徐永霞，呂亞楠，曲詩瑤，趙洪雷，李學(xué)鵬，勵建榮

(渤海大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，實(shí)驗(yàn)中心，生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013)

阿拉斯加鱈魚(Alaska Pollock)，又名“狹鱈”，屬硬骨魚綱、鱈科，是北方沿海捕撈量最大的海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一。狹鱈的不同部位均具有較高的營養(yǎng)價值，肌肉中所含必需氨基酸占總氨基酸含量的38.98%，呈味氨基酸占58.43%，氨基酸評分接近牛奶，是優(yōu)質(zhì)的蛋白質(zhì)源。鱈魚骨和魚皮中富有膠原蛋白肽，具有抗氧化活性，對多種自由基有清除效果[1]。鱈魚肉甘味美，常被用作煲湯的原料，其中鱈魚豆腐湯、番茄鱈魚濃湯等深受人們的喜愛。

魚湯的熬制是一個復(fù)雜的變化過程，熬制過程中肌肉中的蛋白質(zhì)、脂肪、糖類等物質(zhì)逐漸溶出或水解，從而賦予了湯汁良好的營養(yǎng)和風(fēng)味，同時風(fēng)味化合物與蛋白質(zhì)的吸附作用也會影響其風(fēng)味感知[2]。此外，熬制魚湯的原料、輔料及加工工藝等直接影響湯品的風(fēng)味品質(zhì)和最終口感。食用菌中含有豐富的風(fēng)味前體物質(zhì)，一般具有提鮮增香作用，其中蟹味菇是一種具有很高營養(yǎng)價值的食用菌，其子實(shí)體中含有的真菌多糖還具有抗氧化、抗腫瘤等功效[3]。蟹味菇中富含多種氨基酸和鮮味肽，其中亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸等必需氨基酸的含量均高于其他菌菇[4]。在魚湯熬制過程中加入適量菌菇，不但可以豐富湯中營養(yǎng)物質(zhì)的種類，而且使湯的滋味輪廓更加飽滿，具有一定的協(xié)同增鮮作用[5]。

傳統(tǒng)魚湯通常采用高溫長時的熬制方式，該方式下原料中的蛋白質(zhì)、糖類等物質(zhì)降解不夠充分，而對傳統(tǒng)工藝制得的魚湯進(jìn)行生物酶解處理，可充分促進(jìn)魚肉中小分子呈味物質(zhì)的溶出和水解，從而增強(qiáng)肉湯的風(fēng)味和營養(yǎng)品質(zhì)。目前，生物酶解技術(shù)已被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)調(diào)味品的生產(chǎn)加工中。陳周等[6]采用風(fēng)味蛋白酶對鰱魚骨湯進(jìn)行處理，得到的骨湯中游離氨基酸含量明顯增加。姜紹通等[7]選擇中性蛋白酶對魚骨進(jìn)行酶解，發(fā)現(xiàn)酶解后骨湯中腥味明顯減小，風(fēng)味得到較大改善。本研究以鱈魚和蟹味菇為原料熬制菌菇鱈魚湯，采用分段酶解法對制得的菌菇鱈魚湯進(jìn)行酶解處理，以感官評分、氨基酸態(tài)氮含量、水解度為評價指標(biāo)，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，通過正交試驗(yàn)優(yōu)化菌菇鱈魚湯的酶解工藝，旨在為湯類調(diào)料的開發(fā)提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱈魚：購于錦州市林西街水產(chǎn)市場，平均尾重500 g；蟹味菇：購于錦州市大潤發(fā)超市。

纖維素酶、復(fù)合蛋白酶、風(fēng)味蛋白酶：均為食品級，購于廣西南寧龐博有限公司；甲醛、氫氧化鈉等：均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Kjeltec 8400型全自動定氮儀 瑞典Foss公司；Biofuge Stratos臺式冷凍高速離心機(jī) 美國Thermo Fisher公司；HH-420恒溫水浴鍋 上海力辰邦西儀器科技有限公司；PHS-3E pH計 深圳市優(yōu)米儀器設(shè)備有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 酶組合的確定

取適量的菌菇鱈魚湯樣品，按照表1中的酶組合進(jìn)行分段酶解。一段酶解在所用酶的最適溫度下酶解2 h，然后沸水浴10 min滅酶。冷卻至室溫后進(jìn)行二段酶解，酶解2 h后再次滅酶，然后于10000 r/min下冷凍離心10 min，取上清液備用。以未經(jīng)酶解處理的魚湯(YT)為對照組。

表1 分段酶解的酶組合Table 1 The enzyme combinations for segmented enzymatic hydrolysis

1.3.2 感官評價

參考韓輝等[8]的方法，挑選8名(4男4女)經(jīng)感官培訓(xùn)后的食品專業(yè)學(xué)生，對魚湯和酶解液的氣味、鮮味和苦味進(jìn)行感官評定，最終得分取平均值，評分項(xiàng)目和標(biāo)準(zhǔn)見表2。

表2 酶解液的感官評價標(biāo)準(zhǔn)Table 2 The sensory evaluation criteria of enzymatic hydrolysate

1.3.3 氨基酸態(tài)氮含量和水解度的測定

采用甲醛滴定法[9]測定酶解液中的氨基酸態(tài)氮(amino acid nitrogen, AAN)含量。

采用TNBS法[10]測定蛋白質(zhì)水解度(degree of hydrolysis, DH)。

1.3.4 一段酶解優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.4.1 單因素試驗(yàn)

以酶解液的感官評分、AAN值為分析指標(biāo)，研究不同酶解時間、酶解溫度、酶添加量對其的影響，確定最佳因素水平。

1.3.4.2 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，AAN值為評價指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，見表3。

表3 一段酶解正交試驗(yàn)因素水平表Table 3 The factors and levels of orthogonal experiment for the first-stage enzymatic hydrolysis

1.3.5 二段酶解優(yōu)化試驗(yàn)

1.3.5.1 單因素試驗(yàn)

以酶解液的感官評分、AAN值為分析指標(biāo)，研究不同酶解時間、酶解溫度、酶添加量對其的影響，確定最佳因素水平。

1.3.5.2 正交試驗(yàn)

以單因素試驗(yàn)為基礎(chǔ)，AAN值為評價指標(biāo)，采用L9(34)正交表進(jìn)行正交試驗(yàn)，見表4。

表4 二段酶解正交試驗(yàn)因素水平表

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 9.0及Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理、作圖，采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行顯著性分析，分析方法為鄧肯多重范圍檢驗(yàn)，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 酶組合的篩選

2.1.1 感官評定

不同酶組合對酶解液感官評分的影響見表5。

表5 不同組合酶解液感官評分表

從感官總評分來看，添加纖維素酶的XF1、XF2、XH 3組的總評分高于對照組YT，且XF1、XF2優(yōu)勢較明顯，這是因?yàn)槔w維素酶可以作用于食用菌的細(xì)胞壁，從而促進(jìn)植物細(xì)胞內(nèi)容物的溶出。鮮味作為感官評價的最主要指標(biāo)，在與其他味感呈味物質(zhì)的相互作用下，會使魚湯的味道更加鮮美[11]，表5中YT的鮮味值最低，XF2在與XF1總分相當(dāng)?shù)那闆r下，鮮味值較高，苦味值低。F1F2組的苦味值最低，這是因?yàn)橐欢蚊附庵兴玫娘L(fēng)味蛋白酶包括了內(nèi)、外切蛋白酶，可以切除肽鏈末端的疏水性氨基酸，降低酶解液中的苦味。綜上，說明酶處理后的魚湯酶解液的鮮味均得到顯著提升，且XF2的各項(xiàng)感官接受度良好。

2.1.2 氨基酸態(tài)氮和水解度分析

不同酶組合對酶解液AAN和DH的影響見圖1。

圖1 不同酶組合對酶解液氨基酸態(tài)氮含量和水解度的影響Fig.1 Effect of different enzyme combinations on AAN content and DH of enzymatic hydrolysate

由圖1可知，F(xiàn)1F2組的AAN值最高，達(dá)到了2.78 mg/mL，且水解效果最好。同樣添加復(fù)合蛋白酶的XF2組次之，AAN為2.49 mg/mL，DH值與XH差異不大，與其他組差異顯著，這是因?yàn)閺?fù)合蛋白酶是專為水解蛋白而研制的桿菌蛋白酶體，由多種蛋白酶復(fù)合而成，切割位點(diǎn)較多。雖然F1F2酶解液的水解度最大，但其苦味較重，感官評分低，綜合來看，XF2酶解液的品質(zhì)較好，因此選用纖維素酶和復(fù)合蛋白酶進(jìn)行分段酶解。

2.2 一段酶解工藝優(yōu)化

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

一段酶解中，不同酶解時間、酶解溫度和酶添加量對酶解液的感官評分和AAN的影響見圖2～圖4。

圖2 一段酶解中酶解時間對感官評分和氨基酸態(tài)氮的影響Fig.2 Effect of enzymatic time on sensory score and AAN content during first-stage enzymatic hydrolysis

由圖2可知，酶解液的AAN值隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)遞增趨勢，在酶解3 h后趨于平緩，這是因?yàn)殡S著時間的推移，體系中底物濃度逐漸降低，降解速率減慢，從而導(dǎo)致AAN含量增長緩慢[12]。酶解液的感官評分隨著酶解時間的延長呈現(xiàn)先升后降的趨勢，在2 h時達(dá)到最高分，此時酶解液的鮮香味濃郁且苦味較低。綜合考慮，選取一段酶解的最優(yōu)時間為2 h。

由圖3可知，在30～50 ℃區(qū)間內(nèi)，酶解液的AAN值持續(xù)上升，反映出升高溫度可促進(jìn)分子運(yùn)動，增加酶與底物的接觸概率，對反應(yīng)起促進(jìn)作用，當(dāng)溫度超過50 ℃時，酶的活性受到抑制，降解效率降低。綜合感官評分，50 ℃下酶解液的風(fēng)味和水解效果均優(yōu)，可作為一段酶解溫度進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

圖4 一段酶解中酶添加量對感官評分和氨基酸態(tài)氮的影響Fig.4 Effect of enzyme additive amount on sensory score and AAN content during first-stage enzymatic hydrolysis

由圖4可知，隨著酶添加量的增加，感官評分呈先上升后下降的趨勢，當(dāng)酶添加量為0.15%時達(dá)到最大值；AAN值隨著酶添加量的增加呈緩慢上升趨勢，說明酶添加量對AAN的影響不顯著。綜合感官評分和AAN值，選擇一段酶解的酶添加量為0.15%，此時可以得到風(fēng)味良好的酶解液。

2.2.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

一段酶解的正交試驗(yàn)結(jié)果見表6。

表6 一段酶解正交試驗(yàn)結(jié)果Table 6 The results of orthogonal experiment of first-stage enzymatic hydrolysis

由表6中極差分析可知，影響一段酶解液AAN含量的各因素的主次順序?yàn)镃>A>B，即酶添加量>酶解時間>酶解溫度。最優(yōu)組合為A2B3C3，即酶解時間2 h、酶解溫度60 ℃、酶添加量0.20%。由于正交表中沒有該組合，所以在此工藝下進(jìn)行了3次驗(yàn)證試驗(yàn)，結(jié)果顯示AAN值和感官評分均呈現(xiàn)優(yōu)勢，說明正交試驗(yàn)結(jié)果符合實(shí)際。

2.3 二段酶解工藝優(yōu)化

2.3.1 單因素試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

二段酶解中，不同酶解時間、酶解溫度和酶添加量對酶解液感官評分和AAN的影響見圖5～圖7。

圖5 二段酶解中酶解時間對感官評分和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.5 Effect of enzymatic time on sensory score and AAN content during second-stage enzymatic hydrolysis

由圖5可知，隨著酶解時間的延長，感官評分先升高后降低，在酶解2 h時達(dá)最大值，當(dāng)酶解時間進(jìn)一步延長，酶解液中會產(chǎn)生一些苦味物質(zhì)，從而影響酶解液的風(fēng)味[13]。隨著酶解時間的延長，酶解液的AAN值呈不斷增長的趨勢，3 h后趨于平穩(wěn)，可能是因?yàn)殚L時間的過度酶解導(dǎo)致酶活力下降甚至失活。綜合感官評分和AAN兩項(xiàng)指標(biāo)，選取二段酶解最優(yōu)時間為3 h。

圖6 二段酶解中酶解溫度對感官評分和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.6 Effect of enzymatic temperature on sensory score and AAN content during second-stage enzymatic hydrolysis

由圖6可知，AAN值隨著溫度的升高呈現(xiàn)上升趨勢，說明提高酶解溫度對二段復(fù)合蛋白酶的水解效果起促進(jìn)作用[14]。隨著溫度升高，感官得分呈先增后減的趨勢，且在50 ℃處優(yōu)勢明顯，說明在50 ℃條件下得到的酶解液較其他溫度滋味更鮮美，氣味更濃郁。綜合考慮，選取50 ℃為二段酶解最適溫度。

圖7 二段酶解中酶添加量對感官評分和氨基酸態(tài)氮含量的影響Fig.7 Effect of enzyme additive amount on sensory score and AAN content during second-stage enzymatic hydrolysis

由圖7可知，AAN值隨著酶添加量的增加而顯著增長(P<0.05)，添加量至0.3%后增長幅度變緩，這是因?yàn)樵谄渌麠l件一定時，底物濃度與反應(yīng)速度的關(guān)系服從米氏方程，當(dāng)?shù)孜餄舛却笥诿笣舛葧r，反應(yīng)速度與酶添加量呈正相關(guān)趨勢，當(dāng)酶濃度達(dá)到飽和狀態(tài)時，反應(yīng)趨于穩(wěn)定[15]。同時，隨著酶添加量的增加，感官評價值呈現(xiàn)先升后降的趨勢，且在0.2%處得分最高。綜合考慮感官評分和AAN值，選取酶添加量為0.25%。

2.3.2 正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

由表7中極差分析可知，影響二段酶解液AAN含量的各因素的主次順序?yàn)锳>B>C，即酶解時間>酶解溫度>酶添加量。最優(yōu)組合為A2B2C2，即酶解時間3 h、酶解溫度50 ℃、酶添加量0.25%。由于正交表中沒有該組合，所以在此工藝下進(jìn)行3次驗(yàn)證性試驗(yàn)，結(jié)果顯示AAN值和感官評分均呈現(xiàn)優(yōu)勢，說明正交試驗(yàn)結(jié)果符合實(shí)際。

表7 二段酶解正交試驗(yàn)結(jié)果

續(xù) 表

2.4 菌菇鱈魚湯和酶解液的品質(zhì)分析

菌菇鱈魚湯與優(yōu)化工藝下制得的酶解液的感官評分和水解度變化見表8。

表8 菌菇鱈魚湯和酶解液的感官分析及水解度Table 8 The sensory analysis and DH of mushroom and cod soup and enzymatic hydrolysate

由表8可知，酶解液的感官總分為菌菇鱈魚湯的1.14倍，與未經(jīng)酶解的菌菇鱈魚湯相比，酶解液的鮮味值得到顯著提升(P<0.05)，鮮味評分是菌菇鱈魚湯的1.29倍，同時，苦味值也顯著降低(P<0.05)。說明經(jīng)過分段酶解處理，有效改善了菌菇鱈魚湯的風(fēng)味。且在此條件下，菌菇鱈魚湯的水解度可達(dá)27.67%，說明酶解促進(jìn)了原料中蛋白質(zhì)的降解，并提升了湯汁的風(fēng)味品質(zhì)。

3 結(jié)論

本研究采用分段酶解法處理菌菇鱈魚湯，通過對氨基酸態(tài)氮含量、水解度、感官評價等指標(biāo)的分析，篩選出兩段酶解的最適酶組合為纖維素酶與復(fù)合蛋白酶，該組合制得的酶解液具有良好的感官品質(zhì)與較高的水解度。正交試驗(yàn)結(jié)果表明，一段酶解最佳酶解條件為：酶解時間2 h、酶解溫度60 ℃、酶添加量0.2%；二段酶解最佳酶解條件為：酶解時間3 h、酶解溫度50 ℃、酶添加量0.25%。在此優(yōu)化工藝下酶解菌菇鱈魚湯，得到的酶解液鮮味值顯著提高，苦味值明顯降低，說明酶解處理可以有效促進(jìn)魚湯中呈味物質(zhì)的溶出，對菌菇魚湯風(fēng)味的改善及調(diào)味基料的開發(fā)具有重要意義。