(gè)因子的相關(guān)系數(shù)，見(jiàn)表6。結(jié)果顯示，12個(gè)環(huán)境因子與木蘭花堿含量關(guān)聯(lián)度均大于0.7，表示12個(gè)環(huán)境因子對(duì)木蘭花堿均具有較強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性。其中12個(gè)環(huán)境因子與木蘭花堿含量的鄧氏灰色關(guān)聯(lián)度排列順序?yàn)椋篈ltitude>Bio17>Bio19>Bio13>Bio16>Bio18>Bio3>Bio2> Bio7>Bio4>Bio9=Bio11。

2.3.3 主成分回歸分析(PCR)

由于12組環(huán)境因子之間存在嚴(yán)重共線性，因此選擇主成分回歸分析以解決數(shù)據(jù)之間存在的此類(lèi)問(wèn)題。將“2.3.1”項(xiàng)下篩選出的12個(gè)環(huán)境因子進(jìn)行因子分析，以12個(gè)環(huán)境因子提取值為自變量X，以木蘭花堿含量為因變量Y，其建立的函數(shù)關(guān)系如下：

Y=-7.1744+0.0681X1+0.2381X2-0.0694X3-0.0570X4+0.0444X5+0.0444X6-0.0815X7-0.2350X8-0.0686X9+0.0049X10-0.0686X11+0.0503X12

其中，X1～12表示表5中的12個(gè)與木蘭花堿含量呈顯著相關(guān)的環(huán)境因子。

其標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)見(jiàn)表6，結(jié)果顯示，Altitude、Bio1、Bio2、Bio3、Bio9、Bio11、Bio18顯示正相關(guān)；Bio4、Bio7、Bio13、Bio16、Bio17、Bio19顯示負(fù)相關(guān)。其中，標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)排列順序?yàn)椋築io3>Bio16>Bio2>Bio18>Bio13>Bio4>Bio17 = Bio19>Bio7>haiba>Bio9=Bio11。

表6 多元統(tǒng)計(jì)分析對(duì)不同環(huán)境因子與木蘭花堿含量關(guān)系的相關(guān)系數(shù)Tab.6 Correlation coefficients between different environmentalfactors and magnoflorine content by multivariate statistical analysis

2.3.4 偏最小二乘回歸分析-變量重要性投影(PLS-VIP)

將“2.3.1”篩選出的12個(gè)與木蘭花堿含量呈顯著相關(guān)的環(huán)境因子所得值導(dǎo)入SIMCA 14.1軟件，建立PLS數(shù)理模型，得到其標(biāo)準(zhǔn)化系數(shù)見(jiàn)表6。結(jié)果顯示，木蘭花堿含量與Bio4、Bio7呈負(fù)相關(guān)，與其余9個(gè)環(huán)境因子呈正相關(guān)，其標(biāo)準(zhǔn)回歸系數(shù)大小排序?yàn)椋築io18>Bio16>Bio3>Bio4>Bio2>Bio7>Bio13>Altitude>Bio17=Bio19。選擇12個(gè)環(huán)境因子提取值為自變量X，23批人字果藥材中木蘭花堿含量為因變量Y，其函數(shù)關(guān)系如下：

Y=-0.7624+0.01148X1+0.02064X2-0.00013X3-0.00520X4+0.00190X7+0.00010X8+0.00154X9+0.00165X10+0.00155X11-0.00006X12

以VIP值為依據(jù)，其得分總貢獻(xiàn)率為Bio18>Bio16>Bio3>Bio4>Bio2>Bio13>Altitude>Bio17=Bio19。除Bio9、Bio11變量顯著線超過(guò)矩陣外，其余均未超出矩陣，具統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

圖2 木蘭花堿的VIP得分矩陣圖Fig.2 VIP score matrix diagram of magnoflorine

為綜合評(píng)價(jià)木蘭花堿含量與環(huán)境因子的影響關(guān)系，以BCA、GRA、PCR、PLSR為組別，導(dǎo)入Graphpad prism 8.0 軟件建立堆積柱狀圖，用以表征每個(gè)環(huán)境因子對(duì)木蘭花堿含量的影響情況，見(jiàn)圖3。結(jié)果表明，人字果藥材中木蘭花堿含量與Bio2、Bio3、Bio18、Altitude顯示顯著的正相關(guān)；與Bio13、Bio16、Bio19顯示較為顯著的正相關(guān)；與Bio4、Bio7顯示較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)。

圖3 木蘭花堿含量與12個(gè)環(huán)境因子相關(guān)性堆積柱狀圖Fig.3 Stacked histogram of the correlation between magnoflorinecontent and 12 environmental factors

2.4 人字果相關(guān)指標(biāo)空間含量估計(jì)

以對(duì)木蘭花堿影響較大的等溫性、最熱季降水量以及海拔為解釋變量，采用協(xié)同克里金方法進(jìn)行空間插值計(jì)算，結(jié)果顯示，在采樣范圍內(nèi)木蘭花堿的含量由南部至北部呈逐步降低趨勢(shì)。其中，貴州省獨(dú)山地區(qū)含量最高，見(jiàn)圖4。

圖4 木蘭花堿的空間插值結(jié)果Fig.4 Spatial interpolation results of magnoflorine

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用DAD檢測(cè)器3D圖譜對(duì)檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行了篩選，結(jié)果表明，木蘭花堿在270 nm處有最大吸收，且分離度較好。采用甲醇-水、甲醇-0.1%醋酸水、甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-0.2%磷酸-0.2%三乙胺，乙腈-0.2%磷酸-0.2%二乙胺等進(jìn)行梯度洗脫，目標(biāo)峰與其他雜質(zhì)峰分離效果均不理想，經(jīng)過(guò)進(jìn)一步優(yōu)化，確定乙腈-0.1%磷酸-0.1%三乙胺作為流動(dòng)相。分別對(duì)Thermo Accucore-C18(150×4.6 mm，2.6 μm)、依利特Hypersil ODS(250×4.6 mm，5 μm)、Agilent StableBond Analytical(250×4.6 mm，5 μm)、Pntulips BP-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)4種色譜柱的分離效果進(jìn)行分析比較，結(jié)果表明，Pntulips BP-C18柱(250×4.6 mm，5 μm)的峰形，分離度均較好，故選之。檢測(cè)柱溫為25 ℃時(shí)分離效果較好。

人字果藥材木蘭花堿含量測(cè)定結(jié)果表明同一時(shí)期采集的貴州綏陽(yáng)和獨(dú)山產(chǎn)藥材中木蘭花堿含量相差近4倍，表明不同產(chǎn)地對(duì)人字果藥材中木蘭花堿的含量影響較大，環(huán)境因子可能對(duì)其成分累積具有重要影響作用。因此，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步提取出不同產(chǎn)地的環(huán)境因子并結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)23批人字果藥材的木蘭花堿含量與環(huán)境因子進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，對(duì)其影響情況及相關(guān)性進(jìn)行初步研究。如圖3結(jié)果顯示，木蘭花堿含量與等溫性(Bio3)、最熱季降水量(Bio18)、海拔(Altitude)顯示顯著正相關(guān)，即較高的等溫性，充沛的水分，較高的海拔，較高的日照環(huán)境對(duì)人字果藥材次生代謝產(chǎn)物木蘭花堿的含量具有正向累積作用；與氣溫季節(jié)性變動(dòng)系數(shù)(Bio4)、氣溫年較差(Bio7)顯示較強(qiáng)的負(fù)相關(guān)，即較小氣溫季節(jié)性變動(dòng)系數(shù)及氣溫年較差對(duì)木蘭花堿的含量具有正向累積作用，而B(niǎo)io3、Bio4、Bio7這3個(gè)氣候因子均與溫度有關(guān)，可初步說(shuō)明溫度可能是影響人字果藥材內(nèi)木蘭花堿含量的決定性因子。其次，降水量也與木蘭花堿含量呈較強(qiáng)相關(guān)性，側(cè)面反映了水分條件對(duì)于人字果藥材內(nèi)次生代謝產(chǎn)物木蘭花堿的累積具有重要影響，較高的降水量有利于人字果藥材中木蘭花堿成分的累積。另外，氣溫季節(jié)性變動(dòng)系數(shù)、氣溫年較差均與木蘭花堿的含量呈較強(qiáng)負(fù)相關(guān)，可見(jiàn)，人字果藥材中木蘭花堿的含量對(duì)氣溫季節(jié)性變化的響應(yīng)較為明顯，且初步推測(cè)氣溫變化較大的區(qū)域不適合人字果藥材中木蘭花堿成分的累積。綜上，較高的等溫性、充沛的水分、較高的海拔及較小的氣溫季節(jié)性變化對(duì)人字果藥材中次生代謝產(chǎn)物木蘭花堿的累積具有積極意義。此外，從空間插值結(jié)果來(lái)看，木蘭花堿含量在貴州省獨(dú)山地區(qū)顯示最高。

本文結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)方法對(duì)人字果中木蘭花堿含量與環(huán)境因子的相關(guān)性分析，初步揭示了影響人字果藥材中木蘭花堿成分累積的主導(dǎo)環(huán)境因子，為人字果藥材的質(zhì)量控制及其野生變家種研究提供理論依據(jù)。