趙春超，張宏江，臧敦秀，崔紅利，李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學 農(nóng)學院/分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所，山西 太谷 030801）

來源于高等油料植物和富油微藻的植物油脂主要用于人類食用油和脂肪酸營養(yǎng)，亦是油脂化工和生物燃油等工業(yè)的優(yōu)質(zhì)原料。三酰甘油（Triacylglycerols,TAG）是真核生物儲存能量的主要物質(zhì)形式[1]，以應對不利的環(huán)境條件[2]，也在植物種子萌發(fā)過程中發(fā)生分解，為幼苗生長提供新能量。與高等油料植物相比，微藻具有光合作用強、生長周期短、繁殖速度快和油脂產(chǎn)量高等特點，并且被認為是蛋白質(zhì)、肽、氨基酸、多糖、維生素、激素和脂肪酸等生物活性物質(zhì)的優(yōu)良生產(chǎn)者[3]，市場開發(fā)應用潛力巨大。

雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）是一種淡水單細胞綠藻，在脅迫條件下能合成和貯存大量類胡蘿卜素-蝦青素（Astaxanthin），被認為是獲得天然蝦青素最佳的生物種質(zhì)。誘導雨生紅球藻蝦青素合成積累的脅迫條件包括高光[4]、氮缺乏[5]、高光與氮缺乏或磷缺乏結(jié)合[6]、營養(yǎng)脅迫[7]、鹽脅迫[8]、高溫[9]和化學調(diào)節(jié)劑[10]等。雨生紅球藻細胞中的蝦青素主要以酯的形式存在，包括蝦青素單酯（70%）和蝦青素雙酯（25%），僅有5%的蝦青素以游離（非酯化形式）的形式存在[11]。酯化后的蝦青素與胞內(nèi)合成的TAG一起貯藏于油滴內(nèi)[12-14]。這表明蝦青素的儲存離不開TAG的大量合成。另有研究發(fā)現(xiàn)，在脅迫條件下，雨生紅球藻細胞內(nèi)的脂肪酸、總油脂和蝦青素的積累緊密相關(guān)，并且抑制脂肪酸的合成會使蝦青素的合成也受到抑制，但是抑制蝦青素的合成卻不會影響脂肪酸的合成[15]。因此，鑒定油脂合成途徑的關(guān)鍵酶基因和功能將有助于解析雨生紅球藻油脂合成和蝦青素酯化的分子機制。

已有研究表明，陸地高等植物和微藻的TAG的生物合成途徑是相似的[16]。TAG在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的從頭生物合成涉及甘油和酰基輔酶A，3種?；D(zhuǎn)移酶依次將?；o酶A連接到甘油上，分別是甘油-3-磷酸?；D(zhuǎn)移酶（Glycerol-3-phosphate Acvltransferase,GPAT）、溶血磷脂酸?；D(zhuǎn)移酶（Lysophosphatidic Acid Acyltransferase,LPAAT）以及二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（Acyl CoA：Diacylglycerol Acyltransferase,DGAT）[17]。然而，TAG的生物合成分為酰基輔酶A依賴途徑（Kennedy途徑）和非依賴途徑[18]。在非依賴酰基輔酶A途徑中，參與前2個反應的酶與Kennedy途徑相同，唯一的區(qū)別在最后一步?；磻瑓⑴c反應的酶不是DGAT，而是磷脂-二酰甘油酰基轉(zhuǎn)移酶（Phospholipids：Diacylglycerol Acyltransferase,PDAT）。這最后一步酶促反應被認為是TAG合成的限速步驟。PDAT途徑最早發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母，且被認為是酵母對數(shù)生長時期TAG合成的主要途徑[19]。許多高等植物[20]和萊茵衣藻[21]也發(fā)現(xiàn)PDAT途徑。與廣泛研究的DGAT酶相比，有關(guān)微藻PDAT途徑的研究還鮮見報道。

為此，筆者以雨生紅球藻-797株系為試材，鑒定和分子克隆編碼磷脂-二酰甘油?；D(zhuǎn)移酶（HpPDAT）的cDNA，應用組學工具檢測Hp PDAT酶蛋白的理化特征，系統(tǒng)分析不同光質(zhì)下HpPDAT的表達譜、雨生紅球藻細胞的總脂合成情況，以及藻細胞生理生化參數(shù)，旨在為解析雨生紅球藻油脂和蝦青素的合成積累提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及培養(yǎng)條件

試驗所用的雨生紅球藻-797保存于山西農(nóng)業(yè)大學分子農(nóng)業(yè)與生物能源研究所。雨生紅球藻的培養(yǎng)采用BG11培養(yǎng)基，于25μmol/(m2·s)的光照強度，12 h/12 h的光暗周期，（22±1）℃靜置培養(yǎng)，每天搖勻2~3次。光誘導的條件設置為高白光、高藍光、紫外和白光+紫外，高白光和高藍光的光照強度采用10 000 lx，紫外的光照強度采用200 lx和400 lx，以黑暗條件作為對照，除光照外其他條件與正常培養(yǎng)相同。

1.2 雨生紅球藻PDAT基因的篩選

從NCBI數(shù)據(jù)庫中下載已知的萊茵衣藻PDAT基因（JN 815265.1）為探針，通過Blast搜索到普氏小球藻、柵藻、釀酒酵母、大豆、擬南芥等20個物種的PDAT同源基因。以20條不同物種的PDAT基因序列為模板，以雨生紅球藻的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫為檢索基礎，通過本地Blast在其中檢索雨生紅球藻的PDAT基因序列，并對檢索結(jié)果進行鑒定。

1.3 雨生紅球藻PDAT蛋白的生物信息學分析

利用在線序列處理工具包（the sequence manipulation suite,SMS）將獲得的HpPDAT的cDNA全長序列翻譯成氨基酸序列，并通過ORF finder軟件查找開放閱讀框；使用在線工具ProtParam進行理化性質(zhì)預測；使用在線工具TMHMM Server v.2.0進行跨膜結(jié)構(gòu)域預測；使用在線工具PSORTⅡ進行亞細胞定位預測；使用在線工具SignalP-5.0進行信號肽預測；使用在線工具NetPhos-3.1進行磷酸化位點預測；Hp PDAT蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)的預測利用在線工具SOPMA和SWISSMDEL進行；利用保守結(jié)構(gòu)域數(shù)據(jù)庫CDD（Conserved Domain Database）鑒定HpPDAT蛋白的保守域。使用工具的網(wǎng)址如表1所示。

表1 生物信息學工具Tab.1 Tools of bioinformatics

1.4 雨生紅球藻PDAT蛋白的多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

選取雨生紅球藻、萊茵衣藻、普氏小球藻、缺刻葉球藻、擬南芥、大豆的PDAT蛋白序列，使用軟件ClustalX進行多序列比對。以表2中的PDAT序列，運用MEGA 7軟件采用鄰位連接法（NJ）對PDAT蛋白構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，以泊松校正法計算進化距離，設定Bootstrap值為1 000[22]。

表2 不同物種PDAT蛋白的基本信息Tab.2 Basic information on PDAT proteins of differ ent species

1.5 雨生紅球藻Hp PDAT的表達檢測

以本實驗室的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)為基礎，調(diào)取其中不同光處理條件下PDAT基因的FPKM值，計算表達量和相對表達量（黑暗條件為1），并以相對表達量繪圖。同時qPCR檢測Hp PDAT基因在不同光質(zhì)條件下的表達譜。qRT-PCR引物采用Primer 6.0設計，內(nèi)參基因Actin引物和定量引物如表3所示。RNA的提取使用RNA提取試劑盒（TaKaRa）。獲得的RNA使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）合成cDNA。使用2×實時熒光定量PCR Mix（TaKaRa）進行qRT-PCR。以Actin作為內(nèi)參進行基因表達分析。每個樣品至少進行3次生物學重復。

表3 PCR引物Tab.3 Primers of PCR

1.6 雨生紅球藻總脂提取

將培養(yǎng)的藻種離心收集并凍干，研缽研磨備用。稱取50 mg的藻粉，質(zhì)量記為W1，倒入50 mL的離心管中，并加入7.5 mL甲醇∶氯仿（體積比2∶1），漩渦震蕩5 min，于37℃搖床提取24 h后，5 000 r/min離心5 min，收集上清至新的50 mL離心管。于沉淀管中再次加入7.5 mL甲醇∶氯仿（體積比2∶1），漩渦振蕩5 min，于37℃搖床提取2 h后，5 000 r/min離心5 min收集上清，與上一步的上清混合?？芍貜蛶状巍Ｏ蛏锨骞苤屑尤? mL氯仿和9 mL 1%NaCl，保證終體系中甲醇∶氯仿∶水的體積比為2∶2∶1.8，漩渦振蕩5 min后，8 000 rpm離心10 min取下清，將下清液移入干凈玻璃管內(nèi)（已烘干至恒質(zhì)量，質(zhì)量記為W2）。利用氮吹儀加速氯仿?lián)]發(fā)，待氯仿?lián)]發(fā)殆盡后，于105℃烘箱內(nèi)烘干3 h。待玻璃管冷卻后稱質(zhì)量，質(zhì)量記為W3。

2 結(jié)果與分析

2.1 雨生紅球藻Hp PDAT基因的鑒定

通過本地Blast，在雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中篩選出1個具有完整開放閱讀框（ORF）的候選HpPDAT基因，全長3 138 bp，5′-UTR 75 bp，3′-UTR 129 bp，ORF 2 934，編碼978個氨基酸（圖1）。將獲得的序列利用Pfam Search（http://pfam.xfam.org/search）進行基因家族鑒定，預測蛋白包含有典型的卵磷脂膽固醇酰基轉(zhuǎn)移酶功能結(jié)構(gòu)域（PF02450），表明該cDNA編碼的是一種PDAT酶蛋白。

2.2 雨生紅球藻Hp PDAT蛋白基本理化性質(zhì)分析

利用工具ProtParam對雨生紅球藻Hp PDAT蛋白進行分析，結(jié)果顯示，蛋白的分子式為C4437H6997O1396N1289S38，分子質(zhì)量為101.95 ku，理論等電點6.15，屬于酸性蛋白。HpPDAT蛋白共有978個氨基酸，其中，丙氨酸（Ala）含量最高（13.4%）；其次為絲氨酸（Ser）和甘氨酸（Gly），含量分別為10.6%和10.5%；而半胱氨酸（Cys）含量最少（0.9%）。堿性氨基酸殘基總數(shù)（Asp+Glu）共92個，酸性氨基酸殘基總數(shù)（Arg+Lys）共80個。該蛋白的不穩(wěn)定性指數(shù)（Ⅱ）為39.68，脂肪指數(shù)為74.82，屬于穩(wěn)定蛋白?？偲骄H水系數(shù)為-0.238，為親水性蛋白。

在線分析軟件TMHMM結(jié)果表明，HpPDAT蛋白包含一個跨膜區(qū)域，是一種膜結(jié)合蛋白。通過PSORTⅡ軟件對HpPDAT蛋白的亞細胞定位進行預測，結(jié)果顯示，HpPDAT蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（55.6%），與TMHMM的預測相吻合。SignalP-5.0的預測結(jié)果顯示，雨生紅球藻Hp PDAT蛋白的序列中不包含信號肽序列。NetPhos-3.1的預測結(jié)果顯示，Hp PDAT蛋白的絲氨酸激酶（Ser）的位點最多，有81個；蘇氨酸激酶（Thr）的位點有29個；酪氨酸激酶（Tyr）的位點最少，僅為4個。

2.3 雨生紅球藻Hp PDAT蛋白的二級結(jié)構(gòu)和三級結(jié)構(gòu)

利用在線分析軟件SOPMA對Hp PDAT蛋白的二級結(jié)構(gòu)進行預測，預測結(jié)果如圖2所示。α-螺旋所占的比例最高，為40.33%，接下來的無規(guī)則卷曲比列為37.56%，最后延伸鏈和β-轉(zhuǎn)角的比列分別為11.77%和10.34%。表明主要由α-螺旋和無規(guī)則卷曲構(gòu)成雨生紅球藻HpPDAT蛋白的二級結(jié)構(gòu)，該蛋白為混合型蛋白。SWISS-MODEL的三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果如圖3所示，HpPDAT蛋白與模板蛋白相似性較高，但存在一些結(jié)構(gòu)上的差異，這些差異可能與HpPDAT的功能相適應。

2.4 雨生紅球藻Hp PDAT蛋白的序列比對和系統(tǒng)進化分析

以3種藻、2種植物與雨生紅球藻的PDAT共同進行序列比對，比對結(jié)果如圖4所示，此比對結(jié)果進行了序列的編輯。結(jié)果顯示，在非保守元件部分，各個序列之間的相似性較低，但在LCAT家族的保守元件部分，它們間的相似性保持了較高的水平。黑色方框內(nèi)即為LCAT家族的保守元件，依次分別為Lid區(qū)、鹽橋以及催化三聯(lián)體（包含3個區(qū)域），并且其內(nèi)包含的活性位點保持了高度的一致性，其中Lid區(qū)的為Trp，鹽橋的為Asp和Arg，催化三聯(lián)體的為Ser、His、Asp。

系統(tǒng)進化結(jié)果如圖5所示，所有物種被分為了3個來源。所有的植物被分為一組，表明它們的PDAT具有相同的來源；除了疫霉屬的真菌外，其他的菌類被分為一組，并且它們之間的同源性較高；藻類和疫霉屬的真菌被分為一組，除了柵藻外，各個藻類之間的同源性較高。

2.5 雨生紅球藻Hp PDAT的表達譜和細胞總脂積累分析

本試驗選取了黑暗、白光、藍光和紫外光作為不同的處理條件，HpPDAT的相對表達量如圖6所示。總體來看，光照條件下HpPDAT的表達水平要高于黑暗條件下。無論是在黑暗還是光照條件下，紫外光的加入都會使藻細胞上調(diào)HpPDAT的表達，在黑暗條件下HpPDAT表達的上調(diào)并不明顯，但在光照條件下，400 lx的紫外線使得HpPDAT的表達量顯著提高，可以達到黑暗條件下的5.9倍，正常光照條件下的3.9倍。高白光（10 000 lx）誘導使得HpPDAT的表達量達到黑暗處理的8.2倍，而在高藍光（10 000 lx）處理下則達到9.6倍；相比于正常光照條件，高白光下HpPDAT的表達量是其5.5倍，高藍光下HpPDAT的表達量是其6.4倍。

利用收集的藻粉提取并測定總脂含量，結(jié)果如圖7所示。黑暗條件下細胞總脂的含量要明顯低于光照條件。與對照相比，紫外光（200、400 lx）的加入會使得總脂含量增加。高光對于總脂積累的促進作用要明顯好于紫外光，高白光（10 000 lx）下總脂含量達到24%，是黑暗處理的1.7倍，而在高藍光（10 000 lx）處理下獲得了最高的總脂含量，達到了27%，是黑暗處理的1.9倍。PDAT的表達量與總脂的積累量呈現(xiàn)出一致性，但在L-U-200處理下出現(xiàn)差異。此處理下細胞PDAT的表達量相較于U-200處理有所降低，但總脂含量比U-200處理的要高。推測是細胞中TAG合成的另一限速酶DGAT的參與使得其出現(xiàn)了差異，有待后續(xù)分析。

3 結(jié)論與討論

雨生紅球藻是一種高附加值的微藻，其細胞合成的蝦青素具有顯著的生物學活性[23]，并且藻源TAG是生物燃油的優(yōu)良原料。TAG的合成對于雨生紅球藻具有重要意義，一方面其作為一種能源物質(zhì)應對逆境脅迫，另一方面關(guān)系到蝦青素的儲存。脅迫條件下雨生紅球藻會大量積累TAG和蝦青素[24]，兩者之間的關(guān)聯(lián)機制還未闡明，同時蝦青素的酯化機制也不明確。雨生紅球藻DGAT作為TAG合成途徑中的限速酶之一已有大量的相關(guān)研究[25-27]，但另一限速酶PDAT卻無相關(guān)報道。本試驗選取HpPDAT作為研究對象，以期為探究高光逆境條件下雨生紅球藻油脂和蝦青素的合成積累提供新思路。

以萊茵衣藻Cr PDAT序列為探針，分析雨生紅球藻轉(zhuǎn)錄組的本地數(shù)據(jù)庫，篩選出1個HpPDAT基因，序列全長3 138 bp，編碼978個氨基酸。生物信息學分析結(jié)果顯示，HpPDAT屬于LCAT家族，并且具有PDAT蛋白的典型功能結(jié)構(gòu)域。對Hp PDAT蛋白的進化分析結(jié)果顯示，其在進化上具有較高的保守性，與微藻的親緣關(guān)系較近，而與植物的親緣關(guān)系較遠。預測Hp PDAT是一種膜結(jié)合蛋白，并被定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這與TAG于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被合成的事實相符[28-29]，表明Hp PDAT蛋白被合成、修飾后錨定在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)揮功能。

雨生紅球藻光誘導試驗結(jié)果表明，與黑暗條件相比，不同光質(zhì)對于HpPDAT的表達有不同程度的促進作用，施加一定強度（200、400 lx）的紫外光可以促進其表達；高光（10 000 lx）具有顯著的促進作用，特別是高藍光（10 000 lx）下，Hp PDAT的表達量可以達到黑暗條件的9.6倍，可能是雨生紅球藻細胞對于藍光具有偏好性。過量的紫外線可以造成細胞的損傷，甚至導致死亡[30]，一定強度（200、400 lx）紫外光下HpPDAT的上調(diào)表達可能是雨生紅球藻細胞應對紫外線損害的途徑之一。同時，總脂積累分析顯示，光照條件下總脂的積累情況要好于黑暗條件，并且在高藍光（10 000 lx）處理下獲得了最好的總脂積累（27%），達到黑暗處理的1.9倍。再次表明雨生紅球藻細胞對于藍光可能具有偏好性。PDAT的表達與總脂的積累呈現(xiàn)出一致性，但有一定的差異，出現(xiàn)差異可能是因為TAG的合成還涉及到DGAT的表達，因此，光照對于總脂積累的影響有待進一步研究。

本試驗獲得了一條雨生紅球藻Hp PDAT的cDNA序列，發(fā)現(xiàn)其屬于LCAT家族，具有PDAT蛋白的功能。系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果顯示，Hp PDAT與微藻的親緣關(guān)系較近，而與植物的親緣關(guān)系較遠。光誘導試驗表明，高藍光（10 000 lx）對于HpPDAT的表達具有顯著的促進作用，同時使細胞獲得了最高的總脂積累。本研究為探究高光逆境條件下雨生紅球藻油脂富集和蝦青素酯化的分子機制提供了可靠的理論依據(jù)。