范 欽， 李紅俊， 李曉霞， 楊 尹， 陳海燕， 成家茂

1 大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院 解剖學(xué)教研室， 云南 大理 671000；2 大理大學(xué)臨床醫(yī)學(xué)院 超聲教研室， 云南省第四人民醫(yī)院 超聲科， 云南 大理 671000

肝纖維化是慢性肝損傷后進一步惡化的關(guān)鍵性病理過程，是提升肝癌風(fēng)險的關(guān)鍵因素，目前尚無特異有效的治療方法。多種信號通路參與肝纖維化的調(diào)控，包括TGFβ、Hedgehog、Wnt、Notch、MAPK、PI3K、NF-κB、Rho、S1P等信號通路。其中，Wnt是一個廣泛存在且高度保守的信號，在創(chuàng)傷修復(fù)和纖維化形成過程中與許多器官如肝、腎、肺和心臟的纖維化發(fā)生有關(guān)[1-2]。越來越多的研究[2]表明，靶向Wnt信號可能是一種新的、有前途的抗纖維化策略。因此，本文就Wnt信號通路及其在肝纖維化中的調(diào)控作用進行綜述。

1 Wnt信號通路

1.1 經(jīng)典Wnt信號通路及其激活 Wnt經(jīng)典途徑即依賴β-catenin的Wnt/β-catenin信號通路(圖1)，β-catenin是鈣黏蛋白復(fù)合物的核心成分，其穩(wěn)定性對于Wnt/β-catenin信號通路的激活至關(guān)重要[3-4]。Wnt信號通路經(jīng)典途徑包括配體、跨膜受體、胞漿調(diào)節(jié)蛋白、核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子及下游靶基因。Wnt 蛋白是一類富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，其異常激活還與衰老、腫瘤、炎性和器官纖維化等疾病密切相關(guān)[5-8]，而Wnt受體卷曲蛋白(Fzd)及其共同受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白(LRP)5/6同樣富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域，通過此區(qū)域二者可直接與 Wnt蛋白特異性結(jié)合，形成復(fù)合物Wnt-Fzd-LRP5/6，從而啟動經(jīng)典Wnt信號通路的激活[9-10]。在缺乏Wnt配體的情況下，β-catenin與支架蛋白(Axin)、腺瘤性結(jié)腸息肉病蛋白(APC)、糖原合成酶激酶3β(GSK-3β)以及酪蛋白激酶1α(CK1α)結(jié)合形成β-catenin蛋白降解復(fù)合物即“破壞復(fù)合體”，致使GSK-3β和CK1α將β-catenin磷酸化，并促進其降解。Wnt信號一旦被激活，便開始招募并激活蓬亂蛋白 (disheveled，Dsh/Dvl)，促進Axin、GSK-3β與LRP聯(lián)系，從而破壞“破壞復(fù)合體”的活性，β-catenin不能被降解并在胞質(zhì)中積累，隨后進入細胞核，取代T淋巴細胞因子/淋巴增強因子(TCF/LEF)家族的轉(zhuǎn)錄抑制因子Groucho蛋白與之結(jié)合，誘導(dǎo)Wnt下游靶基因的轉(zhuǎn)錄表達[3,11-12]，從而發(fā)揮多種生物學(xué)作用。因此，Wnt信號通路可概括為：Wnt激活→Wnt-Fzd-LRP5/6復(fù)合物形成→Dsh/Dvl活化→β-catenin蛋白降解復(fù)合體解散→β-catenin入核 →取代TCF/LEF→下游基因轉(zhuǎn)錄表達。

1.2 非經(jīng)典Wnt信號通路及其激活 包括3種非依賴β-catenin的信號通路，即Wnt/Ca2+通路、Wnt/PCP通路、調(diào)控紡錘體定向和非對稱細胞分裂的胞內(nèi)信號通路(SO-ACDic)[3-4,11-13]。以上3種信號通路雖均無β-catenin的參與，但需要Wnt蛋白與受體Fzd結(jié)合，然后信號被轉(zhuǎn)導(dǎo)至Dsh/Dvl，不使用LRP5/6作為其共同受體[12](圖1)。非經(jīng)典Wnt信號通路主要作用于細胞遷移和細胞極性[3]，其Wnt蛋白家族包括Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11等。此類通路的β-catenin在胞漿內(nèi)與APC-Axin-GSK-3β復(fù)合體結(jié)合并被磷酸化，磷酸化的β-catenin被β-轉(zhuǎn)導(dǎo)重復(fù)相容蛋白(β-Trcp)識別并泛素化，隨后被蛋白酶體降解。在哺乳動物中，Wnt/PCP通路是高度保守的信號傳導(dǎo)路徑，它參與了激活c-Jun N-末端激酶(JNK)和Ras同源基因家族成員A(RhoA)級聯(lián)，從而靶向控制細胞骨架重排的基因；Wnt/Ca2+途徑主要通過調(diào)節(jié)細胞內(nèi)Ca2+升高，隨后異三聚體G蛋白和磷脂酶C(PLC)及其蛋白激酶C(PKC)被Wnt-Fzd 復(fù)合物激活，然后激活下游靶基因的表達，從而控制細胞分化的結(jié)局，細胞的黏附和遷移[12]。目前，有關(guān)SO-ACDic信號通路的研究較少[14]。

圖1 Wnt信號通路的經(jīng)典途徑和非經(jīng)典途徑[3-4]

2 Wnt信號通路與肝纖維化

2.1 Wnt信號通路與肝星狀細胞(HSC)的活化 HSC在肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展中起著重要或關(guān)鍵性的作用[15-16]。在正常肝臟中，HSC以靜止?fàn)顟B(tài)存在于肝細胞與其周圍肝血竇內(nèi)皮細胞之間的Disse腔中，呈梭形或多邊形，因胞漿內(nèi)有多個富含維生素A的脂滴，故又稱Ito細胞或貯脂細胞，可參與肝竇血流的調(diào)節(jié)，并分泌多種膠原酶和基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)[16-17]；當(dāng)肝臟受到損傷和發(fā)生纖維化時，HSC激活并發(fā)生表型改變，轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞(MFB)，可表達α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)、波形蛋白、結(jié)蛋白等特征性蛋白，大量分泌主要來源于Ⅰ型和Ⅲ型膠原的細胞外基質(zhì)，在Disse腔的膠原化過程中起主要作用[15]。另一方面，在肝纖維化過程中，TGFβ、血小板源性生長因子(VEGF)、血管內(nèi)皮生長因子、結(jié)締組織生長因子、表皮生長因子、肝細胞生長因子等細胞因子共同激活HSC增殖、遷移和分泌的信號通路[15-16]，包括TGFβ、Wnt、Hedgehog、NF-κB、Notch、ROCK、MAPK、PI3K等大量通路，以及新發(fā)現(xiàn)的NLRP3、Ferroptosis 等信號通路[18-20]。

Wnt信號通路與HSC的活化關(guān)系密切，可通過以下幾種主要途徑實現(xiàn)調(diào)控。(1)細胞命運決定和形態(tài)發(fā)生因子：研究[21-23]顯示，過氧化物酶體增殖物激活受體(PPAR)γ為脂肪細胞和HSC的分化所必需，可促進脂肪在HSC內(nèi)的儲存，Wnt/β-catenin與PPARγ、Smads、Shh、NF-κB、Necdin、Notch、DLK1等多種形態(tài)發(fā)生素相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子相互作用，在HSC轉(zhuǎn)分化為MFB的過程中被激活。(2)Wnt信號相關(guān)蛋白酶：近期研究[24]表明，CCl4誘導(dǎo)肝纖維化小鼠的原代HSC中和TGFβ1刺激的LX-2細胞中Polo樣激酶1(PLK1)的表達均有升高，敲除PLK1則可抑制細胞內(nèi)α-SMA和Col1α1的表達，降低HSC的活化，促進HSC凋亡，而Wnt/β-catenin信號通路可能為PLK1介導(dǎo)的HSC活化所必需。Du等[25]實驗發(fā)現(xiàn)，采用血紅素加氧酶-1(HO-1)誘導(dǎo)HSC-T6，能夠下調(diào)經(jīng)典Wnt途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子 Wnt1和非經(jīng)典Wnt途徑的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子Wnt5a；而采用氯化血紅素誘導(dǎo)則可抑制Wnt途徑中β-catenin和激活T淋巴細胞核因子5的下游因子，表面HO-1通過抑制HSC的生長和促進其凋亡在肝纖維化中發(fā)揮保護作用。(3)微小核糖核酸(miRNA)：miR-708可通過Wnt/β-catenin信號通路直接靶向跨膜蛋白TMEM88，通過調(diào)節(jié)Wnt3a、Wnt2b、Wnt3α的表達及Dvl-1的PDZ結(jié)構(gòu)域，促進HSC的活化和細胞外基質(zhì)的積累[26]。但另有研究[27]發(fā)現(xiàn)，miR-708在纖維化肝組織和活化的HSC中表達受到抑制，伴隨著ZEB1水平的增加，而其過表達和ZEB1的沉默抑制了LX-2細胞的活化與增殖。miR-16可同步靶向整合TGFβ信號通路的Smad2和Wnt信號通路的Wnt3a 等，從轉(zhuǎn)錄組水平誘導(dǎo)HSC向MFB表型轉(zhuǎn)化的逆轉(zhuǎn)，導(dǎo)致肝纖維化的消退[28]。日本血吸蟲卵源性外泌體Sja-miR-1可顯著增加原代小鼠HSC和LX-2細胞內(nèi)α-SMA、Col1-α1及Col3-α1 mRNA的表達，促進了HSC的活化[29]，而Sja-miR-71a可通過直接靶向 Sema4D來抑制TGFβ1/SMAD和IL-13/STAT6信號途徑，以及通過調(diào)節(jié)Th1/Th2/Th17和Treg 的平衡來抑制肝纖維化[30]。(4)其他信號相關(guān)蛋白：特異性頂部盤狀底板反應(yīng)蛋白(R-spondin protein，RSPO)為Wnt/β-catenin信號激活因子，研究[31]發(fā)現(xiàn)，RSPO3在多器官纖維化的發(fā)展中起著關(guān)鍵作用，即抗RSPO3抗體OMP-131R10在治療性給藥時，可減輕肝纖維化、肺纖維化和皮膚纖維化，并認為RSPO3在Kupffer細胞和肝細胞中誘導(dǎo)多種促纖維化的趨化因子和細胞因子。Yes 相關(guān)蛋白(YAP)是Hippo信號通路中的主要下游蛋白，在CCl4誘導(dǎo)小鼠肝纖維化組織和經(jīng)TGFβ1處理的HSC-T6細胞中均表達升高，而YAP的缺失可減弱HSC-T6細胞內(nèi)Wnt/β-catenin信號途徑的活性[32]。Dickkopf-1(DKK-1)是一種分泌性蛋白，可與Wnt受體LRP5/6及穿膜蛋白Kremen1/2結(jié)合形成三聚體，阻斷Wnt/β-catenin信號向胞內(nèi)的傳遞，在慢性HCV相關(guān)肝硬化患者中出現(xiàn)顯著升高[33]。β-連環(huán)蛋白2相關(guān)拮抗劑(Dact2)是一種Wnt信號相關(guān)腫瘤抑制因子，Dact2基因的敲除可增強腫瘤侵襲和遷移相關(guān)的MMP2、MMP9基因的表達，以及與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)的 Snail、VEGF和ZEB基因的表達，也與胰腺和肝臟的纖維化密切相關(guān)[34]。鋅指E-盒結(jié)合同源異型盒蛋白(ZEB)是鋅指家族的功能蛋白，ZEB1在包括肝纖維化和丙型肝炎在內(nèi)的多種肝臟疾病中異常表達[35]；ZEB2可通過Wnt/β-catenin信號通路促進肝纖維化的發(fā)生發(fā)展[27]。

2.2 Wnt信號通路參與肝Kupffer細胞的極化 巨噬細胞通常根據(jù)表型和功能分為經(jīng)典活化巨噬細胞(促炎型，M1-Mφ)和替代性活化巨噬細胞(抗炎型，M2-Mφ)，此外還有腫瘤相關(guān)巨噬細胞、CD68+、CD169+和TCR+巨噬細胞等；也可按其分布分為固定性巨噬細胞(如肝、脾、淋巴結(jié)的巨噬細胞等)和游走性巨噬細胞(如肺、表皮和腹腔的巨噬細胞等)。M1、M2型屬單核細胞活化后一系列功能狀態(tài)的兩個極端，其分化受各種微環(huán)境信號的誘導(dǎo)與調(diào)節(jié)。正常肝臟內(nèi)主要為固有巨噬細胞即Kupffer細胞，在肝損傷中則由外周血單核細胞衍生的浸潤巨噬細胞和Kupffer細胞兩部分組成[36]。

Wnt信號通路與纖維化器官中巨噬細胞的極化關(guān)系密切。早期研究[37]發(fā)現(xiàn)，小鼠肝內(nèi)有14個Wnt、7 個Fzd基因在正常和活化的HSC及Kupffer細胞中表達。當(dāng)前已有許多研究證明Wnt信號可介導(dǎo)巨噬細胞參與多器官的纖維化形成。Wnt5a通過刺激Yap/Taz介導(dǎo)的M2-Mφ極化來促進腎纖維化[38]。Wnt7a可與肺間充質(zhì)干細胞(LR-MSC )的Fzd1結(jié)合，通過在脂多糖或IL-4誘導(dǎo)極化的M2-Mφ中表達增多，促使LR-MSC向MFB的分化和博來霉素誘導(dǎo)的肺纖維化形成[39]。雖然通過巨噬細胞極化激活Wnt信號以促進肝纖維化的作用機制研究較少，但經(jīng)Wnt配體如Wnt2b、Wnt3a、Wnt3、Wnt 4、Wnt 10b和Wnt 11等活化的Kupffer細胞、腫瘤相關(guān)巨噬細胞和Hepa1-6細胞在肝細胞癌的發(fā)生、發(fā)展和遷移中卻發(fā)揮著重要的作用[40-42]。關(guān)于Wnt信號介導(dǎo)肝巨噬細胞或Kupffer細胞調(diào)控肝纖維化的研究已不斷深入開展。Corbett等[43]研究發(fā)現(xiàn)，Wnt5a在活化的HSC中表達，可通過非經(jīng)典途徑的Dvl2和pJNK磷酸化，刺激HSC或Kupffer細胞，分別調(diào)節(jié)HSC的凋亡和TGFβ1、單核細胞趨化蛋白1的表達，并提出活化的HSC可通過非經(jīng)典途徑Wnt信號啟動自分泌和旁分泌作用，參與肝纖維化的形成。Akcora等[44]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典途徑的Wnt配體Wnt1、Wnt3a和Wnt10b，Wnt受體Fzd1、Fzd2及其共受體LRP6在CCl4誘導(dǎo)肝纖維化大鼠和 TGFβ誘導(dǎo)的3T3成纖維細胞中均顯著上調(diào)，趨化因子CXCL12可通過經(jīng)典的Wnt/β-catenin途徑促進HSC活化，刺激巨噬細胞向肝臟募集，增強肝內(nèi)炎癥、血管生成和纖維化，而Wnt/β-catenin/TCF介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄抑制劑 ICG-001則可減輕這些反應(yīng)。

2.3 Wnt信號通路與肝祖細胞(hepatic progenitor cell，HPC)的活化 HPC為肝內(nèi)一類具有干細胞功能特點的未分化細胞，又稱卵圓細胞，可分化為肝細胞或膽管上皮細胞[45-46]。近幾十年的證據(jù)顯示，在脂肪肝原位肝移植后和膽汁淤積的膽總管結(jié)扎模型中，HPC發(fā)生間質(zhì)轉(zhuǎn)化并導(dǎo)致肝纖維化，并有HSC、巨噬細胞、肝竇內(nèi)皮細胞等膽管周圍細胞集群的參與，尤其是在慢性肝損傷后的晚期肝纖維化或肝硬化中有助于肝再生，生成新的肝實質(zhì)細胞[46]。在慢性肝病中，調(diào)節(jié)HPC的因素在很大程度上仍然未知，但最近有報道[47]顯示，Wnt、Notch、YAP35和Hedgehog信號均參與調(diào)控HPC。

Boulter等[48]研究發(fā)現(xiàn)，在人類病變肝臟和膽管炎小鼠模型中，MFB通過Notch配體Jagged1的表達啟動HPC內(nèi)的Notch信號，促使HPC向膽管細胞的分化；而巨噬細胞通過誘導(dǎo)Wnt3a的表達啟動HPC內(nèi)的經(jīng)典Wnt信號，從而維持HPC內(nèi)命運決定因子Numb的表達，并促進HPC向肝細胞分化這一特性。Carpino等[49]研究發(fā)現(xiàn)，在兒童非酒精性脂肪性肝病中，M1-Mφ的極化與非酒精性脂肪性肝病的活動評分、膽管反應(yīng)和門靜脈纖維化密切相關(guān)，并伴隨著巨噬細胞內(nèi)Wnt3a的表達，關(guān)系到HPC內(nèi)的β-catenin磷酸化及其對肝細胞命運的應(yīng)答，表明巨噬細胞的極化可通過Wnt3a產(chǎn)生驅(qū)動HPC的應(yīng)答，對兒童非酒精性脂肪性肝病的進展發(fā)揮關(guān)鍵性作用。

研究[50]顯示，在乙硫氨酸誘導(dǎo)的小鼠肝損傷中，通過下調(diào)Atg5基因的表達以抑制自噬，可阻礙HPC的分化和抑制Wnt/β-catenin信號通路的激活，并發(fā)現(xiàn)在人的肝纖維化組織中，自噬可通過調(diào)節(jié)體內(nèi)Wnt/β-catenin信號來調(diào)節(jié)HPC的肝細胞分化。在向肝細胞分化的大鼠HPC細胞系WB-F344中，自噬可高度激活HPC并在分化為肝細胞的過程中逐漸減弱，同時出現(xiàn)Wnt3a信號下調(diào)而Wnt5a信號上調(diào)，表明自噬可通過Wnt信號通路調(diào)節(jié)HPC的肝細胞分化[51]。

3 小結(jié)

Wnt信號與肝纖維化的相關(guān)性研究是抗肝纖維化治療不容忽視的一個問題。肝內(nèi)不同細胞通過分泌細胞因子或轉(zhuǎn)錄因子而發(fā)揮調(diào)控Wnt信號通路以及其他信號通路的作用，如TGFβ1、JAK/STAT、Hedgehog、NF-κB、Notch、Necdin、MAPK、BMP2等。圍繞Wnt信號如何參與細胞內(nèi)調(diào)節(jié)，研究者們從HSC或Kupffer細胞或HPC方面做了詳細的分析。除以上角度外，筆者認為Wnt信號還可能與細胞自噬、細胞形態(tài)發(fā)生與分化、上皮細胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化、腸道微環(huán)境等存在密切的聯(lián)系。雖然眾多學(xué)者對于Wnt信號調(diào)控肝纖維化發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)歸的具體機制進行了多方面的研究，但在這些研究中尚存在部分欠缺與不足。未來進一步深入研究Wnt信號與肝纖維化的關(guān)系，將對探索可控制甚至可逆轉(zhuǎn)肝纖維化的發(fā)生發(fā)展具有重要臨床意義。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻聲明：范欽、李紅俊、李曉霞、楊尹負責(zé)查找文獻，資料分析，撰寫論文；成家茂、陳海燕負責(zé)擬定寫作框架，指導(dǎo)思路并修改稿件和最后定稿。