邱雨浩, 賈 豫, 倪建泉, 王 冰, 王桂榮

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所, 植物病蟲害生物學(xué)國家重點實驗室, 北京 100193;2. 清華大學(xué)醫(yī)學(xué)院, 基因表達(dá)與調(diào)控實驗室, 北京 100084)

隨著測序技術(shù)的發(fā)展，多種常見昆蟲的基因組均得到完整的測序與詳細(xì)注釋，提供深入了解昆蟲的途徑，而基因編輯技術(shù)的發(fā)展和應(yīng)用則為人類提供改造和利用這些昆蟲的能力?；蚓庉嫾夹g(shù)包括誘導(dǎo)突變技術(shù)(Muller, 1927; Auerbach and Robson, 1946)，轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的基因編輯技術(shù)(Rubin and Spradling, 1982)，鋅指核酸酶(zinc finger nuclease, ZFN)技術(shù)(Kimetal., 1996)，類轉(zhuǎn)錄激活因子效應(yīng)物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease, TALEN)技術(shù)(Lietal., 2011)以及目前炙手可熱的成簇規(guī)律間隔短回文重復(fù)序列及其關(guān)聯(lián)蛋白9[clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/CRISPR-associated (Cas) protein 9, CRISPR/Cas9]技術(shù)。本文概述了基因編輯技術(shù)的原理及其在昆蟲中的發(fā)展和應(yīng)用，以期對昆蟲基因功能的研究、經(jīng)濟(jì)性昆蟲的改良、害蟲的生物性防治等研究提供借鑒與參考。

1 基因編輯技術(shù)的發(fā)展和原理

人們對基因編輯的探索最早可以追溯至20世紀(jì)初(Muller, 1927; Auerbach and Robson, 1946)，利用輻射以及化學(xué)物質(zhì)誘導(dǎo)基因突變，但是這一方法只能產(chǎn)生隨機(jī)突變，無法進(jìn)行外源基因的插入以及在特定位點實現(xiàn)特定序列的編輯。早期的基因編輯技術(shù)主要是通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)出并產(chǎn)生DNA雙鏈斷裂，進(jìn)而以誘發(fā)DNA同源修復(fù)的方式向基因組中插入序列(Rubin and Spradling, 1982)，但是這一方法效率低且實用性不高。除此之外，還有通過轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)入介導(dǎo)的基因插入，例如P轉(zhuǎn)座子、Hermes轉(zhuǎn)座子、minos轉(zhuǎn)座子、hobo轉(zhuǎn)座子、mariner轉(zhuǎn)座子和piggyBac(最初也被稱為IFP2) 轉(zhuǎn)座子。其中piggyBac轉(zhuǎn)座子應(yīng)用范圍最廣，適用性最強(qiáng)，其原理是依靠自身編碼的轉(zhuǎn)座酶，從TTAA位點切出或者轉(zhuǎn)入，這一過程中允許轉(zhuǎn)座子攜帶其他基因，也因此被廣泛應(yīng)用于生物基因編輯(Elicketal., 1996)。但是轉(zhuǎn)座子插入位點的隨機(jī)性較大，并且后續(xù)篩選步驟較為繁瑣。

與同源重組技術(shù)相比，特異性的基因編輯技術(shù)可以更好地彌補轉(zhuǎn)座子的不足。第一代ZFN技術(shù)應(yīng)運而生，該技術(shù)將來自黃桿菌屬細(xì)菌Flavobacteriumokeanokoites中的FokⅠ蛋白核酸切割域與來自真核生物轉(zhuǎn)錄因子的鋅指DNA識別位點進(jìn)行融合，使其可以識別不同基因序列，進(jìn)行DNA切割并產(chǎn)生雙鏈斷裂。其中的Cys2-His2鋅指蛋白域是真核生物中最常見的DNA結(jié)合元件，每一個鋅指結(jié)構(gòu)都包含約30個氨基酸，存在于α-螺旋上的部分氨基酸則可以通過DNA的大溝與3個堿基結(jié)合，并識別DNA序列(Gajetal., 2013)。借助于一段序列保守的連接蛋白，Gaj等(2013)成功構(gòu)建了由多個鋅指組成的DNA結(jié)合蛋白，最高可以識別并結(jié)合18個堿基長度的DNA，但是該技術(shù)設(shè)計過程復(fù)雜，實驗操作成本較高。

隨后發(fā)展出的第二代人工核酸內(nèi)切酶——TALEN技術(shù)對作用位點的特異性結(jié)合作用更高，大大降低了錯配率的發(fā)生。該技術(shù)原理與ZFN技術(shù)相似，只是其DNA識別結(jié)構(gòu)域來自植物致病菌的轉(zhuǎn)錄因子的DNA識別域。TALE蛋白的DNA結(jié)合域由多個3～35個氨基酸的重復(fù)序列構(gòu)成，其特異性取決于兩個非保守的氨基酸(Gajetal., 2013)。與鋅指蛋白相比，TALE蛋白不需要額外插入DNA識別域之間的連接蛋白，因此可以大大簡化蛋白構(gòu)建流程，但是仍然需要繁瑣的基因合成工作。

第三代基于CRISPR/Cas9技術(shù)的基因組編輯系統(tǒng)起初是細(xì)菌用來抵御病毒入侵以及切割基因組中的插入病毒序列的防御系統(tǒng)，僅需通過一段100 bp堿基長度的引導(dǎo)RNA (small guide RNA, sgRNA)進(jìn)行定位引導(dǎo)，其中有20 bp可以特異性識別并結(jié)合基因組的靶位點，使Cas9蛋白結(jié)合在基因組的特定位置并進(jìn)行切割，產(chǎn)生核苷酸雙鏈斷裂(double-strand break, DSB) (Jineketal., 2012)。在DNA斷裂位點，細(xì)胞可以通過同源介導(dǎo)的修復(fù)(homology-directed repair, HDR)或者非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)的方式進(jìn)行DNA修復(fù)。NHEJ是在相關(guān)DSB識別蛋白、DNA連接蛋白的作用下，兩段斷裂的DNA被連接到一起，形成完整的DNA鏈。而HDR的方式可以利用同源染色體或者是攜帶同源序列的外源基因序列作為修復(fù)模板進(jìn)行修復(fù)(Iliakisetal., 2004)。通過HDR的修復(fù)方式，人們也可以在基因組的特定位置插入所需的基因序列，使用NHEJ的方式可能會造成斷裂位置堿基的插入或缺失，從而影響基因功能。2013年，張鋒團(tuán)隊使用CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)了在哺乳動物細(xì)胞中的基因編輯(Congetal., 2013)。第三代基因組編輯技術(shù)方便快捷且成本低廉，因此迅速被世界各地的實驗室廣泛應(yīng)用，并衍生出一系列基因編輯工具。目前，CRISPR/Cas9基因編輯系統(tǒng)在雙翅目(Gratzetal., 2013; Kistleretal., 2015)、膜翅目(Kohnoetal., 2016)、半翅目(Heuetal., 2020)、鱗翅目(Wangetal., 2013; Bietal., 2016; Changetal., 2017)和直翅目(Lietal., 2016)昆蟲的基因功能研究中均有報道，實現(xiàn)了對基因功能的驗證以及分子機(jī)制的解析。

2 基因編輯技術(shù)在模式昆蟲果蠅中的研究與應(yīng)用

為了更方便地對各種昆蟲的基因功能進(jìn)行研究，研究者將CRISPR/Cas9系統(tǒng)引入到模式昆蟲中，開發(fā)并優(yōu)化該系統(tǒng)的使用方法(表1)。

果蠅作為一種模式生物，研究歷史悠久，具有生長周期短，易于飼養(yǎng)，遺傳操作背景強(qiáng)，研究手段豐富等優(yōu)點。20世紀(jì)80年代開展了果蠅體內(nèi)有關(guān)基因編輯的研究。1983年，Engles在果蠅體內(nèi)發(fā)現(xiàn)P轉(zhuǎn)座子(Engels, 1983)，隨后這一轉(zhuǎn)座子被用于果蠅的轉(zhuǎn)基因編輯，至今仍發(fā)揮重要的研究作用。Bibicova等(2002)通過ZFN技術(shù)誘導(dǎo)果蠅染色體斷裂，并在特定位點產(chǎn)生NHEJ修復(fù)帶來的突變。Beumer等(2006)使用ZFN技術(shù)實現(xiàn)了對特定核苷酸DSB位點的HDR，從而得到攜帶標(biāo)記DNA序列的果蠅后代。

隨著第三代基因編輯系統(tǒng)的興起，多個研究團(tuán)隊相繼報道了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在黑腹果蠅Drosophilamelanogaster體內(nèi)的應(yīng)用。Gratz等(2013)向果蠅胚胎中注射兩個質(zhì)粒，分別表達(dá)Cas9和sgRNA，以期實現(xiàn)特定位點的突變，然而他們發(fā)現(xiàn)該方法獲得的編輯效率不高，只有5.9%的果蠅發(fā)生了NHEJ突變；當(dāng)他們將兩個sgRNA以及一小段供體單鏈核苷酸一起注射后，會導(dǎo)致兩段sgRNA中間的基因序列被敲除，并且能夠?qū)崿F(xiàn)外源序列的插入。Ren等(2013)和Sebo等(2014)分別開發(fā)了一種高效的基因編輯系統(tǒng)，通過直接向生殖細(xì)胞特異性表達(dá)Cas9蛋白的轉(zhuǎn)基因果蠅胚胎中注射sgRNA表達(dá)載體得到突變后代，避免了體細(xì)胞突變。Sebo等(2014)通過sgRNA靶向插入的egfp和mcherry熒光蛋白來檢測這套系統(tǒng)的工作效率。而Ren等(2013)以果蠅本身的white基因為靶點，除了檢測基因突變效率，還對sgRNA脫靶效應(yīng)進(jìn)行了分析，并開發(fā)了相應(yīng)的sgRNA設(shè)計程序(www.flyrnai.org/crispr)，評估了不同啟動子驅(qū)動sgRNA表達(dá)對突變效變效率的作用，發(fā)現(xiàn)全身性、全時間表達(dá)的Ⅲ型啟動子U6B的效果最好，有接近100%的突變效率。在此基礎(chǔ)上，Ren等(2014a)通過對Cas9蛋白進(jìn)行改造，得到了只能切割單鏈的Cas9內(nèi)切酶，在兩條sgRNA的引導(dǎo)下才可以切割出DSB，大大降低了脫靶效應(yīng)的副作用；之后他們又針對GC含量、注射濃度等多方面因素進(jìn)行梯度實驗，優(yōu)化出一套成熟的基因編輯方案，并且通過注射多個sgRNA表達(dá)載體，可以一次性誘導(dǎo)多個基因同時突變(Renetal., 2014b)。

使用CRISPR/Cas9技術(shù)產(chǎn)生突變的果蠅往往需要通過復(fù)雜且大規(guī)模的基因組提取與PCR來進(jìn)行篩選，因此，開發(fā)出更易于篩選的基因編輯技術(shù)也十分重要。Kane等(2017)開發(fā)出一套CRISPR共篩選系統(tǒng)，同時注射表達(dá)靶向目的基因的gRNA載體和表達(dá)靶向ebony基因的gRNA載體， 當(dāng)ebony基因失效之后，果蠅體色會變成黑色。研究者發(fā)現(xiàn)，在ebony發(fā)生突變的果蠅中，有高達(dá)61%的果蠅發(fā)生了靶向基因突變，說明ebony突變與靶向基因突變之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。隨后他們對使用HDR的方法產(chǎn)生突變體果蠅進(jìn)行測試，也發(fā)現(xiàn)在ebony突變的果蠅中，高達(dá)18%的果蠅的目的基因發(fā)生了同源修復(fù)。

果蠅基因組中許多基因與人類基因同源，通過對果蠅細(xì)胞生物學(xué)、發(fā)育生物學(xué)和神經(jīng)生物學(xué)等多個領(lǐng)域的研究發(fā)現(xiàn)其表型與人類疾病有許多的相似之處。Sun等(2021)通過CRISPR/Cas9技術(shù)在果蠅體內(nèi)誘導(dǎo)了HP1c突變，用以研究HP1c在果蠅腸道中與腫瘤之間的關(guān)系。因此，利用基因編輯技術(shù)在果蠅體內(nèi)開展基因功能研究有助于揭示人類疾病作用的神經(jīng)通路，尋找調(diào)控疾病發(fā)生的關(guān)鍵作用靶標(biāo)，為方便快捷地構(gòu)建人類疾病模型提供一定的借鑒作用。

3 在醫(yī)學(xué)媒介蚊蟲中的研究和應(yīng)用

蚊分布很廣，種類很多，雌性蚊通常以動物血液為食，在吸食血液的過程中作為媒介傳播多種蚊媒病，如瘧疾、登革熱、寨卡病毒感染等疾病。因此開發(fā)針對蚊子的基因編輯技術(shù)有利于研究和改造蚊，為防治多種蚊媒疾病提供合適的工具(表1)。

表1 已報道的CRISPR/Cas9系統(tǒng)在模式昆蟲果蠅和醫(yī)學(xué)媒介蚊蟲中的研究與應(yīng)用Table 1 Research and application of the CRISPR/Cas9 system reported in model insect Drosophilaand medical vector mosquitoes

對埃及伊蚊基因編輯的研究最早可以追溯至20世紀(jì)90年代。Coates和Lobo等的兩項工作，均使用轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)黑腹果蠅D.melanogaster的cinnabar基因插入并導(dǎo)致蚊眼睛顏色的變化(Coatesetal., 1998; Loboetal., 2002)。隨后的3項研究分別使用ZFN技術(shù)實現(xiàn)在埃及伊蚊體內(nèi)對氣味受體共受體(odorant receptor co-receptor, orco)、神經(jīng)肽Y樣受體1(neuropeptide Y-like receptor 1, npylr1)和味覺受體3(gustatory receptor 3, Gr3)基因的突變和功能喪失(DeGennaroetal., 2013; Lieschetal., 2013; McMenimanetal., 2014)。除此之外，Aryan等(2013)使用TALEN技術(shù)實現(xiàn)對埃及伊蚊kmo基因的編輯，獲得白眼的后代。這些進(jìn)展雖然可以提供在蚊子體內(nèi)進(jìn)行基因編輯的手段，但仍然存在一定的局限性，難以方便、快捷且精確地進(jìn)行基因定點編輯。

Kistler等(2015)通過CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)對埃及伊蚊基因組的編輯。通過共同注射濃度為40 ng/μL的sgRNA和Cas9 mRNA或Cas9蛋白，得到帶有目的基因突變的埃及伊蚊后代，其中Cas9蛋白組的突變效率比mRNA組的突變效率高出約4倍左右。該團(tuán)隊同時注射200 nt左右長度的單鏈脫氧核糖核苷酸，試圖獲得通過HDR產(chǎn)生的目的位點的核苷酸插入，但是最終G1代中只有0.65%發(fā)生同源修復(fù)，有18.9%通過NHEJ修復(fù)途徑發(fā)生堿基插入或缺失，剩下80.45%則為野生型。另外，有研究顯示利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在埃及伊蚊體內(nèi)實現(xiàn)了基因編輯，并且同時注射Ku70或者lig4基因的dsRNA序列抑制NHEJ的發(fā)生，提高了HDR效率(Basuetal., 2015; Halletal., 2015)。Itokawa等(2016)在致倦庫蚊Culexquinquefasciatus體內(nèi)注射Cas9蛋白編碼RNA通過基因編輯誘導(dǎo)CYP9M10基因突變，使致倦庫蚊對擬除蟲菊酯的抗性顯著降低。Li等(2017)在埃及伊蚊生殖細(xì)胞中構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Cas9蛋白的品系，降低了構(gòu)建突變體的工作量，提升了突變的準(zhǔn)確性和效率以及HDR的修復(fù)效率，極大地方便了CRISPR/Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用。上述研究也表明該系統(tǒng)的突變效率受到基因靶點、蚊品種以及sgRNA結(jié)合位點的影響。

2018年Duverney團(tuán)隊開發(fā)了受體介導(dǎo)的卵巢分子轉(zhuǎn)運技術(shù)(receptor-mediated ovary transduction of cargo, ReMOT)，在Cas9蛋白上連接一段肽鏈(P2C)，可以介導(dǎo)Cas9蛋白從埃及伊蚊的血淋巴轉(zhuǎn)移到卵巢中，降低了對蚊的注射難度(Chaverra-Rodriguezetal., 2018)；2020年，該團(tuán)隊再次將這一技術(shù)引入斯氏按蚊，擴(kuò)充這一技術(shù)的應(yīng)用范圍(Maciasetal., 2020)。該技術(shù)成功地解決蚊蟲卵小且需要在較短時間內(nèi)注射的難題，實現(xiàn)在蚊體內(nèi)對基因的高效編輯。

Burt(2003)最早提出基因驅(qū)動(gene drive)的概念，是一種將特定性狀在種群中快速擴(kuò)散的系統(tǒng)。該技術(shù)可以利用B染色體、轉(zhuǎn)座子或核酸內(nèi)切酶法等多種途徑將一種特定的外源基因在種群中傳播(Burt and Crisanti, 2018)。隨著基因編輯技術(shù)的興起，CRISPR/Cas9系統(tǒng)介導(dǎo)的基因驅(qū)動技術(shù)能夠?qū)ξ没蚪M進(jìn)行編輯，在控制蚊蟲種群數(shù)量和蚊媒疾病傳播等方面具有重要研究價值。Gantz等(2015)和Hammond等(2016)分別報道了最新的研究進(jìn)展，通過分別向斯氏按蚊體和岡比亞按蚊內(nèi)引入一段Cas9和sgRNA表達(dá)系統(tǒng)，使其在生殖細(xì)胞中同時表達(dá)Cas9蛋白與sgRNA，通過切割以及同源修復(fù)的方式，這一套系統(tǒng)會被復(fù)制到另一條同源染色體的相同位置，從而實現(xiàn)在種群中的快速擴(kuò)增。該技術(shù)可以用于調(diào)節(jié)蚊種群的發(fā)生以達(dá)到多種目的，例如使種群內(nèi)的性別比例失衡以降低種群繁殖能力，或是增強(qiáng)蚊蟲抗病能力，減少瘧疾傳播風(fēng)險。Simoni等(2020)利用基因驅(qū)動技術(shù)，發(fā)現(xiàn)并設(shè)計一個名為“性別扭轉(zhuǎn)基因驅(qū)動”(sex-distorter gene drive, SGDG)的雄蟲驅(qū)動系統(tǒng)，使岡比亞按蚊種群通過自然繁衍，在約18代后有95%的個體全部轉(zhuǎn)變?yōu)樾巯x，為蚊蟲的防治提供了新思路。除了SGDG系統(tǒng)以外，Galizi等(2016)通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)在雄性岡比亞按蚊減數(shù)分裂過程中破壞X染色體結(jié)構(gòu)，在不破壞雄蚊繁殖能力的情況下，使雌蚊數(shù)量顯著減少，實現(xiàn)對種群性別比例的調(diào)控，從而降低雌性按蚊的數(shù)量。

4 在農(nóng)業(yè)害蟲中的研究進(jìn)展

基因編輯技術(shù)同樣可以應(yīng)用于農(nóng)業(yè)昆蟲功能基因組的研究(表2)，基因編輯工具的開發(fā)除了能夠加速對靶標(biāo)基因的研究效率，還能有針對性地解析農(nóng)業(yè)昆蟲中重要分子靶標(biāo)的功能，研究農(nóng)業(yè)害蟲災(zāi)變機(jī)制等，為害蟲防治提供新思路。

Li等(2016)利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)針對飛蝗氣味受體共受體基因Orco開展了基因編輯研究，結(jié)果顯示在飛蝗卵內(nèi)同時注射Cas9的mRNA與gRNA，G0代突變效率高達(dá)71.7%；通過對G1代的檢測結(jié)果顯示，突變體G0代中有88.1%的個體都產(chǎn)生了可遺傳突變。在此基礎(chǔ)上，Guo等(2020)又利用這一技術(shù)體系敲除蝗蟲氣味受體基因OR35，結(jié)果顯示OR35-/-突變體降低4-乙烯基苯甲醚對蝗蟲的觸角的電生理反應(yīng)和行為吸引，明確信息素4-乙烯基苯甲醚對蝗蟲聚集行為的影響，為飛蝗的防治提供新策略。此外，基因編輯技術(shù)在鱗翅目昆蟲研究中也取得了相應(yīng)的進(jìn)展。Bi等(2016)的研究發(fā)現(xiàn)，向斜紋夜蛾Spodopteralitura胚胎中注射表達(dá)Cas9蛋白的mRNA和調(diào)控斜紋夜蛾胚胎發(fā)育Slabd-A基因的sgRNA序列，觀察到幼蟲蟲體分節(jié)異常和表皮色素沉積異位的表型，證明Slabd-A基因的確發(fā)生突變，通過進(jìn)一步探索實驗發(fā)現(xiàn)在一定范圍內(nèi)sgRNA濃度越高，胚胎孵化率越低，但是突變效率會隨之升高。2019年，該團(tuán)隊又利用這項技術(shù)敲除斜紋夜蛾ebony基因以研究色素沉積的機(jī)制(Bietal., 2019)，發(fā)現(xiàn)色素沉積在鱗翅目昆蟲化蛹過程中具有調(diào)控作用，為鱗翅目害蟲基因功能研究提供新的標(biāo)記基因。Chang等(2017)通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)敲除雄性棉鈴蟲Helicoverpaarmigera感受性信息素次要組分的氣味受體基因HarmOR16，導(dǎo)致其可與未成熟的雌性交配，闡明棉鈴蟲次要性信息素成分作為性信息素拮抗劑參與調(diào)控棉鈴蟲的最優(yōu)交配時機(jī)。Wang等(2018)利用CRISPR/Cas9技術(shù)在棉鈴蟲體內(nèi)敲除解毒酶基因簇CYP6AE，使用殺蟲劑處理后顯著降低棉鈴蟲的存活率。Liu等(2020)利用CRISPR/Cas9技術(shù)同時引入兩個基因的sgRNA進(jìn)行雙敲除試驗，證實小菜蛾P(guān)lutellaxylostella兩個氣味受體蛋白共同作用識別異硫氰酸酯類化合物，解析小菜蛾識別十字花科寄主植物的分子機(jī)制。最新的一項研究揭示基因編輯技術(shù)在半翅目昆蟲煙粉虱中取得突破性進(jìn)展，Heu等(2020)利用ReMOT control技術(shù)，對Cas9蛋白進(jìn)行修飾，融合一段卵巢靶向配體肽鏈，與sgRNA混合后直接向雌性煙粉虱體內(nèi)注射，最終得到基因編輯后的子代，為解決煙粉虱胚胎小、注射難度大等技術(shù)難題提供新的方法。

5 在有益昆蟲利用上的研究與應(yīng)用

鱗翅目家蠶Bombyxmori具有良好的經(jīng)濟(jì)價值，已經(jīng)有多個研究團(tuán)隊利用基因編輯技術(shù)對家蠶的基因功能進(jìn)行研究。Wang等(2013)首次在家蠶中成功地應(yīng)用了CRISPR/Cas9系統(tǒng)，將表達(dá)Cas9和sgRNA的mRNA共同注射到家蠶胚胎中，成功突變靶基因BmBLOS2，由于該基因調(diào)控家蠶幼蟲表皮中尿酸鹽顆粒的形成，因此突變后導(dǎo)致家蠶幼蟲表皮變?yōu)橥该魃?。通過該方法得到G0代產(chǎn)生嵌合體的突變效率高達(dá)90%以上，并且該基因突變品系可以實現(xiàn)穩(wěn)定遺傳，在G1代也可以觀察到全身變透明的轉(zhuǎn)基因家蠶幼蟲；此外，他們還通過同時注射兩條sgRNA的方法，獲得了大片段敲除的家蠶突變體。Zhu等(2015)發(fā)現(xiàn)在家蠶細(xì)胞中敲低NHEJ相關(guān)因子Ku70,Ku80,LigIV,XRCC4和XLF可以提高HDR的效率，并成功將EGFP基因序列敲入BmTUDOR-SN基因。Zeng等(2016)進(jìn)一步優(yōu)化CRISPR/Cas9系統(tǒng)在家蠶中的應(yīng)用，研究發(fā)現(xiàn)家蠶U6啟動子在體外和體內(nèi)均能有效表達(dá)N20NGG型sgRNAs從而進(jìn)行基因組編輯。相比于GN19NGG和GGN18NGG型的sgRNA設(shè)計位點，N20NGG型靶點在基因組中的匹配范圍更廣。Ma等(2017)在Cas9蛋白啟動子上游添加HR3增強(qiáng)子將敲除效率提高了3.5倍，并且發(fā)現(xiàn)另外兩種Cas9蛋白的同系物，即金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus的SaCas9和氨基酸球菌屬Acidaminococcus的AsCpf1，它們也可以在家蠶細(xì)胞中發(fā)揮切割DNA的作用。

表2 基因編輯技術(shù)在害蟲防治和益蟲利用上的應(yīng)用Table 2 Application of gene editing technology in pest insects and beneficial insects

昆蟲性別決定機(jī)制復(fù)雜多樣，家蠶作為鱗翅目模式昆蟲是研究ZW型染色體昆蟲性別決定較好的材料；此外，雄性家蠶具有更高的經(jīng)濟(jì)價值，因此構(gòu)建雌性致死的家蠶品系也有助于降低工業(yè)養(yǎng)殖的成本。Tan等(2013)利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)構(gòu)建piggyBac轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的家蠶雌性致死品系，以獲得生產(chǎn)成本更低的雄性家蠶， 這一技術(shù)同樣有望被應(yīng)用于害蟲的防治工作中。Xu等(2014)結(jié)合轉(zhuǎn)基因技術(shù)和TALEN技術(shù)構(gòu)建出雌性不育的家蠶品系，這一表型僅在雌性中發(fā)生，而不影響雄性的正常發(fā)育。隨后，Xu等(2017)利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除一系列基因，闡述這些基因?qū)倚Q性別的影響，為后續(xù)家蠶性別篩選工作提供良好的基礎(chǔ)。Zhang等(2018)首先利用TALEN技術(shù)構(gòu)建nanos啟動子驅(qū)動的雌性特異表達(dá)的Cas9品系，并將其與靶向家蠶胚胎致死基因tra2的轉(zhuǎn)基因sgRNA表達(dá)品系進(jìn)行雜交，通過CRISPR/Cas9系統(tǒng)獲得雌性致死而雄性存活的家蠶后代。黃勇平和譚安江團(tuán)隊利用多種基因編輯技術(shù)構(gòu)建家蠶性別調(diào)控體系(Tanetal., 2013; Xuetal., 2014, 2017; Zhangetal., 2018)，這些研究為闡明家蠶性別決定的調(diào)控機(jī)制提供有力的證據(jù)。

基因編輯技術(shù)也應(yīng)用在家蠶抗病毒和提高蠶絲質(zhì)量等方面。Chen等(2017)利用piggyBac質(zhì)粒，將IE1控制的Cas9蛋白和U6啟動子控制的sgRNA導(dǎo)入家蠶基因組，并以家蠶核型多角體病毒(Bombyxmorinuclear polyhydrosis virus, BmNPV)的early-1(ie1)和me53基因為靶標(biāo)，成功切割病毒基因組序列，極大地增強(qiáng)家蠶的抗病毒能力，為蠶病防治提供新的手段。Xu等(2018)使用TALEN技術(shù)將蠶絲蛋白重鏈基因FibH替換為蛛絲蛋白基因MaSp1。Zhang X等(2019)利用CRISPR/Cas9技術(shù)向家蠶中表達(dá)蠶絲蛋白基因FibH或FiBL內(nèi)含子區(qū)域插入蛛絲蛋白基因MaSp1/MiSp1的序列，這些研究使蠶絲纖維的力學(xué)性能得到極大的改善，抗張力強(qiáng)度幾乎與天然蜘蛛絲纖維相當(dāng)，并且轉(zhuǎn)基因能在后代中穩(wěn)定遺傳。

此外，Zhang ZJ等(2019)利用CRISPR/Cas9技術(shù)實現(xiàn)在家蠶體內(nèi)對味覺受體基因GR66的敲除，得到的家蠶突變體改變其對桑葉的偏好性，可以進(jìn)食多種食物，如水果或谷物種子。這項研究成果一旦應(yīng)用于生產(chǎn)中，將助力家蠶養(yǎng)殖行業(yè)的快速發(fā)展。

基因編輯技術(shù)在經(jīng)濟(jì)昆蟲蜜蜂中也被成功應(yīng)用。Kohno等(2016)通過向西方蜜蜂Apismellifera胚胎中注射表達(dá)Cas9蛋白的mRNA和sgRNA，突變工蜂的mrjp1基因，在注射了57個胚胎之后得到6頭發(fā)育為蜂后的雌蜂，并有1頭蜂后可以產(chǎn)生雄性突變后代，為進(jìn)一步研究蜜蜂的社會行為奠定基礎(chǔ)。McAfee等(2019)使用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除蜜蜂2個關(guān)鍵基因feminizer和doublesex使得其性別發(fā)生改變。Liu等(2019)使用CRISPR/Cas9技術(shù)對蜜蜂寄生性錐蟲Lotmariapassim進(jìn)行基因編輯，并通過HDR修復(fù)的方式插入目的基因，成功使后代攜帶上熒光標(biāo)記或是獲得潮霉素抗性。因此，利用CRISPR/Cas9技術(shù)研究基因功能也有助于解析蜜蜂與寄生蟲之間的互作機(jī)制。

6 小結(jié)與展望

昆蟲基因突變最早通過高能射線輻射、化學(xué)物質(zhì)誘變產(chǎn)生隨機(jī)突變，但是效率較低且無法控制后果；隨后，研究者也使用過特異性的轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)DNA斷裂從而啟動HDR修復(fù)的方式，然而實用性和效率依然不盡人意。隨著人類對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的了解，通過將不同DNA識別域和FokI蛋白進(jìn)行融合得到有特異性的DNA切割蛋白這一想法成為可能，ZFN和TALEN技術(shù)也應(yīng)運而生，其中TALEN技術(shù)更易操作。但是鑒于這兩種技術(shù)在蛋白構(gòu)建上的高成本，因而很快被新發(fā)展起來的CRISPR/Cas9技術(shù)逐漸取代。

由于CRISPR/Cas9技術(shù)設(shè)計簡單，深受廣大科研工作者的青睞，該技術(shù)經(jīng)過加工改造之后衍生出來更多的基因編輯工具，例如dCas9, CRISPRi, xCas9和Cas13a等系統(tǒng)，極大地豐富了調(diào)控和改造基因的手段。目前，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在昆蟲體內(nèi)的研究主要分成以下幾個方向：(1)對基因編輯系統(tǒng)的優(yōu)化，增加其編輯效率以及降低脫靶效應(yīng)；(2)基于該系統(tǒng)進(jìn)行新型基因調(diào)控工具的開發(fā)；(3)對工業(yè)生產(chǎn)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)、害蟲防治等方面的轉(zhuǎn)基因昆蟲品系構(gòu)建；(4)重要基因的體內(nèi)功能研究。

CRISPR/Cas9系統(tǒng)在昆蟲中的應(yīng)用仍然有較多亟待解決的問題，例如脫靶效應(yīng)是基因編輯技術(shù)中無法繞過的難題。目前，一些研究通過優(yōu)化sgRNA堿基偏好性和序列長度以降低脫靶效應(yīng)，并且已經(jīng)取得顯著成效。Ren等(2014b)在模式昆蟲果蠅中對影響CRISPR/Cas9系統(tǒng)特異性和效率的sgRNA參數(shù)進(jìn)行系統(tǒng)的研究，發(fā)現(xiàn)當(dāng)sgRNA與基因組DNA有3個及以上的核苷酸不匹配時，不會發(fā)生脫靶效應(yīng)。此外，該研究團(tuán)隊還證明，在果蠅中CRISPR/Cas9系統(tǒng)的突變效率與sgRNA中6個前間區(qū)序列鄰近基序(protospacer adjacent motif, PAM) 近端核苷酸的GC含量存在強(qiáng)烈的正相關(guān)，對提高CRISPR/Cas9系統(tǒng)在其他昆蟲中的效率有一定的借鑒作用。除了對sgRNA進(jìn)行優(yōu)化，也可以針對Cas9蛋白進(jìn)行優(yōu)化，如通過修飾PAM識別位點，擴(kuò)充Cas9蛋白的潛在識別位點(Kleinstiveretal., 2015)或是直接使Cas9蛋白變得更具有特異性(Slaymakeretal., 2016)。最近的研究顯示，利用噬菌體輔助的連續(xù)進(jìn)化(phage-assisted continuous evolution, PACE)方式得到一個SpCas9變體，即xCas9蛋白，可以識別廣泛的PAM序列(包括NG，GAA和GAT)，并且脫靶效應(yīng)更低(Huetal., 2018)。這些發(fā)現(xiàn)擴(kuò)大了CRISPR系統(tǒng)的DNA靶向范圍以實現(xiàn)更高效的編輯。

基于dCas9蛋白開發(fā)的一系列遺傳學(xué)工具具有各自的特點。dCas9是突變掉Cas9蛋白內(nèi)切酶活性位點的DNA結(jié)合蛋白，不具有切割活性，只能結(jié)合DNA。dCas9蛋白結(jié)合在DNA上，可以直接影響RNA聚合酶的正常轉(zhuǎn)錄(Bikardetal., 2013)。對dCas9進(jìn)一步改造并融合其他效應(yīng)蛋白后可以實現(xiàn)對特定基因的CRISPR干擾(CRISPR interference, CRISPRi)或CRISPR激活(CRISPR activation, CRISPRa)，以及對特定的染色質(zhì)區(qū)域進(jìn)行修飾(Brockenetal., 2017)。目前，這些dCas9相關(guān)技術(shù)已經(jīng)在昆蟲中得到應(yīng)用，例如在果蠅體內(nèi)開發(fā)了dCas9-VPR轉(zhuǎn)錄激活系統(tǒng)(Linetal., 2015; Ewen-Campenetal., 2017)，最初需要兩個sgRNA同時表達(dá)才能激活目的基因轉(zhuǎn)錄，增加了操作的復(fù)雜性和成本，隨后，Jia等(2018)對其進(jìn)行優(yōu)化并得到了更為高效便捷的flySAM系統(tǒng)，即利用自剪切肽T2A將dCas9-VP64和MCP-p65-HSF1融合，并將該融合蛋白與sgRNA整合為一個載體，這樣僅需一次遺傳雜交，就可以激活一個甚至同時激活多個基因的表達(dá)，并且比VPR系統(tǒng)效率更高。

然而，隨著CRISPR/Cas9系統(tǒng)被研究得越來越透徹，在系統(tǒng)優(yōu)化過程中，邊際效應(yīng)也逐漸明顯，因此利用各種手段直接尋找新型基因編輯工具也成為一大研究熱點。例如Cas13a蛋白可以通過靶向RNA從而實現(xiàn)RNA編輯(Abudayyehetal., 2016)，避免對生物基因組的破壞，對許多領(lǐng)域的研究具有非常廣闊的應(yīng)用前景。隨著基因編輯技術(shù)研究手段的不斷深入，相信越來越多CRISPR/Cas家族成員的功能將被揭示，這些新技術(shù)的發(fā)展對昆蟲的基因功能、病蟲害防治、經(jīng)濟(jì)性昆蟲改良等方面的研究具有舉足輕重的作用。