孫卓楠，付振鑫，孫玉榮，劉 旭，張寶俊

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué) 植物保護學(xué)院，山西 太谷 030801）

聚酮合成酶（Polyketide Synthase，PKS）可催化聚酮類化合物形成芪類、黃酮類化合物、抗生素及真菌毒素等多種物質(zhì)，在防御UV、植物體營養(yǎng)生長及響應(yīng)病原菌侵染等方面具有至關(guān)重要的作用[1-2]。根據(jù)蛋白結(jié)構(gòu)可將PKS分為I、II和III型，其中III型PKS即查爾酮合酶（Chalcone synthase，CHs），包括Cys164、Phe215、His303和Asn336等4個保守殘基，可催化生成一系列結(jié)構(gòu)各異、具有不同生理活性、含CHs基本骨架的植物次生代謝產(chǎn)物[3]。CHs是植物類黃酮生物合成途徑中的第1個關(guān)鍵酶，催化一分子香豆酰-CoA和三分子丙二酰-CoA生成四酮中間體，再進一步環(huán)化為查爾酮[4-5]。研究表明，CHs不僅催化類黃酮的合成而且在花青素合成、植物根瘤形成、抵抗生物脅迫和預(yù)防紫外線損傷中發(fā)揮重要作用[6-7]。

CHs基因是多基因家族，保守性較強，蛋白序列長度約400個氨基酸，在水稻、玉米、煙草及擬南芥等植物中已有研究[8]。典型的CHs家族成員參與花色素合成途徑，還有部分成員與植物抗真菌病害有關(guān)[9]，比如矮牽牛CHs突變體的花冠與花藥顏色變淺且雄性不育，而這種表型可被CHs轉(zhuǎn)基因互補[10]；高粱接種炭疽菌（Colletotrichum sublineolum）后，CHs活性升高，花青素、芹菜素大量積累，從而使高粱對炭疽菌侵染的抗性提高[11]；棉花受枯萎病菌（Fusarium oxysporumf.sp.Vasinfectum）侵染時，棉花CHs家族基因通過苯丙氨酸代謝途徑合成大量類黃酮物質(zhì)，防御病原菌侵染[12]；黃瓜中CHs基因上調(diào)表達(dá)，黃酮類物質(zhì)大量合成，誘導(dǎo)黃瓜產(chǎn)生抗性抵抗白粉病菌（Sphaerotheca fuliginea）的侵染[13]；紫甘薯中編碼CHs的基因發(fā)生突變后更容易被立枯絲核菌（Rhizoctonia solani）侵染，當(dāng)轉(zhuǎn)入CHs基因后紫甘薯合成大量類黃酮物質(zhì)抵抗病原菌的侵染[14]?？梢姡珻Hs基因催化合成類黃酮等抗病類物質(zhì)，調(diào)控水楊酸防御途徑，在植物響應(yīng)生物與非生物脅迫的過程中有著極其重要的作用。

谷子（Sitaria italica）是我國重要的糧食作物，具有基因組小、生命周期短、抗旱抗貧瘠等特點，是C4植物抗逆基因挖掘的模式植物[15]。近年來，谷子種植面積擴大，谷子白發(fā)病、谷子銹病及谷瘟病等病害加重，嚴(yán)重影響谷子的生長及品質(zhì)[16]。

本研究通過對谷子CHs家族基因成員的鑒定及同源進化分析，結(jié)合其組織特異性表達(dá)分析以及在響應(yīng)禾生指梗霉菌（Sclerospora graminicola）侵染的差異表達(dá)分析，以明確CHs家族基因在谷子生長發(fā)育及抗病其他代謝通路中的作用，為谷子抗病育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 SiCHs基因家族數(shù)據(jù)獲取及鑒定

從Multi—omics Database for Setaria italica數(shù)據(jù) 庫（http://foxtail—millet.biocloud.net/home）獲取xiaomi全基因組數(shù)據(jù)，利用Pfam數(shù)據(jù)庫（http://pfam.xfam.org/）構(gòu)建的Chal_sti_synt_C（PF00195）和Chal_sti_synt_N（PF02797）結(jié)構(gòu)域的HMM模型，在TBtools[17]中利用Simple HMM Search程序，在xiaomi全基因組蛋白序列中選取比對值E—value<0.01的同源序列。

1.2 SiCHs基因蛋白特性分析、亞細(xì)胞預(yù)測及基因定位

利 用ExPASy—ProtParam tool（https://web.expasy.org/protparam/）預(yù)測谷子CHs家族蛋白序列的氨基酸數(shù)目、分子量及等電點。通過在線網(wǎng)站（http://psort1.hgc.jp/form.html）進行亞細(xì)胞定位。通過谷子的基因組注釋gff3文件，利用TBtools（http://dx.doi.org/10.1101/289660）對基因定位的結(jié)果進行可視化。

1.3 SiCHs基因同源進化分析及motif分析

通過MEGA 7.0[18]對篩選到的玉米、水稻和谷子的CHs家族蛋白序列進行比對后，再用最大似然法（Maximum Likelihood Estimate，MLE）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，iTOL（https://itol.embl.de/）優(yōu)化進化樹，利用MEME（http://meme—suite.org/tools/meme）分析保守motif，并用TBtools可視化作圖。

1.4 SiCHs啟動子順式作用元件分析

提取起始密碼子上游2 000 bp的基因組序列為啟動子序列，在Plant CARE數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）預(yù)測其順式作用元件，并用TBtools進行可視化作圖。

1.5 SiCHs基因家族特異性表達(dá)分析

從Multi—omics Database for Setaria italica數(shù)據(jù) 庫(http://foxtail—millet.biocloud.net/home)中獲得谷子種子、根、莖、穗、葉等不同組織的基因表達(dá)量數(shù)據(jù)，通過R3.4.4繪制谷子CHs基因組織差異表達(dá)熱圖，進行可視化分析。

1.6 SiCHs基因家族響應(yīng)禾生指梗霉菌侵染的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

處理組（TG）將種子與2020年禾生指梗霉菌卵孢子按照10∶1比例混勻后種植，將耕層土壤與卵孢子按500∶1（0.2%）比例充分混勻覆蓋于種子上，菌土覆蓋2~3 cm。對照組（CK）種子采用75%無水乙醇消毒，種植于山西農(nóng)業(yè)大學(xué)雜糧基地。自谷子雌雄蕊分化期至開花期間，谷穗受禾生指梗霉菌侵染刺激后，谷子穎花結(jié)構(gòu)中俘片顯著伸長，引起花變?nèi)~形成“刺猬頭”。本試驗在雌雄蕊分化期至開花期每隔3 d剪取谷穗中上部，共取5次，對照組編號為CK1~CK5，處理組編號為TG1~TG5，液氮速凍，-80℃保存，3次生物學(xué)重復(fù)。將上述樣品進行轉(zhuǎn)錄組測序建庫，利用轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中FPKM值，通過R 3.4.4繪制谷子CHs基因響應(yīng)禾生指梗霉菌侵染的表達(dá)熱圖，進行可視化分析，通過Gene Ontology（GO）數(shù)據(jù)庫（http://geneontology.org）對差異表達(dá)基因進行GO富集分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 SiCHs基因家族的鑒定、理化性質(zhì)和基因定位

通過Pfam數(shù)據(jù)庫篩選得到同時含有Chal_sti_synt_C和Chal_sti_synt_N等2個結(jié)構(gòu)域的SiCHs家族基因共33個（圖1），按照其在染色體上的位置（圖2），命名為SiCHs1~SiCHs33，其中，SiCHs1~SiCHs33分布于谷子1、2、4、5、7、8、9號染色體，其中在8號染色體上分布最多為11個（SiCHs17~SiCHs27）。對SiCHs蛋白進行理化性質(zhì)和亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示（表1），除SiCHs19僅編碼156個氨基酸外，其余SiCHs基因編碼氨基酸序列長度在331~530 bp，平均氨基酸數(shù)目423個；蛋白分子質(zhì)量為16.74~57.50 ku；SiCHs家族33個成員的總平均親水性（GRAVY）為負(fù)值，為疏水性蛋白；亞細(xì)胞定位多在細(xì)胞質(zhì)，為一類調(diào)控酶合成的蛋白。

2.2 SiCHs家族蛋白序列同源進化分析及保守基序分析

對玉米、水稻與谷子的98個CHs蛋白進行比對，結(jié)果顯示，CHs基因被分為5大類（圖3）。class1含有15個CHs同源基因，包括6個谷子CHs、6個玉米CHs和3個水稻CHs；class2含有16個CHs同源基因，包括5個谷子CHs、7個水稻CHs和4個玉米CHs；class3含有13個CHs同源基因，包括7個谷子CHs、3個水稻CHs和3個玉米CHs；class4含有24個CHs同源基因，包括3個谷子CHs、17個水稻CHs和4個玉米CHs；class5含有30個CHs同源基因，包括12個谷子CHs、13個玉米CHs和5個水稻CHs。其 中，SiCHs13、SiCHs14、SiCHs25和SiCHs27這4個基因單獨分支，推測不同物種在進化過程中部分基因功能不同。

SiCHs基因家族成員的保守序列基序分析顯示（圖4），33個SiCHs蛋白序列共鑒定到8個保守序列基序，命名為motif1～motif8。33個SiCHs蛋白序列中均存在motif3、motif8和motif6，motif3中較為保守的序列為DLRLASLLGLRPSVRRTMLYG MGCSAGLAALRLAKDLAE，motif8中較為保守的序列為NNRGARVLVVCSEIT，motif6中較為保守的序列為MLVGQALFGDGAAAVIVGADP。class1~class5中，class2中的SiCHs24、SiCHs17不包含motif2；class3中的SiCHs19不包含motif1、motif2、motif4、motif5；class4中的SiCHs31不包含motif4、motif2、motif7；class5中SiCHs30、SiCHs1不包含motif2，且SiCHs2、SiCHs9、SiCHs10、SiCHs11、SiCHs15、SiCHs32、SiCHs33不包含motif2、motif4，其余class1~class5中SiCHs基因均含有motif1~motif8，且排布基本一致。說明CHs蛋白家族成員基本結(jié)構(gòu)相對保守。

2.3 SiCHs基因家族啟動子順式作用元件

對SiCHs基因上游2 000 bp的序列進行順式作用元件預(yù)測，結(jié)果共鑒定了20種順式作用元件（圖5）。SiCHs12、SiCHs26包含的順式調(diào)控元件最多為12種；SiCHs15包含的順式調(diào)控元件最少僅3種。該家族中具有防御和應(yīng)激響應(yīng)元件的基因有16個，8個基因具有玉米醇溶蛋白代謝調(diào)節(jié)響應(yīng)元件，3個基因具有類黃酮生物合成基因調(diào)控響應(yīng)元件，表明谷子CHs基因家族可能參與調(diào)控谷子響應(yīng)病菌侵染的過程；31個基因具有MeJA響應(yīng)元件，29個基因具有脫落酸響應(yīng)元件，具有赤霉素響應(yīng)元件的基因數(shù)目達(dá)18個，具有生長素響應(yīng)元件的基因為12個，具有水楊酸響應(yīng)元件的基因為7個，表明谷子CHs基因家族可能參與調(diào)控激素合成信號。此外，SiCHs家族基因還包括低溫響應(yīng)、干旱脅迫、光響應(yīng)、分生組織表達(dá)、胚乳表達(dá)等順式作用元件。

2.4 SiCHs基因家族特異表達(dá)分析

SiCHs基因在Xiaomi不同組織中的表達(dá)結(jié)果表明（圖6），在莖中，SiCHs2、SiCHs27、SiCHs32基因表達(dá)量高于其他基因，其中SiCHs27表達(dá)量高達(dá)377.31，SiCHs2、SiCHs32基因表達(dá)量分別為86.57和86.92，其余基因低表達(dá)或不表達(dá)。在根中，SiCHs18基因表達(dá)量為89.74，其余基因低表達(dá)或不表達(dá)。在種子、葉和穗中SiCHs家族基因低表達(dá)或不表達(dá)。測定結(jié)果表明，谷子CHs家族基因的表達(dá)存在組織特異性表達(dá)。

2.5 SiCHs基因家族響應(yīng)禾生指梗霉菌侵染的轉(zhuǎn)錄表達(dá)分析

在CK 1~CK 5、TG1~TG5這10個樣本中，去除表達(dá)量為0的5個基因（SiCHs3、SiCHs5、SiCHs16、SiCHs18、SiCHs19）。對樣本中其余28個共有的差異表達(dá)基因進行聚類分析，根據(jù)表達(dá)模式的不同，可將這些差異表達(dá)基因聚為2類（圖7）。聚類1（Cluster1）中有6個基因，與CK組比較，TG組表達(dá)下調(diào)，GO功能富集在脂肪酸的生物合成過程（GO:006633）、四酮α—吡喃酮合酶活性（GO:0090439）、花粉外壁形成（GO:0010584）、苯丙烷生物合成（GO:0009699）、聚酮生物合成（GO:0030639）、孢粉素生物合成（GO:0080110）等通路。聚類2（Cluster2）中有22個基因，與CK組比較，TG組表達(dá)上調(diào)，且在TG4、TG5時期顯著上調(diào)，GO功能富集在類黃酮物質(zhì)合成（GO:0009813）、查耳酮生物合成（GO:0009715）、花青素生物合成（GO:0031540）、蠟質(zhì)合成（GO:0010025）、防御反應(yīng)（GO:0009611）、生長素運輸（GO:0009926）、茉莉酸抗病性（GO:0009753）、花粉管發(fā)育（GO:0048868）等通路。說明谷子受禾生指梗霉侵染后，CHs家族基因通過合成抗病類次生代謝產(chǎn)物及調(diào)控激素來防御病原菌侵染。

3 結(jié)論與討論

本研究利用生物信息學(xué)方法對Xiaomi中的33個CHs基因進行分析發(fā)現(xiàn)，SiCHs基因與玉米、擬南芥、水稻等同源性較高，可能與同屬禾本科單子葉植物有關(guān)，CHs家族在進化過程中相對保守。SiCHs家族成員多分布于8號染色體上，這與擬南芥中鑒定的聚類和分布情況相似[19]。亞麻中疏水性氨基酸占比較高，與本研究中SiCHs家族基因結(jié)果一致[20]。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，SiCHs蛋白多在細(xì)胞質(zhì)，為一類調(diào)控酶合成的蛋白。林玲等[21]研究發(fā)現(xiàn)，辣木CHs基因在細(xì)胞質(zhì)形成結(jié)合位點，與酶合成相關(guān)。SiCHs基因家族在Xiaomi不同組織中特異表達(dá)，在多種植物中也觀察到類似的現(xiàn)象，如擬南芥、苦蕎、辣椒等[22]。SiCHs2、SiCHs27和SiCHs32基因的表達(dá)主要集中在莖部，與茶樹CHs基因在莖中表達(dá)量最高的結(jié)果相一致[23]。SiCHs18基因的表達(dá)主要集中在根部，與桑樹CHs4基因在根皮中顯著表達(dá)的結(jié)果一致[24]。

對SiCHs啟動子順式作用元件預(yù)測分析，發(fā)現(xiàn)SiCHs啟動子區(qū)含有茉莉酸甲酯、水楊酸、生長素、赤霉素、脫落酸反應(yīng)等激素響應(yīng)元件，推測SiCHs的表達(dá)可能受激素影響。這與在煙草中CHs基因NTCHs啟動子區(qū)也含有茉莉酸甲酯、水楊酸、生長素等激素響應(yīng)元件一致[25]。其次，SiCHs啟動子區(qū)含有類黃酮合成基因調(diào)控、玉米醇溶蛋白代謝、低溫反應(yīng)、干旱脅迫等防御應(yīng)激響應(yīng)元件，預(yù)測SiCHs可提高谷子抵抗逆境脅迫和病原菌侵染的能力。水稻CHs啟動子區(qū)包含類黃酮物質(zhì)合成、干旱誘導(dǎo)、缺氧誘導(dǎo)等防御和脅迫響應(yīng)的作用元件[26]。再者，SiCHs啟動子區(qū)含有分生組織表達(dá)、胚乳表達(dá)等順式作用元件，與蕎麥中CHs基因的部分啟動子元件功能一致[27]，推測SiCHs可能參與谷子生長發(fā)育調(diào)控。

本研究發(fā)現(xiàn)，受禾生指梗霉菌侵染，SiCHs家族中22個基因在穗部誘導(dǎo)高表達(dá)，類黃酮、花青素等抗病類次生代謝物質(zhì)合成及水楊酸、茉莉酸、生長素等激素合成途徑顯著富集。芒果CHs基因表達(dá)量與查爾酮含量協(xié)同增減，查爾酮對11種芒果病原菌均具有明顯抑制活性，MiCHs參與了植物自身防御反應(yīng)[28]。大麗輪枝菌侵染擬南芥后，AtCHs基因上調(diào)表達(dá)，并合成花青素、類黃酮等抵抗病原菌的侵染[29]。推測谷子受禾生指梗霉菌侵染后，SiCHs家族基因通過合成抗病類次生代謝產(chǎn)物及調(diào)控激素來防御病原菌侵染及擴展。

本研究基于Xiaomi基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，鑒定了33個SiCHs基因。通過染色體定位分析，發(fā)現(xiàn)8號染色體上基因最多，且位于8號染色體的SiCHs27在莖部特異表達(dá)，SiCHs18在根部特異表達(dá)。SiCHs啟動子序列包含與激素響應(yīng)相關(guān)、抗病類次生代謝、生長發(fā)育調(diào)控及逆境響應(yīng)等順式作用元件。SiCHs家族基因通過調(diào)控激素、類黃酮物質(zhì)合成等途徑抵抗禾生指梗霉菌的侵染。本研究結(jié)果可為進一步分析谷子CHs基因家族的功能及在谷子生長過程中的調(diào)控機制提供參考。