王少翠，杜歡歡，戴希堯，劉 婕，李占臺，任喜波

(1.河北北方學(xué)院 研究生學(xué)院，河北 張家口 075000；2.河北北方學(xué)院 農(nóng)林科技學(xué)院，河北 張家口 075000)

0 引 言

多肉植物，又叫多漿植物，多肉植物一詞由瑞典植物學(xué)家Jean Bauhin首次提出[1]。多肉植物最顯著的特點(diǎn)是植物營養(yǎng)器官的某一部分薄壁組織發(fā)達(dá)，用以水分和養(yǎng)分的貯藏，外形顯得肥厚多汁，多生長于少雨的高山頂部、沙漠、巖礫等干旱、干燥地區(qū)，管理方便，抗逆性強(qiáng)，具有一定的空氣凈化功能?，F(xiàn)今發(fā)現(xiàn)的多肉植物約有50科、334屬，近1萬種，并且隨著雜交選育和人工誘變的不斷開展，新種還在不斷增加[2]。多肉植物外表大都造型奇特、花姿絢麗爛漫，觀賞價值極高，尤其是其具有的凈化空氣和較強(qiáng)抗干旱能力的景天酸代謝途徑與現(xiàn)代人們追求健康和美并存的理念相契合，在管理方面和蘭花、百合等鮮花相比更加粗放，近年來受到眾多消費(fèi)者的喜愛[3]。進(jìn)入21世紀(jì)以來，隨著花卉設(shè)施栽培技術(shù)的發(fā)展，花卉種類越來越豐富，對新奇花卉品種的需求逐漸增加，加之電子商務(wù)等領(lǐng)域的迅猛發(fā)展，多肉植物已由小眾的愛好者規(guī)模逐漸發(fā)展成為全國范圍內(nèi)的多肉植物產(chǎn)業(yè)。

多肉植物普遍存在繁殖周期長、增殖速度慢、雌雄蕊異熟和種子小等問題，難以滿足產(chǎn)業(yè)化需要。利用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖多肉植物是解決多肉植物繁殖量和需求量矛盾的一種快速有效的方法，對于保存多肉植物優(yōu)良的種質(zhì)資源、繁殖名貴珍稀品種、快速繁殖、出口需求和園林綠化需要的優(yōu)良品種有著特別重要的意義[4]。

中國植物組織培養(yǎng)研究開始于20世紀(jì)70年代后期，中國學(xué)者創(chuàng)造出許多新方法、新技術(shù)，得到大量新成果[5]，但是相較于其他植物，多肉植物組織培養(yǎng)方面的研究起步較晚，起步于21世紀(jì)初期[6]，最初是李德森等分別對康平壽[7]、星球和鸞鳳玉[8]3種多肉植物進(jìn)行了再生體系的建立，之后開始有更多學(xué)者對各科各屬多肉植物的組織培養(yǎng)和快繁技術(shù)進(jìn)行更加深入的研究，目前有關(guān)多肉植物的組織培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)逐漸成熟。

本文對國內(nèi)多肉植物的組織培養(yǎng)技術(shù)中外植體的選擇、消毒滅菌、培養(yǎng)基種類、激素、試管苗移栽等多肉植物組織培養(yǎng)技術(shù)方面的相關(guān)成就進(jìn)行了總結(jié)，分析了當(dāng)前在組織培養(yǎng)過程中存在的污染、玻璃化和褐化三大難題，旨在為多肉植物組織培養(yǎng)研究提供參考。

1 多肉植物組織培養(yǎng)技術(shù)

1.1 外植體的選擇

外植體的選取是植物組織培養(yǎng)過程的基礎(chǔ)環(huán)節(jié)，是能否培養(yǎng)出合格幼苗的關(guān)鍵。植物可作為外植體用于組織培養(yǎng)的部位很多，如嫩芽、葉片和花莖等，只要具有再生能力，就可以被選取為外植體。前人研究發(fā)現(xiàn)，不同株的植物或同一株植物的不同取材部位、生長發(fā)育階段、外植體的大小等在組培過程中表現(xiàn)均有不同，誘導(dǎo)無菌苗的成功率也會顯現(xiàn)出差異[9]。

林荔瓊[10]、豐鋒等[11]以蘆薈的頂芽和腋芽為外植體成功誘導(dǎo)出蘆薈再生植株。柴清東等[12]分別以黑王子葉片不同部位作為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)分化，發(fā)現(xiàn)葉片的分化能力由強(qiáng)到弱分別為基部>中部>頂部，從而建立了黑王子快速、高效的離體培養(yǎng)體系，為其快速繁殖和利用提供了技術(shù)保障，使得這一觀賞價值較高的植物可以得到更加充分的利用。王紫珊等[13]對白銀壽的花蕾、不同部位花葶進(jìn)行離體培養(yǎng)研究，發(fā)現(xiàn)白銀壽花蕾處細(xì)胞分裂旺盛，愈傷組織誘導(dǎo)能力最強(qiáng)，為最適外植體，其次是花葶上部；而中部和下部誘導(dǎo)率偏低，不適合作為外植體。何佳越等[14]分別以帝玉露成熟葉片和新生的幼嫩葉片為外植體進(jìn)行誘導(dǎo)、增殖和生根培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)新生葉片發(fā)生愈傷組織的時間早、污染率稍低，但是發(fā)生愈傷的數(shù)量、品質(zhì)不如成熟葉片，綜合考慮，最終得出用成熟葉片作為外植體可以建立帝玉露的快繁體系的結(jié)論。

據(jù)前人大量研究發(fā)現(xiàn)[15-17]，多肉植物芽數(shù)量較少，并且取材時操作不當(dāng)會對母株造成較大影響。葉片和花莖作為外植體雖不會對植株觀賞部位造成嚴(yán)重?fù)p傷，但葉片含水量較高，會對滅菌后的存活率產(chǎn)生一定影響；相比較于葉片，莖段能更快地誘導(dǎo)出愈傷組織，但是花莖的取材存在較大局限性，而且莖段比葉片更加細(xì)嫩，受到污染的幾率更大。因此具體選取哪個部位作為外植體，還需要結(jié)合培養(yǎng)目的從多方面進(jìn)行考慮。

1.2 外植體的消毒滅菌

外植體帶菌是污染現(xiàn)象發(fā)生的直接原因[18]，因此選擇合適的消毒試劑和時間組合，在盡可能減少對外植體組織及表層細(xì)胞的傷害并保持材料本身活力的情況下將附著于外植體表面的微生物徹底殺死。當(dāng)前在組織培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)過程中常用的消毒試劑主要有：升汞(HgCl2)、乙醇(C2H5OH)、次氯酸鈉(NaClO)等[7]，各種試劑的消毒效果和清洗的難易程度各有不同：乙醇滲透性較強(qiáng)，但消毒作用十分有限；升汞的殺菌效果最強(qiáng)，但使用后難以清洗，易引起外植體褐化，且不利于環(huán)保；次氯酸鈉消毒較溫和，容易清除，對外植體傷害較小。

林加根等[19]以中華蘆薈的莖段為外植體采取的消毒滅菌的處理方法是自來水沖洗后用75%乙醇浸泡(30 s)，再用0.1%升汞浸泡10 min，最后用無菌水沖洗4～5次。張淑紅等[20]以枝干番杏的幼嫩腋芽為外植體，篩選出最佳消毒方法是自來水沖洗30 min、42 ℃熱水處理1 h后，70%乙醇浸泡40 s，用無菌水沖洗3次，再用0.1%升汞浸泡10 min，最后用無菌水沖洗6次。閆金國等[21]先將景天科大和錦葉片于干燥通風(fēng)處晾曬1 d后，用自來水沖洗30 min，再用2%次氯酸鈉浸泡10 min，最后用無菌蒸餾水沖洗5次。

時間過短達(dá)不到理想的消毒效果，時間過長又會對外植體的再生分化能力產(chǎn)生影響，具體消毒時間的長短應(yīng)根據(jù)接種材料不同具體掌握。由以上諸多前人的試驗(yàn)研究可總結(jié)出，外植體消毒需要先采用70%～75%乙醇消毒30～60 s，再配合使用0.1%的升汞或2%的次氯酸鈉進(jìn)行10 min左右的浸泡，并且在浸泡后必須使用無菌水進(jìn)行多次清洗，以免消毒液殘留影響外植體的分化能力，但不能一概而論，具體的消毒方法需要考慮外植體狀態(tài)、取材部位的不同、取材時間的差異等多方面因素，從而慎重選擇消毒方法，這也是多肉植物外植體無菌體系建立的關(guān)鍵。

1.3 培養(yǎng)基種類

在多肉植物組織培養(yǎng)中，培養(yǎng)基是植株生長分化所必需的基本營養(yǎng)物質(zhì)。初代、繼代和生根等不同生長發(fā)育階段所需的培養(yǎng)基成分不同，對培養(yǎng)基種類的要求不盡相同。當(dāng)前多肉植物組織培養(yǎng)過程中用到的培養(yǎng)基一般為MS和1/2MS，其中1/2MS培養(yǎng)基一般用于生根培養(yǎng)。例如，勞爾[22]和玉露[23]葉片為外植體時和照波[24]莖段為外植體時最佳愈傷組織誘導(dǎo)和分化培養(yǎng)基的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS，生根基本培養(yǎng)基均為1/2MS。

1.4 植物生長調(diào)節(jié)劑

植物的外植體材料附著于培養(yǎng)基上吸收的營養(yǎng)只能維持最基本的生理活動，后繼的誘導(dǎo)細(xì)胞分裂、芽和根的分化等必須配合使用相應(yīng)的激素進(jìn)行調(diào)節(jié)，是培養(yǎng)基的重要組成成分更是植物外源激素的來源。目前多肉植物組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常添加使用的植物生長調(diào)節(jié)劑主要是生長素(IAA、IBA、NAA、2，4-D等)和細(xì)胞分裂素(6-BA、KT、ZT等)[25-26]。

郭艷等[27]以多肉植物帝王壽成熟葉片為外植體，得出愈傷組織誘導(dǎo)率最高、褐變程度最輕的最佳激素配比為6-BA 2.0mg·-L-1+NAA 0.2 mg·-L-1，適合增殖培養(yǎng)和誘導(dǎo)生根培養(yǎng)的激素配比分別為6-BA 3.0 mg·-L-1+NAA 0.3 mg·-L-1和1/2 MS+NAA 0.1 mg·-L-1。吳正景等[28]以風(fēng)鈴玉葉片為實(shí)驗(yàn)材料，得出NAA 0.2 mg·-L-1+6-BA 0.2 mg·-L-1配合使用，愈傷組織誘導(dǎo)率最高為85.7%，誘芽培養(yǎng)基篩選出IBA 0.02 mg·-L-1+6-BA 0.2 mg·-L-1的激素組合可以直接誘導(dǎo)出生長健壯的叢生芽，最佳生根培養(yǎng)基是1/2MS+IBA 0.1 mg·-L-1，生根率高達(dá)83.3%，相比較培養(yǎng)基是MS時，生根率和生根條數(shù)都有明顯提高，因此得出結(jié)論：低鹽分添加適量IBA對風(fēng)鈴玉不定芽生根誘導(dǎo)具有促進(jìn)作用。軒華強(qiáng)等[29]研究雪國萬象葉片激素配比試驗(yàn)時得出，誘導(dǎo)愈傷組織的最佳激素組合是6-BA 2.5 mg·-L-1+NAA 0.2 mg·-L-1，適于愈傷組織繼代培養(yǎng)激素組合是NAA 0.1 mg·-L-1+6-BA 1.0 mg·-L-1；適于愈傷組織分化的激素配合是NAA 0.15 mg·-L-1+6-BA 1.0 mg·-L-1；適于生根的培養(yǎng)基為MS+NAA 0.3～0.5 mg·-L-1。

不同激素之間彼此存在協(xié)同或是拮抗作用，組織培養(yǎng)過程中通過不同濃度的配比可以直接或間接對植物的細(xì)胞、器官發(fā)育及形態(tài)建成進(jìn)行調(diào)節(jié)控制，對于植物生長調(diào)節(jié)物質(zhì)的使用與添加必須謹(jǐn)慎[30]。因此應(yīng)當(dāng)針對培養(yǎng)材料的種類來源和培養(yǎng)目的的不同，對激素種類和濃度比例進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整。

1.5 試管苗移栽

在試管苗移栽過程中，開瓶時間、土壤基質(zhì)、溫濕度管理、營養(yǎng)液配比等會對移栽質(zhì)量產(chǎn)生影響。開瓶適應(yīng)環(huán)境的時間過短，影響幼苗對新環(huán)境的適應(yīng)，時間過長會導(dǎo)致培養(yǎng)基受到污染，水分和養(yǎng)分過量蒸發(fā)，從而影響幼苗生長。在多肉植物的組培苗移栽前，應(yīng)注意對基質(zhì)進(jìn)行徹底消毒滅菌，移栽后應(yīng)注意基質(zhì)保持濕潤，避免過干或積水。

王婷[6]在對姬玉露的組織培養(yǎng)快繁技術(shù)體系的研究中，得出基質(zhì)為赤玉土∶蛭石∶泥炭土=2∶2∶1時，移栽成活率最高為83.33%，生長速度快、健壯；其次是基質(zhì)赤玉土∶蛭石∶泥炭土=3∶1∶1，再生植株移栽成活率為66.67%。原因可能是基質(zhì)透氣性好、泥炭土中能提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)。管菊等[31]在吸財樹組培試驗(yàn)中將帶根組培苗移栽于干濕兩種狀態(tài)的椰糠∶珍珠巖=1∶1基質(zhì)中，試驗(yàn)結(jié)果表明在濕潤狀態(tài)的基質(zhì)中吸財樹生長狀態(tài)良好,移栽后不萎蔫,發(fā)根速度快,成活率最高為93.30%,為吸財樹的最優(yōu)煉苗方法；干燥狀態(tài)下大部分植株均出現(xiàn)萎蔫,嚴(yán)重的甚至出現(xiàn)死亡,41 d后才有新根出現(xiàn)，成活率為36.70%。

腐殖質(zhì)有豐富的有機(jī)物質(zhì)，吸水性強(qiáng)，但是透氣透水性差，當(dāng)土壤含水量過大時不能及時排水，會導(dǎo)致爛根現(xiàn)象。蛭石含有豐富的礦質(zhì)營養(yǎng)，具有較好的離子交換性，可以改變土壤酸性，有良好的保濕透氣性，缺點(diǎn)是不易粉碎、不能重復(fù)利用。珍珠巖吸水能力強(qiáng)、可預(yù)防土壤板結(jié)、控制肥效和肥力，缺點(diǎn)是氣孔多浮力大、誤食或吸入身體后影響健康。結(jié)合前人的研究發(fā)現(xiàn)，栽培基質(zhì)各有優(yōu)缺點(diǎn)，只有結(jié)合外植體植株的生長特性，才能篩選出最合適的基質(zhì)配方。

2 多肉植物組織培養(yǎng)技術(shù)中存在的問題

我國對于多肉植物組培方面的研究尚處于探索起步階段，研究重點(diǎn)多集中于培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件方面，而不同的多肉品種研究出的結(jié)果又存在很大的不同。培養(yǎng)過程中出現(xiàn)的很多問題還未能得到解釋和解決，包括對于外植體、培養(yǎng)基、激素配比以及培養(yǎng)條件、操作技術(shù)、人為因素等各方面均會對最終結(jié)果產(chǎn)生影響，尚未構(gòu)建出完整的、可應(yīng)用于實(shí)際生產(chǎn)的多肉植物組織培養(yǎng)體系。在多肉植物組織培養(yǎng)過程中，褐化、污染和玻璃化為較常見的難題，尤其是褐化。隨著組織培養(yǎng)機(jī)制的逐漸完善，關(guān)于這些問題的研究也在逐漸深入。

2.1 褐化問題

在多肉植物組織培養(yǎng)過程中，最常見的問題就是褐化現(xiàn)象。褐化現(xiàn)象是指在植物組織培養(yǎng)中，外植體受到自身分泌的酚類化合物的影響導(dǎo)致褐變褐化，嚴(yán)重影響外植體后續(xù)的分化和再生芽，最終走向死亡。褐化現(xiàn)象的產(chǎn)生與外植體的基因型、切口大小、老化程度、取材時間、培養(yǎng)環(huán)境等多方面都有聯(lián)系，褐化甚至比污染和玻璃化更難控制[32]。褐化產(chǎn)生的原因主要分為兩種：一是由于細(xì)胞受到不利條件影響造成細(xì)胞死亡而形成的褐化現(xiàn)象。二是由于酚類物質(zhì)被多酚氧化酶氧化激活[33]，發(fā)生氧化反應(yīng)后生成一種醌類物質(zhì)，逐漸向外植體材料四周擴(kuò)散，形成褐化。

目前預(yù)防褐化的方法主要有：選擇合適的外植體和適宜的消毒方法[34]；選擇合適的切割方式，盡可能減小切口面積[23]；定期進(jìn)行繼代培養(yǎng)，一旦發(fā)生褐化，立刻將褐化部分去除，并將外植體轉(zhuǎn)移至新的培養(yǎng)基，避免褐化面積增大[35]；將培養(yǎng)室溫度調(diào)節(jié)至最適培養(yǎng)溫度，盡可能保持恒溫，避免溫度大幅度浮動，培養(yǎng)基中添加不同種類不同濃度的還原劑和吸附劑，如聚乙烯吡絡(luò)烷酮(PVP)、抗壞血酸(VC)、活性炭(AC)等[36]，可以不同程度降低褐化，如大花紅景天在培養(yǎng)基中添加10 mg·-L-1VC能夠有效抑制褐化現(xiàn)象產(chǎn)生[37]；創(chuàng)造最佳培養(yǎng)條件，組培室內(nèi)調(diào)節(jié)適宜的溫度和光照時長，如周曉鹿等[38]對皂質(zhì)蘆薈誘導(dǎo)愈傷組織褐化現(xiàn)象研究時發(fā)現(xiàn)，外植體接種初期進(jìn)行暗培養(yǎng)對抑制愈傷組織的褐化能起到關(guān)鍵的作用。

2.2 污染問題

在多肉組織培養(yǎng)的過程中，污染問題已然成為一個重要障礙，對組培苗的規(guī)模化生產(chǎn)、試管基因庫的構(gòu)建和寶貴資料的保護(hù)工作都產(chǎn)生了較大阻力[39]。污染主要分為真菌污染和細(xì)菌污染，真菌污染主要是霉菌引起的，生長速度快、潛伏期短，容易被發(fā)現(xiàn)；細(xì)菌污染具有一定時間的潛伏期，主要表現(xiàn)是培養(yǎng)物附近會出現(xiàn)粘液狀、泡沫狀、云霧狀的物體或者痕跡。造成污染的原因是多方面的，如外植體本身帶菌、培養(yǎng)基出現(xiàn)污染、實(shí)驗(yàn)室環(huán)境及操作過程不規(guī)范導(dǎo)致污染等。目前預(yù)防污染的措施主要有選擇晴天對外植體進(jìn)行取材，選擇適宜的滅菌方式，保證試驗(yàn)環(huán)境和試驗(yàn)過程無菌化等[40]。

2.3 玻璃化問題

玻璃化指在組織培養(yǎng)過程中，由于水分?jǐn)z入過多，從而導(dǎo)致某些植物結(jié)構(gòu)組織呈現(xiàn)半透明、卷曲易碎的狀態(tài)，不能移栽成活于試管外，又稱過度水化。組培苗玻璃化會導(dǎo)致其生理功能不健全、分化能力低，對繼代和移栽成活率都會產(chǎn)生影響。玻璃化產(chǎn)生的原因是多方面的，包括外植體的生理年齡、培養(yǎng)基成分、培養(yǎng)過程中的通風(fēng)條件和溫度光照等外界因素，目前預(yù)防玻璃化的手段主要有MS培養(yǎng)基中適當(dāng)增加瓊脂濃度和添加低濃度的NaCl有利于防止試管苗玻璃化發(fā)生[41]；培養(yǎng)基中適當(dāng)調(diào)整激素濃度，如郭生虎等[42]在玉露組織培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中6-BA濃度高時玻璃化現(xiàn)象較嚴(yán)重，當(dāng)6-BA≤0.5 mg·-L-1，NAA濃度調(diào)整為0.01 mg·-L-1時叢生芽基本沒有玻璃化現(xiàn)象，且叢生芽增殖效果好；培養(yǎng)基中適量添加無機(jī)物和有機(jī)物，控制培養(yǎng)基的環(huán)境條件等[43]。

3 多肉植物組織培養(yǎng)技術(shù)前景展望

多肉植物種類繁多、花朵艷麗多姿、果實(shí)碩大飽滿，管理簡單且節(jié)水節(jié)肥，繁殖力強(qiáng)、病蟲害少、凈化能力強(qiáng)，是國內(nèi)外受高度歡迎的綠植種類之一。采用組織培養(yǎng)技術(shù)快速繁殖多肉植物對于多肉植物種質(zhì)資源的保存、名優(yōu)珍稀品種的繁殖、快速繁殖出口和園林綠化需要的優(yōu)良品種，都有著特別重要的理論指導(dǎo)意義，打破了自然條件對于植物生長產(chǎn)生的禁錮，滿足當(dāng)今高速發(fā)展的農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化對大批量和高質(zhì)量種苗的需求，是未來多肉植物繁殖的一個新方向，為多肉市場未來的發(fā)展奠定良好的基礎(chǔ)。多肉植物中多數(shù)種類都具有藥用價值、觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值，譬如可用于清熱解毒的仙人掌、景天等，有殺菌消炎等功效的蘆薈等。為了今后更好地開展多肉植物方面的組織培養(yǎng)技術(shù)研究，推動其在實(shí)際生產(chǎn)中的應(yīng)用，可從以下幾個方面開展進(jìn)一步的研究工作。

1)應(yīng)當(dāng)逐步擴(kuò)大多肉植物組織培養(yǎng)的種類，側(cè)重點(diǎn)向一些瀕臨滅絕和價格昂貴的品種傾斜，如景天科仙女杯屬等；藥用價值較高的品種，如西藏紅景天等；觀賞價值較高的品種，如龍舌蘭科等；對環(huán)境有益處的品種，如仙人掌、伽藍(lán)菜等。

2)對于一些已經(jīng)成功進(jìn)行離體培養(yǎng)的多肉植物，應(yīng)當(dāng)在組織培養(yǎng)方面進(jìn)行更深層次的研究，使常見的褐化、污染和玻璃化等問題處理步驟刪繁就簡，盡量降低成本，爭取在實(shí)際應(yīng)用中取得更大的成效和收益。

3)將組織培養(yǎng)技術(shù)與生理、生化及分子生物學(xué)等學(xué)科相互交叉融合，以便為植物生長產(chǎn)生影響的各方面因素進(jìn)行研究提供有力的觀察條件，從而提高其在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上的利用價值，為藥物生產(chǎn)開辟新途徑[44]。開展相關(guān)機(jī)理研究，使多肉植物組培理論基礎(chǔ)更加扎實(shí)，擴(kuò)大研究范圍，加速建立多肉植物最優(yōu)組織快繁體系。