錢小麗

(江蘇旅游職業(yè)學(xué)院 烹飪科技學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州 225127)

1 概述

發(fā)酵產(chǎn)品的品質(zhì)受眾多因素的影響，而其中接種量的多少、發(fā)酵溫度的高低、發(fā)酵時(shí)間的長短為影響其品質(zhì)的重要因素。

響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)法(response surface methodology，簡稱RSM),是在考慮各種因素水平的響應(yīng)值的情況下，尋找預(yù)測的相應(yīng)最優(yōu)值以及相對應(yīng)的實(shí)驗(yàn)條件，是一種尋找最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件的方法。通過設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、建立模型，以此檢驗(yàn)?zāi)Ｐ褪欠窈侠?，從而找到最佳組合條件，在對過程的回歸擬合、響應(yīng)曲面和等高線的分析中快速求出各因素水平相應(yīng)的響應(yīng)值[1]。

本實(shí)驗(yàn)以經(jīng)過物理脫毒法符合食用安全的河鲀?yōu)樵希ㄟ^控溫發(fā)酵技術(shù)發(fā)酵魚醬，以pH值、氨基酸態(tài)氮、總酸含量為指標(biāo)，在單因素實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，從影響河鲀發(fā)酵魚醬品質(zhì)的接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度3個(gè)維度出發(fā)，分別設(shè)3個(gè)不同的水平，通過響應(yīng)面法研究其發(fā)酵條件的優(yōu)化設(shè)置，以得出河鲀發(fā)酵魚醬的最佳發(fā)酵狀態(tài)。

2 材料與方法

2.1 實(shí)驗(yàn)材料

菌株：乳酸菌L003、葡萄球菌C07、酵母菌Y04。

原料：河鲀魚肉、香辛料、食用鹽、植物油。

2.2 培養(yǎng)基

MSA、MRS及YPD液體培養(yǎng)基。

2.3 所需設(shè)備及儀器

HP250HS型智能恒溫恒濕箱 上海精盛科學(xué)儀器有限公司；SW-CJ-1F型超凈工作臺 青島明博環(huán)?？萍加邢薰?；PHS-3C型數(shù)字酸度計(jì) 上海楚定分析儀器有限公司；HZ-2010K大型搖瓶柜 常州恒隆儀器有限公司；YXO.SGH280型高壓蒸汽滅菌鍋 上海醫(yī)用核子儀器廠；JIDI-16R臺式多用途高速冷凍離心機(jī) 美瑞克儀器有限公司。

2.4 實(shí)驗(yàn)方法

2.4.1 河鲀發(fā)酵魚醬的制備

在液體培養(yǎng)基中加入備選菌株，置于30 ℃的溫度下，經(jīng)12 h培養(yǎng)后，通過10 min的離心方式(4 ℃，4000 r/min)，去除上清液后，再加入無菌生理鹽水進(jìn)一步稀釋，并按要求添加。

基本配方：河鲀魚肉200 g、水100 g、食鹽16 g、植物油10 g、香辛料1 g。

處理過程：初步處理河鲀魚肉→絞碎→拌料接種→發(fā)酵→配制→蒸制→裝袋→成品。

2.4.2 不同添菌方法對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

接種量：107CFU/g。

發(fā)酵條件：30 ℃溫控，95%相對濕度，時(shí)間48 h。

表1 添菌方法對魚醬品質(zhì)影響的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 The experimental design for the effect of adding methods of strains on the quality of fish sauce

2.4.3 不同菌種配比對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

接種量：1.0×107CFU/g。

發(fā)酵條件：30 ℃溫控，95%相對濕度，時(shí)間48 h。

表2 菌種配比對魚醬品質(zhì)影響的實(shí)驗(yàn)安排Table 2 The experimental arrangement for the effect of ratios of strains on the quality of fish sauce

2.4.4 擬定菌種發(fā)酵參數(shù)

根據(jù)前期配比情況，設(shè)定參數(shù)，具體見表3。

表3 響應(yīng)面分析因素與水平設(shè)計(jì)Table 3 The design of factors and levels of response surface methodology

2.4.5 指標(biāo)測試

2.4.5.1 總酸含量的測定

將5.0 mL的樣品置于100 mL容量瓶中，加水到指定容量，混合均勻后，取出20.0 mL，置于200 mL的燒杯中，加入60 mL的水，同時(shí)打開磁力攪拌器，用0.05 N標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，當(dāng)酸度計(jì)顯示pH 8.2時(shí)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的毫升數(shù)。另外取80 mL的水進(jìn)行試劑空白實(shí)驗(yàn)。

式中：X為樣品中總酸的含量(以乳酸計(jì))，g/dL；V1為測定用樣品稀釋液所需標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積，mL；V2為試劑空白所需標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積，mL；V3為樣品稀釋液取用量，mL；C為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；0.09為1 mL 1 N NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于乳酸的克數(shù)。

2.4.5.2 氨基酸態(tài)氮含量的測定

采用甲醛滴定法： 將5.0 mL的樣品放入100 mL容量瓶中，加水到指定容量，混合均勻后吸取20.0 mL，將其置于200 mL的燒杯中，加入60 mL的水，同時(shí)打開磁力攪拌器，用0.05 N標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，當(dāng)酸度計(jì)顯示pH 8.2時(shí)，加入甲醛溶液10.0 mL，混合均勻。用0.05 N標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定，當(dāng)酸度計(jì)顯示pH 9.2時(shí)，記錄下標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的毫升數(shù)。另外開展試劑空白實(shí)驗(yàn)：在80 mL水中滴入0.05 N NaOH溶液，待pH值達(dá)到8.2時(shí)，再加入甲醛溶液10.0 mL，用0.05 N NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定到pH為9.2即可。

式中：X為樣品中氨基酸態(tài)氮的含量，g/dL；V1為測定用樣品稀釋液加入甲醛后所需標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積，mL；V2為試劑空白實(shí)驗(yàn)加入甲醛后所需標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液的體積，mL；V3為樣品稀釋液取用量，mL；N1為NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液的當(dāng)量濃度；0.014為1 mL 1 N NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于氮的克數(shù)。

2.4.5.3 pH值的測定

準(zhǔn)備10.00 g樣品，用90 mL蒸餾水稀釋，邊加入邊攪拌30 min后，使用PHS-3C型數(shù)顯酸度計(jì)測定其pH值。

2.4.6 數(shù)據(jù)處理

3次測定后得出平均數(shù)。借助SPSS 22.0和Excel 2017對測定結(jié)果進(jìn)行分析，經(jīng)過單因素方差(ANOVA)發(fā)現(xiàn)，P<0.05為顯著差異。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同添菌方式對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

由表4可知，與其他組對照，當(dāng)同時(shí)添加乳酸菌、葡萄球菌和酵母菌總酸達(dá)到0.106 g/dL時(shí)，氨基酸態(tài)氮為0.054 g/dL，此時(shí)效果最好。所以，河鲀發(fā)酵魚醬時(shí)選擇同時(shí)添菌的方式。

表4 不同添菌方式加工的魚醬品質(zhì)

3.2 不同菌種配比對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

由表5可知，相對于空白發(fā)酵，不同菌種配比的各處理組在pH、總酸、氨基酸態(tài)氮方面均有不同；從pH和總酸來看，11號的pH最低而總酸含量最高，其氨基酸態(tài)氮僅次于12號。

表5 不同菌種配比的魚醬性狀Table 5 The characteristics of fish sauce with different ratios of strains

綜上所述，11號(L∶C∶Y 為1∶4∶1)配比成效最優(yōu)。

4 菌種發(fā)酵參數(shù)的優(yōu)化

菌種發(fā)酵最佳工藝的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)情況見表6。

表6 菌種發(fā)酵最佳工藝的響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)情況

選用析因?qū)嶒?yàn)和中心實(shí)驗(yàn)，將析因點(diǎn)作為自變量，將零點(diǎn)作為區(qū)域中心點(diǎn)，取接種量X1、放置溫度X2和放置時(shí)間X3三項(xiàng)最高點(diǎn)，進(jìn)行5次實(shí)驗(yàn)，考量其間誤差,并借助SPSS 22.0對所獲結(jié)果進(jìn)行回歸分析，具體見表7～表9。

表7 河鲀發(fā)酵魚醬pH值回歸模型方差分析結(jié)果

續(xù) 表

由表7可知，基于河鲀發(fā)酵魚醬pH值形成的回歸模型尤其顯著(P<0.0001)，確定系數(shù)很好。從方差分析結(jié)果來看，X2項(xiàng)的P<0.05，說明發(fā)酵溫度影響河鲀發(fā)酵魚醬的pH凸顯。魚醬的pH值在X1、X2兩因素相互作用下變化大(P<0.01)，X2和X3彼此作用影響也極其顯著(P<0.01)。由此可見，此回歸模型可用于河鲀發(fā)酵魚醬pH響應(yīng)值的預(yù)測。

圖1 接種量和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬pH值作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

由圖1可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到48 h時(shí)，接種量增加，pH值迅速下降；發(fā)酵溫度上升，pH值的降低速度更快，二者的交互作用明顯。

圖2 接種量和發(fā)酵時(shí)間對河鲀發(fā)酵魚醬pH值作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.2 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation time on the pH value of fermented pufferfish sauce

由圖2可知，當(dāng)發(fā)酵溫度為30 ℃，接種量較低時(shí)，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，pH值出現(xiàn)降低；當(dāng)接種量增加時(shí)，pH值則出現(xiàn)下降。由此可見，pH值受接種量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用影響明顯。

由圖3可知，當(dāng)接種量為1.0×107CFU/g，發(fā)酵溫度較低時(shí)，pH值隨著發(fā)酵時(shí)間的增加呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢。河鲀發(fā)酵魚醬的pH值與二者的交互作用明顯。

圖3 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬pH值作用的響應(yīng)面圖和等高線圖

由以上三維響應(yīng)面圖和等高線圖可以看出，當(dāng)接種量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時(shí)間發(fā)生變化時(shí)，河鲀魚醬氨基酸態(tài)氮的響應(yīng)值顯現(xiàn)出先降后升的趨勢，其中間水平范圍內(nèi)的最低點(diǎn)則為河鲀魚醬的最佳pH值。

由表8可知，方差分析結(jié)果中，該模型對河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮所構(gòu)建的回歸模型顯著(P<0.01)。C.V.=21.81%，表明實(shí)驗(yàn)較為可靠。由此可見，河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮的響應(yīng)值預(yù)測可以使用該回歸模型。

表8 河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮回歸模型方差分析結(jié)果Table 8 The variance analysis of amino acid nitrogen regression model of fermented pufferfish sauce

由圖4可知，發(fā)酵時(shí)間為48 h，接種量不斷增多時(shí)，氨基酸態(tài)氮呈現(xiàn)先升后降的趨勢。當(dāng)發(fā)酵溫度較低時(shí)，氨基酸態(tài)氮隨著接種量的增多呈現(xiàn)不斷上升的趨勢，并出現(xiàn)了最高點(diǎn)。

圖4 接種量和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.4 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation temperature on the amino acid nitrogen of fermented pufferfish sauce

由圖5可知，將溫度控制在30 ℃時(shí)，隨著接種量增多，氨基酸態(tài)氮不斷減少。當(dāng)接種量較少時(shí)，發(fā)酵時(shí)間不斷延長，氨基酸態(tài)氮先上升到最高點(diǎn)后立即出現(xiàn)減少，接種量和發(fā)酵時(shí)間的交互作用顯著。

圖5 接種量和發(fā)酵時(shí)間對河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.5 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation time on the amino acid nitrogen of fermented pufferfish sauce

由圖6可知，在接種量為1.0×107CFU/g時(shí)，控制較低發(fā)酵溫度，氨基酸態(tài)氮隨著發(fā)酵時(shí)間的延長呈現(xiàn)增加趨勢，當(dāng)發(fā)酵溫度提升時(shí)，感官分值進(jìn)入峰值后開始減少。

圖6 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬氨基酸態(tài)氮作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Response surface and contour plots of the effects of fermentation time and fermentation temperature on the amino acid nitrogen of fermented pufferfish sauce

由表9可知，方差分析結(jié)果中，該模型對河鲀發(fā)酵魚醬總酸所建立的回歸模型顯著(P<0.05)?；貧w診斷表明，模型失擬性檢驗(yàn)不顯著(P=0.9686>0.05)，C.V.=27.51%，表明實(shí)驗(yàn)較為可靠。由此可見，此回歸模型能作為河鲀發(fā)酵魚醬總酸響應(yīng)值的模型進(jìn)行預(yù)測。

表9 河鲀發(fā)酵魚醬總酸回歸模型方差分析結(jié)果Table 9 The variance analysis of total acid regression model of fermented pufferfish sauce

由圖7可知，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間達(dá)到48 h且接種量增加時(shí)，河鲀發(fā)酵魚醬的總酸平穩(wěn)減少，呈現(xiàn)正相關(guān)。當(dāng)控制較低溫度，接種量提升時(shí)，總酸數(shù)量降低。當(dāng)發(fā)酵溫度維持在一定范圍時(shí)，總酸變化不明顯。

圖7 接種量和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬總酸作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.7 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation temperature on the total acid of fermented pufferfish sauce

由圖8可知，當(dāng)發(fā)酵溫度控制在30 ℃時(shí)，隨著接種量增多，總酸數(shù)量減少。當(dāng)接種量較少時(shí)，增加發(fā)酵時(shí)間，總酸數(shù)量減少，發(fā)酵時(shí)間對總酸的影響突出。

圖8 接種量和發(fā)酵時(shí)間對河鲀發(fā)酵魚醬總酸作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.8 Response surface and contour plots of the effects of inoculation amount and fermentation time on the total acid of fermented pufferfish sauce

由圖9可知，接種量為1.0×107CFU/g時(shí)，控制較低發(fā)酵溫度，延長發(fā)酵時(shí)間，會(huì)降低河鲀發(fā)酵魚醬的總酸；當(dāng)發(fā)酵溫度上升后，河鲀發(fā)酵魚醬的總酸下降速度呈現(xiàn)加快趨勢，河鲀發(fā)酵魚醬總酸受二者交互作用的影響明顯。

圖9 發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度對河鲀發(fā)酵魚醬總酸作用的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.9 Response surface and contour plots of the effects of fermentation time and fermentation temperature on the total acid of fermented pufferfish sauce

表10 河鲀發(fā)酵魚醬回歸方程參數(shù)估計(jì)Table 10 The estimation of regression equation parameters of fermented pufferfish sauce

借助Design Expert軟件對回歸模型優(yōu)化進(jìn)行規(guī)范性分析，根據(jù)回歸方程的三維響應(yīng)面圖和等高線圖可知，優(yōu)化河鲀發(fā)酵魚醬的工藝條件具備穩(wěn)定點(diǎn)：X1(-0.02)、X2(-0.04)、X3(-0.04)，對應(yīng)實(shí)際的工藝條件分別為：X1(1.0×107CFU/g)、X2(29.8 ℃)、X3(47.04 h)。

綜上所述，當(dāng)接種量為1.0×107CFU/g、發(fā)酵溫度為30 ℃、發(fā)酵時(shí)間為47 h時(shí)，pH值為5.18，氨基酸態(tài)氮為0.283 g/dL，總酸為0.167 g/dL，河鲀發(fā)酵魚醬的質(zhì)量最好，理論值與實(shí)際值之間契合度較高，優(yōu)化模型有效。

5 結(jié)果與討論

5.1 不同添菌方式對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

乳酸菌在香腸、酸肉等發(fā)酵肉制品中通過其快速產(chǎn)酸作用使產(chǎn)品的pH值降低，抑制腐敗菌的生長繁殖，確保產(chǎn)品的食用安全[2-3]。而隨著乳酸菌的發(fā)酵，pH值不斷降低，低pH值能促進(jìn)酵母菌的大量繁殖[4]。而周慧敏等分別添加乳酸菌和葡萄球菌及其混合菌種發(fā)酵臘肉，自然發(fā)酵、單一發(fā)酵劑發(fā)酵的臘肉的氨基酸態(tài)氮以及非蛋白態(tài)氮都比接種混合發(fā)酵劑的低[5]。本實(shí)驗(yàn)中對比空白發(fā)酵、單菌發(fā)酵及其他處理組的數(shù)據(jù)，乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌同時(shí)添加時(shí)數(shù)值更高。

5.2 不同菌種配比對河鲀發(fā)酵魚醬的影響

微生物生長過程中存在協(xié)同或者競爭等作用，復(fù)合發(fā)酵中菌種的不同組成比例能有效地使發(fā)酵劑發(fā)揮其產(chǎn)酶等特性，產(chǎn)品的品質(zhì)以及風(fēng)味的形成也會(huì)受到較大影響。譚汝成等接種復(fù)合乳酸菌發(fā)酵60 h的魚鲊的感官品質(zhì)最高，產(chǎn)生大量游離氨基酸，提高必需氨基酸含量和比例；而當(dāng)植物乳桿菌∶戊糖片球菌為1∶1時(shí)，魚鲊中的水溶性蛋白含量較低，這可能與兩種乳酸菌的競爭抑制有關(guān)[6]。而李先保等通過研究兔肉發(fā)酵香腸的菌種配比得出當(dāng)3種發(fā)酵劑以一定的比例組合時(shí)，香腸質(zhì)地柔軟，顏色瑰紅，酸味柔和，切片性好，有彈性，無兔肉腥味[7]。本文在菌種配比對比實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，各組的pH、總酸、氨基酸態(tài)氮方面有所不同；其中11號的pH最低，但總酸含量卻最高，其氨基酸態(tài)氮僅次于12號。綜合以上考慮，11號(L∶C∶Y 為1∶4∶1)復(fù)合比例效果最好，魚醬的pH、總酸、氨基酸態(tài)氮的水平最佳。

5.3 不同發(fā)酵條件對河鲀發(fā)酵魚醬品質(zhì)的影響

魚醬品質(zhì)與接種量、發(fā)酵時(shí)間、發(fā)酵溫度的關(guān)聯(lián)度較高。本實(shí)驗(yàn)選擇這3個(gè)因素作為研究對象，與王磊等以接種量、發(fā)酵溫度、菌種比例、發(fā)酵時(shí)間4個(gè)維度，將指標(biāo)設(shè)定為發(fā)酵魚肉香腸的pH和感官評分，通過復(fù)合正交實(shí)驗(yàn)尋求最適發(fā)酵條件相一致[8]。

接種量的多少影響產(chǎn)品的pH值。通常情況下，接種量增加，使所添加的發(fā)酵劑成為優(yōu)勢菌，加快對制品蛋白質(zhì)和脂肪等物質(zhì)的分解作用，使制品的pH值發(fā)生變化。康慎敏等研究接種量對發(fā)酵魚塊pH值的影響，隨著發(fā)酵劑添加量的加大，發(fā)酵液的pH值下降速度加快[9]。但接種量并不是越大越好，李璘佼等研究發(fā)現(xiàn)隨著接種量增加，當(dāng)接種量達(dá)到10%時(shí)蛋白酶活力最高，但繼續(xù)增加接種量，蛋白酶活力降低[10]。而楊士章等采用響應(yīng)面法優(yōu)化發(fā)酵鴨的工藝發(fā)現(xiàn)，隨著接種量的增加，復(fù)合發(fā)酵劑的產(chǎn)酸能力也不斷增加，而氨基酸態(tài)氮的含量因接種量增多而呈現(xiàn)先升后降的趨勢，同時(shí)說明微球菌和酵母菌的生長因pH 值的下降而變得遲緩，進(jìn)而減弱了其分解鴨胚蛋白質(zhì)和脂肪的能力[11]，本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果與其相一致。

發(fā)酵溫度影響產(chǎn)品的品質(zhì)。發(fā)酵溫度較低的發(fā)酵過程中乳酸菌等微生物生長更加旺盛。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果與孟鴛等[12]研究發(fā)酵溫度對甜面醬揮發(fā)性成分的形成及品質(zhì)的影響是一致的。

發(fā)酵時(shí)間影響產(chǎn)品的品質(zhì)。葉勁松等研究發(fā)酵時(shí)間對發(fā)酵豬耳西式火腿品質(zhì)的影響發(fā)現(xiàn)發(fā)酵時(shí)間對產(chǎn)品的感官品質(zhì)、pH值、火腿出品率都有影響[13]。而在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)酵劑對魚醬制品中蛋白質(zhì)等物質(zhì)的分解程度和魚醬的總酸和氨基酸態(tài)氮含量受發(fā)酵時(shí)間的影響是相一致的。

6 結(jié)論

綜合河鲀發(fā)酵魚醬總酸和氨基酸態(tài)氮因添菌方法不同而有所區(qū)別，當(dāng)乳酸菌、葡萄球菌、酵母菌同時(shí)添加時(shí)，其總酸和氨基酸態(tài)氮優(yōu)于其他處理組，所以選擇同時(shí)添菌的方式來發(fā)酵河鲀魚醬。相對于空白發(fā)酵來說，不同的菌種配比在pH值、總酸、氨基酸態(tài)氮方面均有不同；從pH值和總酸角度來看，11號的pH值最低，總酸含量最高，其氨基酸態(tài)氮僅次于12號。所以多方面考慮，11號(L∶C∶Y 為1∶4∶1)復(fù)合比例效果最好。

采用響應(yīng)面法設(shè)計(jì)分析進(jìn)行河鲀發(fā)酵魚醬實(shí)驗(yàn)，當(dāng)接種量1.0×107CFU/g、發(fā)酵溫度30 ℃、發(fā)酵時(shí)間47 h時(shí)，可以賦予河鲀魚醬良好風(fēng)味，此時(shí)腥味與其他實(shí)驗(yàn)相比最低，呈鮮效果最佳，發(fā)酵品質(zhì)最好。