蘇火煌

(1.漳州職業(yè)技術(shù)學(xué)院應(yīng)用化工學(xué)院，福建 漳州 363000；2.福建省精細(xì)化工應(yīng)用技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，福建 漳州 363000)

蘆柑(CitrusreticulataBlanco cv. Ponkan)，又名柑果，是福建省的優(yōu)勢(shì)果類之一[1-2]。目前，對(duì)蘆柑的研究主要集中在果肉、果皮和果核上，而對(duì)蘆柑葉研究較少[3-4]。植物的根、莖、葉中一般含有多酚、多糖、黃酮、生物堿等多種具有生物活性的天然成分。陳建福等[3]對(duì)蘆柑葉中的總黃酮進(jìn)行提取，發(fā)現(xiàn)總黃酮具有一定的抗氧化活性，是一種天然抗氧化劑。多酚也是一種具有抗自由基、抗腫瘤、抗氧化等多種生物活性的一類天然化合物，在食品、醫(yī)藥、化妝品等行業(yè)中均有廣泛的應(yīng)用[5-7]。

肉制品生產(chǎn)過程中常添加亞硝酸鹽，其具有發(fā)色和抑菌作用；蔬菜儲(chǔ)存或腌制時(shí)，在微生物的作用下也會(huì)導(dǎo)致亞硝酸鹽的積累。亞硝酸鹽的清除主要依靠酸解、酶解和還原清除等[8]。研究表明，植物中的一些天然成分能與亞硝酸鹽反應(yīng)，從而實(shí)現(xiàn)消除或降低食物中的亞硝酸含量[9-10]。目前，蘆柑葉多酚提取與清除亞硝酸鹽能力的研究鮮見報(bào)道。本文以蘆柑葉為原料，先考察了乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和超聲溫度四個(gè)單因素對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響，再結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)提取率工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，最后考察了蘆柑葉多酚對(duì)亞硝酸鹽的清除能力，為蘆柑葉資源開發(fā)成一種新型的天然亞硝酸鹽清除劑提供了科學(xué)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料及儀器

蘆柑葉，采摘于福建省南靖縣金山鎮(zhèn)上麻村。將采摘的蘆柑葉用清水清洗，去除泥沙并晾干，置于50℃干燥箱中烘干，粉碎后備用。

乙醇(食品級(jí)，河南鑫河陽酒精有限公司)；其它試劑均為分析純。

UV-1100型紫外可見分光光度計(jì)(上海美譜達(dá)儀器有限公司)；KQ-100TDE超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

采用福林-酚法[11]，在10 mL的比色管中加入一定系列體積的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)和福林-酚試劑0.5 mL，搖勻靜置1 min，加入1.5 mL 20%的Na2CO3溶液，定容，在設(shè)定溫度為75℃的恒溫水浴鍋中保溫反應(yīng)10 min，反應(yīng)結(jié)束后，靜置冷卻。設(shè)置紫外可見分光光度計(jì)的吸收波長(zhǎng)為765 nm，測(cè)反應(yīng)液的吸光度。以沒食子酸濃度c為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.2 蘆柑葉多酚的提取及含量測(cè)定

設(shè)置好實(shí)驗(yàn)所需的工藝條件，稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，加入一定體積和一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液，后將圓底燒瓶浸入到設(shè)定好溫度的超聲波清洗器中，達(dá)到設(shè)定的時(shí)間后，取出冷卻后過濾，定容，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定方法，計(jì)算出多酚含量，多酚提取率按下式計(jì)算：

其中，T為多酚提取率(mg/g)，b為多酚質(zhì)量濃度(mg/L)，N為稀釋倍數(shù)，V為提取液體積(mL)，m為蘆柑葉質(zhì)量(g)。

1.2.3 單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.3.1 乙醇濃度的影響

稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，分別加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為50%、55%、60%、65%、70%的乙醇，在預(yù)先設(shè)置溫度為60℃的超聲波清洗器中浸提50 min。計(jì)算蘆柑葉多酚提取率，確定最佳的乙醇濃度。

1.2.3.2 超聲時(shí)間的影響

稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，加入20 mL 體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，在預(yù)先設(shè)置溫度為60℃的超聲波清洗器中分別浸提40、45、50、55和60 min。計(jì)算蘆柑葉多酚提取率，確定最佳的超聲時(shí)間。

1.2.3.3 液料比的影響

稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，分別加入10、15、20、25和30 mL 體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，在預(yù)先設(shè)置溫度為60℃的超聲波清洗器中浸提50 min。計(jì)算蘆柑葉多酚提取率，確定最佳的液料比。

1.2.3.4 超聲溫度的影響

稱取1 g蘆柑葉粉末到圓底燒瓶中，加入20 mL體積分?jǐn)?shù)為60%的乙醇，分別在預(yù)先設(shè)置溫度為50、55、60、65和70℃的超聲波清洗器中浸提50 min。計(jì)算蘆柑葉多酚提取率，確定最佳的超聲溫度。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

在單因素乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)、超聲溫度(D)對(duì)多酚提取率影響的基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken試驗(yàn)方法對(duì)各單因素進(jìn)行響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，見表1。

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素與水平表

1.2.5 蘆柑葉總多酚對(duì)亞硝酸鹽的清除率

在一系列25 mL的比色管中分別加入10.0 mL pH為3.0的緩沖液(檸檬酸-磷酸氫二鈉)，后分別加入一系列質(zhì)量濃度的蘆柑葉多酚溶液(或維生素C溶液)，再加入1.0 mL 50 mg/L的NaNO2，并在37℃水浴中保溫1 h，后加入2.0 mL 0.4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的對(duì)氨基苯磺酸，靜置5 min后，加入1.0 mL 0.2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的鹽酸萘乙二胺，加蒸餾水定容，靜置15 min后在540 nm處測(cè)得吸光度A，空白時(shí)的吸光度A0，亞硝酸鹽清除率Q(%)，計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

以沒食子酸濃度c為橫坐標(biāo)，以吸光度A為縱坐標(biāo)，得到回歸方程為A= 0.102 3c- 0.029 7,R2=0.999 2。

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

2.2.1 乙醇濃度對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響

如圖1所示，乙醇濃度在60%時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)，繼續(xù)增大乙醇濃度，多酚提取率卻開始變小。這是因?yàn)樗臉O性比乙醇大，乙醇濃度的增大，乙醇中的含水量降低，導(dǎo)致乙醇極性降低，提高了蘆柑葉顆粒中一些具有較小極性的多酚類物質(zhì)的浸出率。然而當(dāng)乙醇濃度過高時(shí)，溶劑的極性過小，導(dǎo)致蘆柑葉顆粒中部分細(xì)胞壁上的蛋白質(zhì)變性，阻礙了多酚類物質(zhì)的溶出[12]，因此確定最佳乙醇濃度為60%。

圖1 乙醇濃度對(duì)多酚提取率的影響

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多酚提取率的影響

2.2.2 超聲時(shí)間對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響

如圖2所示，超聲時(shí)間由40 min增加到60 min的過程中，蘆柑葉多酚的提取率逐漸增加，并在50 min時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)，繼續(xù)增加超聲時(shí)間，多酚提取率卻開始變小。這是因?yàn)槌晻r(shí)間較短時(shí)，蘆柑葉多酚還不能充分溶出，但超聲時(shí)間過長(zhǎng)，提取液中部分熱敏性較差的多酚類物質(zhì)會(huì)而發(fā)生氧化與破壞[13]，因此確定最佳超聲時(shí)間為50 min。

2.2.3 液料比對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響

如圖3所示，液料比由10 mL/g增加到30 mL/g的過程中，蘆柑葉多酚的提取率逐漸增加，并在20 mL/g時(shí)達(dá)到頂點(diǎn)，繼續(xù)增加液料比，多酚提取率卻開始變小。這是因?yàn)橐毫媳鹊脑龃笥欣谔J柑葉顆粒與提取液的充分接觸，使溶出的多酚增加。但當(dāng)液料比過大時(shí)，蘆柑葉顆粒中的蛋白質(zhì)等雜質(zhì)成分會(huì)與多酚類物質(zhì)發(fā)生溶出競(jìng)爭(zhēng)[14]，因此確定最佳液料比為20 mL/g。

圖3 液料比對(duì)多酚提取率的影響

圖4 超聲溫度對(duì)多酚提取率的影響

2.2.4 超聲溫度對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響

如圖4所示，超聲溫度由50℃增加到70℃的過程中，蘆柑葉多酚的提取率逐漸增加，并在60℃時(shí)達(dá)到最頂點(diǎn)，繼續(xù)增加超聲溫度，多酚提取率卻開始變小。這是因?yàn)闇囟鹊纳撸J柑葉顆粒內(nèi)物質(zhì)與溶劑的接觸與交換的頻率增加，使得酚的提取率增大[15]，但超聲溫度太高時(shí)，多酚中某些熱敏性較差的物質(zhì)會(huì)因?yàn)闇囟冗^高而發(fā)生氧化，因此確定最佳超聲溫度為60℃。

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

2.3.1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)中各單因素的取值范圍，以多酚提取率為響應(yīng)值(Y)，結(jié)合Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，確定以乙醇濃度(A)、超聲時(shí)間(B)、液料比(C)和超聲溫度(D)4個(gè)因素為多酚提取率的影響因素，并設(shè)計(jì)響應(yīng)面方案，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，得到實(shí)驗(yàn)結(jié)果及方差分析分別見表2和表3。

表2 響應(yīng)面分析方案及結(jié)果

利用Design-Expert 8.05b軟件對(duì)表2中的29個(gè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，得到多酚提取率(Y)與所考察的四個(gè)因素的二次多項(xiàng)回歸模型：

Y=32.10+0.52A+0.27B+0.10C+1.72D-0.13AB+0.27AC+0.50AD+0.09BC-0.51BD-0.14CD-2.47A2-1.62B2-1.26C2-1.76D2.

表3 方差分析結(jié)果

方差分析結(jié)果見表3。從表3可知，該回歸模型的P<0.000 1，F(xiàn)=10.790，說明響應(yīng)面優(yōu)化得到的回歸模型達(dá)到了非常顯著的水平；失擬項(xiàng)P=0.093 7>0.05，失擬項(xiàng)不顯著，表明響應(yīng)面優(yōu)化得到的回歸方程的殘差均由隨機(jī)誤差引起。決定系數(shù)R2=0.915 2，表明該回歸方程具有較好的擬合度，有超過91.52%實(shí)驗(yàn)真實(shí)值可以利用該回歸模型來描述?；貧w方程模型中一次方項(xiàng)D,二次方項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)蘆柑葉多酚提取率影響均達(dá)到了極顯著水平(P<0.01);一次方項(xiàng)A對(duì)蘆柑葉多酚提取率影響達(dá)到了顯著水平(P<0.05)；剩余的其它項(xiàng)對(duì)蘆柑葉多酚提取率影響均不顯著(P>0.05)。由此說明蘆柑葉多酚的各提取因素與蘆柑葉多酚提取率之間的函數(shù)關(guān)系較為復(fù)雜。綜上分析，該回歸模型具有較高的擬合度和較小的誤差，準(zhǔn)確率高，可以用于蘆柑葉多酚提取工藝的分析與預(yù)測(cè)。

2.3.2 響應(yīng)曲面圖分析

圖5為乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和超聲溫度之間的交互作用對(duì)蘆柑葉多酚提取率影響的響應(yīng)面和等高線圖，通過響應(yīng)面曲面的斜率和等高線密集度可以直接確定各工藝因素交互作用對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響程度，響應(yīng)面曲面的斜率越大，等高線越密集，表明乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和超聲溫度等因素間的交互作用對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響越大，反之則越小。對(duì)圖5中的各個(gè)響應(yīng)面和等高線圖進(jìn)行比較分析，可以發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間與超聲溫度的響應(yīng)面曲面斜率最大，等高線最密集，說明乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和超聲溫度四個(gè)因素間的交互作用對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響最顯著的是超聲時(shí)間與超聲溫度，而響應(yīng)面曲面斜率和等高線最密集程度次之的是乙醇濃度與超聲溫度，說明工藝因素間的交互作用對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響程度次之的是乙醇濃度與超聲溫度，同理可得影響蘆柑葉多酚提取率程度的顯著性順序?yàn)锽D>AD>AC>CD>AB>BC。

(a)

(b)

(c)

(d)

(e)

(f)

(g)

(h)

(i)

(j)

(k)

(l)

2.3.3 最優(yōu)工藝條件驗(yàn)證

根據(jù)表2的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，并利用Design-Expert 8.05b軟件進(jìn)行分析，確定超聲波輔助提取蘆柑葉多酚的最佳工藝參數(shù)為：乙醇濃度60.79%、超聲時(shí)間50.00 min、液料比20.14 mL/g和超聲溫度62.55℃，此時(shí)通過軟件計(jì)算的蘆柑葉多酚提取率的理論值為32.58 mg/g。由于理論的最佳參數(shù)，實(shí)驗(yàn)條件設(shè)置較為不便，將工藝修正為:乙醇濃度61%、超聲時(shí)間50 min、液料比20 mL/g和超聲溫度63℃，并在此工藝下進(jìn)行三次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，得到蘆柑葉多酚的提取率為32.27 mg/g，其與模型預(yù)測(cè)的理論值相對(duì)誤差為0.95%，說明所建的模型方程準(zhǔn)確、可靠，可應(yīng)用于蘆柑葉多酚提取工藝的預(yù)測(cè)。

2.4 蘆柑葉多酚對(duì)亞硝酸鹽的清除率

如圖6所示，隨著維生素C和蘆柑葉多酚質(zhì)量濃度的增加，兩者對(duì)亞硝酸鹽的清除率均逐漸增大，說明在所考察的濃度范圍內(nèi)，蘆柑葉多酚均能較好地清除亞硝酸鹽，且與亞硝酸鹽的清除率之間存在一定的量效關(guān)系，維生素C和蘆柑葉多酚對(duì)亞硝酸鹽清除的IC50分別為1.41 mg/L和1.93 mg/L。

圖6 維生素C和多酚對(duì)亞硝酸鹽的清除率比較

3 結(jié)語

利用天然植物提取物來降解食物中的亞硝酸鹽是一種高效且安全的方法，孫昕等[16]采用酶解法對(duì)生姜中的姜辣素進(jìn)行提取，確定了姜辣素的最佳提取工藝，當(dāng)提取的姜辣素質(zhì)量濃度為17.5 mg/mL時(shí)，亞硝酸鹽的清除率可達(dá)99%以上，其清除能力與1 mg/mL的的抗壞血酸溶液相當(dāng)。LUO等[17]研究了兩色金雞菊總皂苷的提取工藝，在總皂苷對(duì)亞硝酸鹽清除能力和亞硝胺生成的抑制活性的實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn),兩色金雞菊總皂苷具有一定的亞硝酸鹽清除能力，并且具有較好的抑制亞硝胺生成的活性。本文以蘆柑葉為原料，考察了乙醇濃度、超聲時(shí)間、液料比和超聲溫度四個(gè)單因素對(duì)蘆柑葉多酚提取率的影響，再結(jié)合響應(yīng)面法對(duì)提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，確定了蘆柑葉多酚的最佳提取工藝：乙醇濃度61%，超聲時(shí)間50 min，液料比20 mL/g和超聲溫度63℃，得到蘆柑葉多酚的提取率為32.27 mg/g，其與模型預(yù)測(cè)的理論值相對(duì)誤差為0.95%，說明所建的模型方程準(zhǔn)確、可靠，可應(yīng)用于蘆柑葉多酚提取工藝的預(yù)測(cè)。在所考察的濃度范圍內(nèi)，蘆柑葉多酚均能較好地清除亞硝酸鹽，且與亞硝酸鹽的清除率之間存在一定的量效關(guān)系，蘆柑葉多酚對(duì)亞硝酸鹽清除的IC50為1.93 mg/L，為蘆柑葉資源開發(fā)成為一種新型的天然亞硝酸鹽清除劑提供了科學(xué)依據(jù)。