龔程程, 呂 浩, 鄭思春, 徐關峰

(華南師范大學生命科學學院, 廣東省昆蟲發(fā)育生物與應用技術重點實驗室, 廣州 510631)

DNA甲基化修飾廣泛存在于真核生物中，是表觀遺傳學重要的調控形式之一，以S-腺苷甲硫氨酸作為甲基供體，在DNA甲基轉移酶(DNA methyltransferases, DNMTs)的作用下，將甲基基團轉移到胞嘧啶(C)上，生成5-甲基胞嘧啶(5mC)(Adams, 1996)。自Sarkar等于1992年發(fā)現(xiàn)昆蟲基因組中存在DNA甲基化修飾以來，越來越多的研究表明DNA甲基化普遍存在于昆蟲中(Sarkaretal., 1992; Huntetal., 2013)。昆蟲基因組DNA甲基化水平要遠遠低于哺乳動物的(約60%～90%)，大多數(shù)昆蟲的DNA甲基化水平都小于1%(Bewicketal., 2017)。DNA甲基化在昆蟲發(fā)育中的功能主要涉及昆蟲繁殖、級型分化、基因組印跡、翅發(fā)育、性狀分化和抗藥性等(Goll and Bester, 2005; Wangetal., 2013; Xiangetal., 2013; 梁士可等, 2014; Bewicketal., 2019)。然而，昆蟲DNA甲基化作用機制尚需深入的研究。

細胞自噬(autophagy)，作為細胞程序性死亡的一種主要形式，其主要功能是去除衰老/受損細胞，以及降解細胞內多余物來維持細胞穩(wěn)態(tài)。在動植物中，細胞自噬的發(fā)生往往起始于細胞自噬相關蛋白(autophagy related protein, Atg)所參與形成的細胞自噬小體(Griffin, 2005; Orvedahletal., 2010)。細胞自噬小體的形成經(jīng)歷一個復雜的過程，包括起始、成核、延伸和成熟等。起始和成核主要由兩種蛋白復合體ATG1-ATG13和BECN1/ATG6-PI3K3C來完成。延伸和成熟主要由兩個泛素樣蛋白系統(tǒng)ATG12-ATG15和LC3-ATG8-PE來完成(Yang and Klionsky, 2010; Boyaetal., 2013)。Light Chain 3(LC3)蛋白是一種公認的細胞自噬標記物，主要存在形式為LC3-I，在細胞自噬發(fā)生過程中，細胞質內LC3-I蛋白轉移到自噬小體內，經(jīng)泛素化修飾后形成LC3-II，并定位于成熟的自噬小體的膜上，因此可以通過熒光標記的LC3-II來識別自噬小體(Tanidaetal., 2004)。

我們的前期工作通過利用DNA甲基化抑制劑5-氮-2′脫氧胞苷(5-aza-2′-deoxycytidine, 5-aza-dC)處理家蠶Bombyxmori，證明了DNA甲基化修飾通過抑制幾丁質酶的表達，從而保證了翅幾丁質含量和翅的正常發(fā)育(Xuetal., 2020)，表明DNA甲基化修飾在翅的發(fā)育中起著重要的調控作用。然而，通過轉錄組分析，我們發(fā)現(xiàn)DNA甲基化可能是通過多種途徑來調控翅的發(fā)育。為此，本研究將進一步探討DNA甲基化修飾是否通過抑制細胞自噬以保證翅發(fā)育的可能性。5-aza-dC作為一種DNA甲基化的特異性抑制劑，已被證明可以有效降低生物體內的DNA甲基化水平(Dastjerdietal., 2014; Cooketal., 2019)。本研究中對家蠶預蛹和卵巢Bm12細胞分別進行5-aza-dC和細胞自噬激活劑SMER28的處理以及細胞自噬抑制劑Spautin-1的挽救注射，觀察與測定家蠶Bm12細胞和翅細胞的自噬水平以及成蟲翅的表型，從而分析DNA甲基化對細胞自噬和家蠶翅發(fā)育的調控作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本實驗所用的家蠶品種為大造，蠶卵由廣東省蠶業(yè)研究所提供。幼蟲在溫度26.5±0.5℃、相對濕度70%和光周期14L∶10D的人工氣候箱中飼養(yǎng)。新鮮桑葉采摘自華南農業(yè)大學蠶學桑園實習基地。

家蠶卵巢Bm12細胞株來自華南農業(yè)大學動物科學學院。細胞置于含10%胎牛血清的昆蟲培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶，于27～28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每隔3～4 d按1∶3的比例傳代培養(yǎng)。

1.2 5-aza-dC處理家蠶細胞

為了證明DNA甲基化抑制劑5-aza-dC能夠有效抑制家蠶細胞內的DNA甲基化水平，我們用5-aza-dC處理家蠶卵巢Bm12細胞。將1 mg 5-aza-dC(Sigma, California, 美國)溶于ddH2O中，配制成濃度為10 μg/μL的母液。將現(xiàn)配制的母液稀釋10倍至終濃度為1 μg/μL。家蠶卵巢Bm12細胞以合適的密度在12孔板上鋪板，待細胞密度長至80%左右，將1 μg 5-aza-dC加入到12孔板的每孔家蠶卵巢Bm12細胞中。

按照DNA抽提說明書分別提取上述5-aza-dC處理12, 24和48 h的Bm12細胞的總DNA，并用RNase A(Promega, Madison, 美國)消化殘留的RNA雜質，基因組DNA樣品稀釋至100 ng/μL，1.5 μg基因組DNA在95℃ 5 min變性后，將DNA樣品點在硝酸纖維素印跡膜上，于加熱器上干燥。膜干燥后進行UV交聯(lián)2 min。隨后用3% TBST室溫封閉2 h。封閉完成后，于室溫下與一抗(5mC抗體，1∶1 000稀釋)孵育3 h(或4℃過夜孵育)。接著將膜與堿性磷酸酶標記的山羊抗兔二抗IgG抗體(1∶4 000稀釋)在37℃孵育60 min。用四唑淡藍/5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸鹽(NBT/BCIP)顯色液進行顯色反應。顯色結束后，將膜置于終止液中清洗以終止顯色，拍照成像，進行dot blot檢測。

將5-aza-dC處理12, 24和48 h后的Bm12細胞通過EVOS FL Auto熒光顯微鏡(Thermo Fisher, Waltham, 美國)進行觀察和成像，隨后通過ImageJ軟件計算每8 000 μm2的Bm12細胞數(shù)量，進行細胞數(shù)量的統(tǒng)計，探究DNA甲基化對家蠶細胞生長的影響。

1.3 LC3蛋白的過表達和Western blot檢測

LC3可用來指示細胞自噬程度(Tanidaetal., 2004)。為了進一步驗證DNA甲基化調控家蠶細胞自噬的強度，我們構建3×FLAG-LC3過表達載體。提取Bm12細胞總RNA，反轉錄為cDNA作為擴增LC3基因的模板。利用Primer Premier 5.0設計引物(表1)擴增家蠶LC3基因的ORF區(qū)域，通過上游引物在LC3蛋白氨基端引入3×FLAG標簽，進行PCR，反應體系: 2×Hieff PCR Master Mix(Yesen, 廣州) 10 μL, cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, 無核酸酶水6.4 μL。PCR反應程序: 95℃ 3 min; 95℃ 30 s, 50℃ 30 s, 72℃ 60 s, 32個循環(huán); 4℃保持。利用DNA凝膠回收試劑盒(Magen, 廣州)進行PCR產物回收?；厥盏腄NA片段連接到pMD-18T(TaKaRa, 大連)載體上。隨后利用KpnⅠ和BamHⅠ酶將目的片段從pMD-18T載體上切下來連入pEGFP載體，構建3×FLAG-LC3-EGFP載體。

表1 本研究所用引物Table 1 Primers used in this study

將構建好的2 μg 3×FLAG-LC3-EGFP超表達載體和6 μL Fugene HD(Promega, Madison, 美國)加于EP管中，用Opti-MEM(Life Technologies, Grand Island, 美國)無血清培養(yǎng)基補足到50 μL，充分混合。將配好的混合液室溫靜置15 min，加入到家蠶卵巢Bm12細胞培養(yǎng)液12孔板中進行細胞轉染，并在實驗組細胞中加入1 μg 5-aza-dC處理。24和48 h后分別收集Bm12細胞的總蛋白。蛋白變性后在12% SDS-PAGE凝膠中分離，隨后轉移至硝酸纖維素印跡膜(GE Healthcare)。將膜置于含有3% (w/v) BSA的TBST中37℃封閉2 h或4℃封閉過夜。封閉結束后，用TBST洗膜3次，加入1% TBST稀釋1∶2 000的FLAG一抗(#14793, Cell Signaling Technology, MA, 美國)，37℃孵育3 h或4℃過夜。一抗孵育結束后，用TBST洗膜3次，加入堿性磷酸酶標記的山羊抗兔IgG二抗(IA-0071, Dingguo, 北京)，室溫孵育1～2 h。室溫下用TBST洗膜2次和TBS洗膜1次，最終用NBT/BCIP顯色液進行顯色反應。顯色結束后，將膜置于終止液中清洗以終止顯色，最后將顯色好的膜取出，拍照。

1.4 免疫組化

將家蠶卵巢Bm12細胞以合適的密度接種到12孔細胞板的爬片上， 待細胞密度長至80%左右進行質粒轉染。將2 μg 3×FLAG-LC3-EGFP超表達載體和6 μL Fugene HD(Promega, Madison, 美國)加于EP管中，用Opti-MEM(Life Technologies, Grand Island,美國)無血清培養(yǎng)基補足到50 μL，充分混合進行轉染。同時加入1 μg 5-aza-dC處理細胞，轉染48 h后用4%多聚甲醛固定細胞10～20 min，隨后用含0.5% Triton的PBT處理，于室溫通透30 min。用含有2% BSA和5%山羊血清的封閉液，于室溫封閉2 h。封閉完成后，于室溫下以1∶200稀釋的FLAG一抗(#14793, Cell Signaling Technology, MA, 美國)孵育3 h(或4℃過夜孵育)。再以1∶200 Alexa-594標記的二抗(Invitrogen, 美國)孵育2 h。每兩個步驟之間用0.1% PBT洗3次。二抗孵育且PBT洗后，用Prolong Gold/DAPI (Invitrogen, 美國)染色封片后，使用FV3000共聚焦顯微鏡(Olympus, 日本)進行觀察FLAG-LC3I/II的分型情況。

1.5 DNA甲基化對細胞自噬和家蠶翅發(fā)育的影響

為了探究DNA甲基化是否影響細胞自噬和家蠶翅的發(fā)育，選取50～60頭預蛹期的家蠶，在冰上放置30 min，從腹部第2胸節(jié)注射2 μg 5-aza-dC，對照組注射相同體積的ddH2O，觀察成蟲翅形態(tài)，計算殘翅率和翅面積，并在24, 48, 72和96 h檢測Atg基因mRNA水平變化。同時，為了明確細胞自噬對家蠶翅發(fā)育的影響，選取50～60頭同時期生長良好的預蛹期家蠶，在胸腔處注射2 μg的細胞自噬激活劑SMER28(Tianetal., 2011)(SC5502 Beyotime, 上海)，對照組注射相同體積的ddH2O，24，48和72 h后觀察羽化后成蟲的翅形態(tài)，計算殘翅率和翅面積。Spautin-1是一種特異的細胞自噬抑制劑，通過調節(jié)USP10和USP13的去泛素化活性減少PtdIns3P的水平，進而抑制細胞的自噬(Liuetal., 2011)。為了進一步驗證DNA甲基化調控家蠶翅發(fā)育是由細胞自噬介導的，選取50～60頭預蛹期家蠶，對照組注射相同體積ddH2O，一組實驗組注射2 μg 5-aza-dC，另外一組實驗組同時注射2 μg 5-aza-dC和2 μg Spautin-1(SC5498 Beyotime, 上海)進行細胞自噬抑制劑挽救實驗，24，48和72 h后統(tǒng)計羽化后成蟲的殘翅率和翅面積。每組實驗隨機選取9～15頭為一個生物學重復，每組進行3個生物學重復。

1.6 溶酶體染色檢測DNA甲基化對細胞自噬強度的影響

細胞自噬是一個基于溶酶體的胞內降解過程，胞內組分被自噬小體運輸?shù)饺苊阁w進行降解，從而提供特殊環(huán)境下細胞所需要的營養(yǎng)，因此，細胞內溶酶體水平可以反映自噬強度。為了檢測5-aza-dC處理是否影響了細胞內的溶酶體水平，在室溫下利用LysoTrackerTMGreen DND-26溶酶體綠色熒光探針(L7526, Invitrogen, California, 美國)溶液(LysoTrackerTMGreen DND-26∶PBS=1∶300)對5-aza-dC處理的Bm12細胞(1.2節(jié))和家蠶翅(1.5節(jié))、細胞自噬激活劑SMER28處理的家蠶翅(1.5節(jié))和細胞自噬抑制劑Spautin-1挽救實驗家蠶翅(1.5節(jié))進行室溫染色20 min，染色結束后PBS洗6次后放到載玻片上，蓋上蓋玻片，封片處理。蓋蓋玻片時應注意保護組織的原結構。最后于FV3000共聚焦顯微鏡(Olympus, 日本)下觀察并拍照成像，統(tǒng)計細胞內的溶酶體熒光信號數(shù)量。

1.7 RT-qPCR檢測5-aza-dC對Atg基因表達的影響

為了檢測自噬相關蛋白(Atg)基因(Yang and Klionsky, 2010; Boyaetal., 2013)的表達水平，根據(jù)Eastep?Super總RNA提取試劑盒(Promega, Madison, 美國)說明書提取5-aza-dC處理的Bm12細胞(1.2節(jié))和家蠶翅(1.5節(jié))的總RNA。隨后，按Evo M-MLV Reverse Transcriptase試劑盒(Promega, Madison, 美國)說明書進行反轉錄合成cDNA。利用Primer Premier 5.0設計家蠶翅細胞的內參基因線粒體蛋白49基因(RP49)和細胞自噬相關蛋白基因Atg的RT-qPCR特異引物(表1)，合成后使用Eastep?qPCR Master Mix試劑盒(Promega, Madison, 美國)通過QuantStudioTM6 Flex Real-Time PCR System進行RT-qPCR。反應體系: Eastep?qPCR Master Mix 10 μL, Bm12細胞或家蠶翅cDNA模板2 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL, 無核酸酶水7.2 μL。反應程序: 95℃ 2 min; 95℃ 15 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)后于4℃保持?；蛳鄬Ρ磉_水平通過2-ΔΔCt方法進行計算(Livak and Schmittgen, 2001)，所有數(shù)據(jù)為3次技術重復和3次生物學重復。

1.8 數(shù)據(jù)分析

所有的數(shù)據(jù)均為平均±標準差。結果的差異顯著性由t檢驗分析得出。

2 結果

2.1 DNA甲基化對家蠶Bm12細胞生長的影響

dot blot檢測結果顯示(圖1: A)，1 μg 5-aza-dC顯著降低Bm12細胞基因組5mC的水平，可以作為一種有效的抑制劑進行后續(xù)實驗。1 μg 5-aza-dC處理12, 24和48 h的Bm12細胞生長受到了明顯的影響，與對照組相比Bm12細胞數(shù)量分別減少15.85%，19.96%和26.81%(圖1: B)，表明DNA甲基化參與調控家蠶細胞的正常生長。

圖1 DNA甲基化抑制劑5-aza-dC(1 μg)對家蠶卵巢Bm12細胞生長的影響Fig. 1 Effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dC (1 μg) on the growth of Bombyx mori ovarian Bm12 cellsA: 利用5mC抗體通過dot blot分析5-aza-dC處理后的Bm12細胞中DNA甲基化水平Dot blot analysis of DNA methylation levels in Bm12 cells treated with 5-aza-dC using 5mC antibody. Input: 1.5 μg等量DNA通過核酸染料(GoldView)染色后成像Image of the same amount of DNA (1.5 μg) after staining with nucleic acid dye (GoldView). B: 5-aza-dC處理后顯微鏡視野下每8 000 μm2的Bm12細胞數(shù)量Number of Bm12 cells per 8 000 μm2 in the microscope field after treatment with 5-aza-dC. CK: H2O; 5mC: 5-甲基胞嘧啶5-Methylcytosine. 下同The same below. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；柱上星號示與對照組間的差異顯著性(*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, t檢驗)。Data in the figure are mean±SD. Asterisk above bars indicates significance of difference from the control (*P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001, t-test). 下同The same below.

2.2 DNA去甲基化促進家蠶細胞的自噬水平

對轉染了3×FLAG-LC3-EGFP超表達載體的Bm12細胞進行5-aza-dC處理，24和48 h后利用FLAG抗體進行Western blot檢測(圖2: A左)發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，5-aza-dC處理后的家蠶Bm12細胞內有更多的LC3-I被加工轉變?yōu)長C3-II，并且處理48 h后細胞中的LC3-II多于處理24 h細胞中的。免疫組化實驗也獲得了相似的結果(圖2: A右)，經(jīng)過5-aza-dC處理后的細胞內含有更多的呈聚集狀的LC3-II蛋白亮點。

溶酶體染色檢測結果表明，1 μg 5-aza-dC處理后的家蠶Bm12細胞內的溶酶體熒光信號強度增加(圖2: B)，熒光信號數(shù)量與對照比較極顯著上調(P<0.01)(圖2: C)。Atg基因表達量的RT-qPCR檢測結果表明，在5-aza-dC處理后的家蠶Bm12細胞內，Atg1,Atg2,Atg6,Atg7,Atg8,Atg9,Atg16和Atg18表達水平與對照比較極顯著上調(P<0.01)(圖2: D)，表明DNA甲基化可能通過調控細胞自噬來影響細胞的正常生長。

圖2 DNA甲基化抑制劑5-aza-dC (1 μg)對家蠶Bm12細胞中自噬的影響Fig. 2 Effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dC (1 μg) on autophagy in Bm12 cells of Bombyx moriA: Western blot (左)和免疫組化(右，箭頭指示LC3-Ⅱ)分析5-aza-dC處理對LC3蛋白分型(LC3-Ⅰ和LC3-Ⅱ)的影響Western blot (left) and immunohistochemistry (right, arrows pointing LC3-Ⅱ) analyses of LC3 protein typing (LC3-Ⅰ and LC3-Ⅱ) in Bm12 cells treated with 5-aza-dC; B: 5-aza-dC處理對Bm12細胞中溶酶體水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in Bm12 cells treated with 5-aza-dC; C: 5-aza-dC處理后Bm12中細胞溶酶體熒光信號數(shù)量的統(tǒng)計Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in Bm12 cells treated with 5-aza-dC; D: 5-aza-dC處理48 h后Bm12細胞中Atg基因的相對表達水平檢測Relative expression levels of Atg genes in Bm12 cells treated with 5-aza-dC for 48 h.

2.3 DNA甲基化參與調控家蠶翅的發(fā)育

結果表明，預蛹期注射5-aza-dC后的家蠶成蟲出現(xiàn)大量的畸形翅，翅面積減小，厚度變薄(圖3: A)，成蟲殘翅率達到91.67%，而對照組的殘翅率僅19.05%(圖3: B)。翅面積的統(tǒng)計結果表明，實驗組翅面積比對照組減少了66%(圖3: C)，說明DNA去甲基化造成家蠶翅的異常發(fā)育。檢測5-aza-dC處理的家蠶翅中Atg基因的表達水平，如圖3(D)所示，Atg1,Atg2,Atg6,Atg7,Atg8,Atg9,Atg16和Atg18在注射后96 h內的表達顯著上調(P<0.05)。對注射5-aza-dC后的家蠶翅進行溶酶體染色實驗，獲得了與在Bm12細胞株中(圖2)相似的結果，即DNA去甲基化增強了家蠶蛹翅細胞內的自噬水平(圖3: E, F)。

圖3 家蠶預蛹注射DNA甲基化抑制劑5-aza-dC (2 μg)后對成蟲翅發(fā)育的影響Fig. 3 Effects of DNA methylation inhibitor 5-aza-dC (2 μg) injected into prepupaeon the wing development of Bombyx mori adultsA: 5-aza-dC注射后成蟲翅的表型Adult wing phenotype after injection with 5-aza-dC; B: 5-aza-dC注射后成蟲的殘翅率Abnormal wing rate of adult after injection with 5-aza-dC; C: 5-aza-dC注射后成蟲的翅面積變化Change of wing area of adult after injection with 5-aza-dC; D: 5-aza-dC注射不同時間后翅中Atg基因的相對表達水平Relative expression levels of Atg genes in wing after injection with 5-aza-dC for different time; E: 5-aza-dC注射不同時間后翅細胞中溶酶體水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in wing cells after injection with 5-aza-dC for different time; F: 5-aza-dC注射不同時間后翅細胞溶酶體熒光信號數(shù)量的統(tǒng)計Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in wing cells after injection with 5-aza-dC for different time.

2.4 DNA甲基化通過細胞自噬影響家蠶翅發(fā)育

預蛹期注射細胞自噬激活劑SMER28后24, 48和72 h，與對照組比較，成蟲出現(xiàn)了類似注射5-aza-dC后(圖3: A)的翅表型，即成蟲出現(xiàn)了畸形翅(圖4: A)，殘翅率從對照的12%升高到87.13%(圖4: B)，成蟲翅面積降低48.79%(圖4: C)，且翅細胞的溶酶體熒光信號強度增加(圖4: D)，熒光信號數(shù)顯著上調(P<0.05)(圖4: E)，證明家蠶翅細胞自噬的異常上調確實可以影響翅的正常發(fā)育。

圖4 家蠶預蛹注射細胞自噬激活劑SMER28(2 μg)對成蟲翅發(fā)育的影響Fig. 4 Effects of autophagy activator SMER28 (2 μg) injected into prepupae on the wing development of Bombyx mori adultsA: 注射SMER28后成蟲翅表型Adult wing phenotype after injection with SMER28; B: 注射SMER28后成蟲殘翅率變化Change of abnormal wing rate of adult after injection with SMER28; C: 注射SMER28后成蟲的翅面積變化Change of wing area of adult after injection with SMER28; D: SMER28注射不同時間后翅細胞中溶酶體水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in wing cells after injection with SMER28 for different time; E: SMER28注射不同時間后翅細胞溶酶體熒光信號數(shù)量的統(tǒng)計Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in wing cells after injection with SMER28 for different time.

為了進一步驗證DNA甲基化調控家蠶翅發(fā)育是由細胞自噬介導的，我們對5-aza-dC(2 μg)處理的家蠶預蛹進行注射細胞自噬抑制劑Spautin-1(2 μg)的挽救實驗。 如圖5(A-C)所示，對照組成蟲殘翅率為16.28%, 5-aza-dC處理組的為92.31%，注射5-aza-dC和Spautin-1的挽救組的為47.7%；對照組翅面積為每翅59.77 mm2, 5-aza-dC組的為每翅20.29 mm2, Spautin-1挽救組的為每翅42.33 mm2。如圖5(D和E)所示，與對照組相比5-aza-dC處理后的家蠶翅細胞溶酶體熒光信號強度增加，熒光信號數(shù)顯著上調(P<0.05)，而注射5-aza-dC和Spautin-1的挽救組家蠶翅細胞內的溶酶體信號強度出現(xiàn)明顯的回落，證明細胞自噬抑制劑Spautin-1確實可以挽救由DNA去甲基化引起的細胞自噬。

圖5 DNA甲基化通過細胞自噬影響家蠶翅的發(fā)育Fig. 5 DNA methylation affects the wing development of Bombyx mori through autophagyA: 5-aza-dC實驗組和Spautin-1挽救組的成蟲翅表型Adult wing phenotype in 5-aza-dC group and Spautin-1 rescue group; B: 5-aza-dC實驗組和Spautin-1挽救組的成蟲殘翅率變化Change of abnormal wing rate of adult in 5-aza-dC group and Spautin-1 rescue group; C: 5-aza-dC實驗組和Spautin-1挽救組的成蟲翅面積變化Change of wing area of adult in 5-aza-dC group and Spautin-1 rescue group; D: 處理不同時間后翅細胞中溶酶體水平的染色分析Staining analysis of lysosome level in wing cells after treatment for different time; E: 處理不同時間后翅細胞溶酶體熒光信號數(shù)量的統(tǒng)計Statistics of number of fluorescence signals of lysosome in wing cells after treatment for different time. 5-aza-dC: 甲基化抑制劑Methylation inhibitor (2 μg); Spautin-1: 細胞自噬抑制劑Autophagy inhibitor (2 μg).

3 討論

生物學功能方面的研究表明，盡管昆蟲基因組內的DNA甲基化率較低(<1%)(Bewicketal., 2017)，其依然在調控昆蟲發(fā)育中起著重要作用。然而目前對DNA甲基化影響昆蟲發(fā)育的研究大都停留在昆蟲DNMT基因敲除后的表型觀察，DNA甲基化如何具體調控昆蟲生長發(fā)育的實驗研究仍然相對匱乏。本研究選取鱗翅目的模型昆蟲家蠶為研究對象，采用DNA甲基化抑制劑5-aza-dC進行DNA甲基化功能研究。5-aza-dC不僅在治療慢性粒細胞性白血病、骨髓增生異常綜合癥和急性髓細胞性白血病等臨床實踐中被應用(Goreetal., 2006; Malik and Cashen, 2014)，還涉及性發(fā)育(Ribasetal., 2017)、植物成熟(Zhongetal., 2013)和基因表達(Chiurazzietal., 1999; Slacketal., 1999)等方面的研究。本研究證明1 μg 5-aza-dC處理的家蠶細胞DNA甲基化水平顯著下降(圖1)，表明5-aza-dC在鱗翅目昆蟲細胞中也可以發(fā)揮去甲基化的作用。

目前對昆蟲DNA甲基化的功能研究表明，DNA甲基化涉及生殖、級型分化、翅發(fā)育和性別決定等多種生理生化過程，例如在蝽Oncopeltusfasciatus(Bewicketal., 2019)、家蠶 (Xiangetal., 2013; Lietal., 2020)、麗蠅蛹集金小蜂Nasoniavitripennis(Wangetal., 2013)和德國小蠊Blattellagermanica(Ventós-Alfonsoetal., 2020)中，敲除DNMT基因會致使卵巢和胚胎發(fā)育受阻，產卵量/卵孵化率下降和滯育等。對不同種群與性別的蜂群/蟻群的基因組甲基化分析也發(fā)現(xiàn)DNA甲基化也可能調控昆蟲的社會分工與性別決定(Lykoetal., 2010; Bigotetal., 2011)。我們的早期工作表明DNA甲基化通過抑制幾丁質酶而參與調控了家蠶翅的發(fā)育(Xuetal., 2020)，本研究發(fā)現(xiàn)家蠶預蛹翅在正常發(fā)育情況下表現(xiàn)出較低水平的細胞自噬，這與大量關于昆蟲變態(tài)發(fā)育的研究相吻合。昆蟲變態(tài)發(fā)育過程中的中腸、脂肪體和神經(jīng)等組織細胞都發(fā)生著細胞自噬和凋亡(Wuetal., 2006; Weaver and Krasnow, 2008; 張淑堯等, 2019)。家蠶翅原基的細胞凋亡和細胞自噬研究發(fā)現(xiàn)，5齡幼蟲以及幼蟲末期的家蠶翅原基細胞內的凋亡和自噬相關基因普遍具有高水平的表達，如Caspase3,Atg5,Atg6,Atg8和Atg12等；而在家蠶進入預蛹期后，蛹翅細胞內的凋亡和自噬相關基因顯著下降，暗示細胞凋亡和自噬可能調控了變態(tài)發(fā)育時期翅原基向蛹翅的發(fā)育，而進入蛹期后其調控作用消失(劉學術等, 2016)。本研究結果發(fā)現(xiàn)Bm12細胞內DNA甲基化水平降低導致Atg基因表達上調(圖2)，促進家蠶翅的細胞自噬，進而導致翅發(fā)育異常，形成畸形翅(圖3)，這表明在正常發(fā)育情況下DNA甲基化控制細胞的自噬從而使其維持在一定的水平，進而保證家蠶翅發(fā)育的有序進行。通過藥物處理實驗也證明DNA甲基化抑制劑5-aza-dC和細胞自噬激活劑SMER28都可以影響家蠶翅的發(fā)育，造成畸形翅。而細胞自噬抑制劑Spautin-1在一定程度上可以挽救5-aza-dC處理造成的翅發(fā)育畸形，表明DNA甲基化可以通過調控細胞自噬的形成來參與家蠶翅的發(fā)育(圖4和5)，因此，我們推測蛹期家蠶翅的正常發(fā)育需要DNA甲基化抑制細胞自噬水平，使細胞自噬維持在相對較低的水平。

大量的研究表明細胞自噬是生物體發(fā)育的一種保護機制。昆蟲相關研究發(fā)現(xiàn)20-羥基蛻皮酮(20-hydroxyecdysone, 20E)對果蠅和家蠶脂肪體和中腸等組織的細胞自噬發(fā)生起著重要的調控功能。20E一方面可以通過促進家蠶細胞中的Atg基因表達上調；另一方面又可以通過抑制營養(yǎng)信號mTOR活性而激活家蠶Atg1/Atg13蛋白復合體活性，啟動自噬小體的形成，從而誘導幼蟲表皮和組織的細胞發(fā)生高水平的自噬，執(zhí)行細胞程序性死亡，保障家蠶正常的變態(tài)進程(Leeetal., 2002; Tianetal., 2013; 謝昆等, 2013)。除了激素外，細胞自噬也同樣受到DNA甲基化的調控，DNA甲基化不僅可以直接修飾自噬相關基因，還可以影響一些調節(jié)自噬的信號分子基因，從而影響它們的轉錄和隨后的細胞自噬(Hu, 2019)。例如，DNA甲基化一方面可以直接修飾Atg1,Atg6,Atg8和LC3等細胞自噬相關基因，通過調控這些基因的轉錄，進而影響細胞自噬水平，另一方面也可以修飾一些細胞自噬相關的信號分子基因間接影響細胞自噬強度，如NOR1,DAPK和SOX1基因等(Hu, 2019)。同樣地，最近的研究也表明，組蛋白修飾和非編碼RNA(如microRNA)也是調控細胞自噬的重要表觀遺傳方式，尤其是H4K16ac和H3K56ac(Füllgrabeetal., 2014; Hu, 2019)。本研究中，對家蠶成蟲翅的研究發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化可以使原本較低水平的細胞自噬大幅度提高，表明DNA甲基化在家蠶變態(tài)的關鍵時期(蛹期)抑制細胞的自噬，避免由于細胞自噬水平過高而影響翅發(fā)育的正常進程。然而，DNA甲基化是通過營養(yǎng)、免疫或20E信號通路互作對細胞自噬進行調控，還是直接調控自噬相關基因的轉錄影響細胞自噬的水平還需要更多的研究來證明。綜上所述，DNA甲基化調控細胞自噬的研究尚處于初級階段，目前只有少數(shù)細胞自噬相關基因或信號分子被報道發(fā)生DNA甲基化，從而影響自噬水平。我們早期的研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化也可以調控家蠶蛹翅中幾丁質合成酶和幾丁質酶表達來影響幾丁質的代謝，從而影響蛹翅的發(fā)育(Xuetal., 2017, 2018, 2020)。那么，DNA甲基化是否通過協(xié)調細胞自噬和幾丁質代謝在家蠶翅細胞的發(fā)生，以保證翅的正常發(fā)育也有待進一步驗證。