張臘臘，胡浩斌，韓明虎，楊會玲

(隴東學(xué)院 化學(xué)化工學(xué)院，甘肅 慶陽 745000)

黃花菜(HemerocalliscitrinaBaroni)是百合科萱草屬草本植物的花[1-2]，屬于典型的藥食同源食療食品。黃花菜含有豐富的營養(yǎng)[3]及藥用價值[4-5]，研究表明黃花菜具有消腫、止血、抗菌、抗抑郁等功效，黃花菜中的黃酮是其抗抑郁的主要活性成分[6]，而且黃酮還是食品、調(diào)味品的生產(chǎn)原料[7-8]，所以從黃花菜中提取黃酮一直是研究熱點。黃花菜中黃酮提取的傳統(tǒng)方法有乙醇浸提法、超聲輔助提取法、乙醇回流法、微波提取法等[9-10]。

傳統(tǒng)提取方法普遍存在溶劑用量大、提取時間長、提取效率較低的問題。離子液體作為一種綠色環(huán)保型溶劑，因為其自身的特點在提取天然產(chǎn)物中的活性物質(zhì)方面已經(jīng)有很廣泛的應(yīng)用[11-13]。在黃酮類化合物提取中已經(jīng)有離子液體在紅花[14]、銀杏[15]、葛根[16]、香葉總黃酮[17]等提取中的報道。采用離子液體從黃花菜中提取黃花菜黃酮尚未見文獻報道。研究擬采用離子液體作為提取溶劑提取黃花菜中總黃酮，用響應(yīng)面法對工藝條件進行優(yōu)化，以期解決傳統(tǒng)方法中有機溶劑用量過大及提取效率過低的問題，為黃花菜高附加值的生產(chǎn)提供有力的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃花菜：摘自甘肅慶陽慶城縣；亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉(均為分析純)：購自天津市北聯(lián)精細化學(xué)品開發(fā)有限公司；無水乙醇：天津市富宇精細化工有限公司；蘆丁標準品、離子液體[C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl(均為分析純)：上海源葉生物科技有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

7230G型分光光度計 上海精密科學(xué)有限責(zé)任公司；SHB-3A型循環(huán)水式多用真空泵 鄭州杜甫儀器廠；SB-5200DT型超聲波清洗機 寧波新芝科技有限責(zé)任公司；YP20002型電子天平 上海橫際科學(xué)儀器有限公司；FZ102型微型植物試樣粉碎機 北京中興偉業(yè)儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 標準曲線的繪制

精確稱取蘆丁對照品10 mg，加入75%乙醇使其完全溶解，定容至100 mL容量瓶中，得到濃度為0.1 mg/mL的蘆丁標準溶液。用移液管分別吸取蘆丁標準溶液0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 mL于5支25 mL容量瓶中，加入1 mL的5%亞硝酸鈉溶液，立即搖勻，靜置6 min；加入1 mL的10%硝酸鋁溶液，搖勻；6 min后加入10 mL的4%氫氧化鈉溶液，搖勻，再放置等待6 min；最后用75%的乙醇溶液定容至25 mL，搖勻放置20 min。以不加蘆丁標準溶液為空白組，使用分光光度計在波長為510 nm處測定不同濃度下的吸光度，以濃度為橫坐標、吸光度為縱坐標繪制標準曲線[18]，進行線性回歸所得回歸方程為Y=1.0086X-0.0024(R2=0.9996)，說明黃花菜總黃酮含量與吸光度值在0～0.3 g/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.3.2 黃酮的提取及提取率的計算

黃花菜蒸熟曬干后用植物粉碎機粉碎待用。按照試驗所需料液比加入不同體積、不同濃度的離子液體水溶液，在試驗溫度下超聲提取一定時間后過濾，所得濾液中上清液作為黃花菜總黃酮提取液。吸取總黃酮提取液2.5 mL置于25 mL容量瓶中，按1.3.1標準曲線制作方法測定其在510 nm波長處的吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算提取液中黃酮濃度C，并由下式計算出總黃酮得率:

式中：w為樣品液中黃酮的濃度(mg/mL)；C為樣品吸光度；V0為取樣體積(mL)；V1為稀釋體積(mL)；V2為樣品溶液體積(mL)；m為樣品質(zhì)量(g)。

1.3.3 單因素試驗設(shè)計

黃花菜烘干粉碎過70目篩，分別稱取1.0 g黃花菜粉末平行5組，考察離子液體種類([C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br、[C4mim]Cl、[C6mim]Cl、[C8mim]Cl)、離子液體濃度(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mol/L)、料液比(1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30，g/mL)、提取溫度(40，50，60，70，80 ℃)、提取時間(15，30，45，60，75 min)對總黃酮得率的影響。

1.3.4 響應(yīng)面試驗設(shè)計

采用Design-Expert 8.0.6 根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計試驗原理，以離子液體濃度(A)、料液比(B)、提取時間(C)、提取溫度(D)為因素，以黃花菜總黃酮提取率為響應(yīng)值，進行響應(yīng)面分析試驗，確定最佳提取工藝。

表1 響應(yīng)面因素水平表

2 結(jié)果與討論

2.1 離子液體種類的選擇

由圖1可知，隨著碳鏈長度的增加，黃花菜總黃酮得率增大，但是溴鹽要比氯鹽得率高，這是因為Br-能與黃酮之間形成較強π-π相互作用和氫鍵相互作用，有利于黃酮的提?。惶荚訑?shù)超過6以后，溴鹽和氯鹽黃酮的產(chǎn)率均開始下降，因為隨著碳原子數(shù)的增多，導(dǎo)致空間位阻增大，增加了總黃酮的溶出阻力，因此確定[C6mim]Br作為提取溶劑。

圖1 離子液體種類影響結(jié)果Fig.1 The effect of types of ionic liquids on the extraction rate of total flavonoids

2.2 單因素試驗結(jié)果與分析

2.2.1 離子液體濃度對總黃酮提取的影響

由圖2可知，黃花菜總黃酮提取率隨著[C6mim]Br濃度的升加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，這是因為離子液體濃度升高，其黏度會隨之增大，提取溶劑的黏度太大會阻礙總黃酮的溶出，而且溶劑滲透進黃花菜的能力也會下降，所以確定[C6mim]的濃度為0.8 mol/L。

圖2 離子液體濃度影響結(jié)果Fig.2 The effect of content of ionic liquid on the extraction rate of total flavonoids

2.2.2 料液比對總黃酮提取的影響

由圖3可知，在料液比為1∶15之前，隨著料液比的增大，黃花菜總黃酮提取率增大，料液比在1∶15時達到最大，隨后開始降低。因為料液比較低時，溶劑量較少，總黃酮和提取溶劑濃度差較大，增大了總黃酮溶出的勢差，利于黃酮的提取，隨著料液比的繼續(xù)增加，溶劑的滲透壓增大，會導(dǎo)致其他雜質(zhì)溶出，黃酮的提取率下降，所以選擇料液比為1∶15(g/mL)。

圖3 料液比影響結(jié)果Fig.3 The effect of solid-liquid ratio on the extraction rate of total flavonoids

2.2.3 提取溫度對總黃酮提取的影響

由圖4可知，黃花菜總黃酮提取率在提取溫度為70 ℃ 時達到最大值，溫度低于或超過70 ℃，總黃酮得率都呈現(xiàn)下降趨勢。呈現(xiàn)這種趨勢是因為在溫度小于70 ℃時，升高溫度和超聲波起到了協(xié)同加和的效果，所以總黃酮提取率隨著溫度的升高而增大，溫度超過70 ℃后，總黃酮的結(jié)構(gòu)可能由于高溫受到損壞，導(dǎo)致提取率開始下降，確定試驗溫度為70 ℃。

圖4 提取溫度影響結(jié)果Fig.4 The effect of extraction temperature on the extraction rate of total flavonoids

2.2.4 提取時間對總黃酮提取的影響

提取時間對總黃酮提取率的影響見圖5。

由圖5可知，30 min之前黃酮提取率隨著時間的延伸增加比較緩慢，30 min后提取率增加比較顯著，45 min時總黃酮提取率達到最大值，之后又開始下降。這是因為離子液體提取黃酮的原理是它可以與植物細胞壁中的纖維素形成氫鍵，破壞纖維素的結(jié)構(gòu)，將黃酮大量溶出。剛開始提取由于時間太短，離子液體沒有充分滲透進黃花菜組織，所以總黃酮溶出量較低，而隨著時間的延伸，黃花菜中總黃酮基本上完全被提取，時間繼續(xù)延長，離子液體可能會與其他物質(zhì)的纖維素作用，導(dǎo)致非黃酮類物質(zhì)溶出，總黃酮的得率下降。因此最終確定試驗時間為45 min。

圖5 提取時間影響結(jié)果Fig.5 The effect of extraction time on the extraction rate of total flavonoids

2.3 響應(yīng)面試驗

2.3.1 響應(yīng)面試驗結(jié)果

響應(yīng)面試驗分析結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面試驗結(jié)果Table 2 The experiment results of RSM

2.3.2 響應(yīng)面模型與分析

利用Design-Expert 8.0.6軟件對表2中試驗數(shù)據(jù)進行二次回歸分析，可以得到以下數(shù)學(xué)模型：

R1=14.93+1.67A-1.30B+0.78C+3.58D-0.33AB+1.94AC+1.98AD-0.42BC+2.08BD-1.03CD-5.32A2+1.81B2+0.92C2+0.7D2。

各因素的方差分析結(jié)果見表3。

表3 離子液體提取黃花菜總黃酮回歸模型方差分析Table 3 The variance analysis for the regression model of ionic liquid extraction of total flavonoids from Hemerocallis citrina

續(xù) 表

由表3可知，本試驗?zāi)Ｐ汀癙>F”值小于0.01，二次方程擬合極顯著，說明本次試驗方法可靠，可以用來分析和預(yù)測離子液體對黃花菜總黃酮提取的效果。一次項中提取溫度的“P>F”值小于0.01，因此它對提取率的影響極顯著，離子液體濃度的“P>F”值小于0.05，說明離子液體濃度對黃花菜總黃酮提取率的影響顯著，而B和C的“P>F”值均大于0.05，說明料液比和浸提時間對黃花菜總黃酮提取率的影響不顯著；二次項中A2的P>F”值小于0.01，B2的“P>F”值小于0.05，C2、D2的“P>F”值均大于0.05，所以二次項對總黃酮提取率的影響大小依次為A2>B2>C2>D2。

由圖6可知，各因素之間的交互作用對響應(yīng)值的影響結(jié)果為：離子液體濃度與料液比的交互作用等高線呈橢圓形，當料液比較小時，離子液體濃度對黃花菜總黃酮提取率的影響顯著，表現(xiàn)在圖上為曲線較陡，說明在料液比較小的范圍內(nèi)增加離子液體濃度，總黃酮提取率有明顯的升高；當料液比增大時，曲線開始變得平緩，說明料液比較大時增加離子液體濃度，總黃酮提取率不再顯著升高，說明這兩個因素之間是互相制約的關(guān)系，這也符合二次回歸方程中這兩項系數(shù)為負的結(jié)果。

圖6 因素交互作用響應(yīng)面結(jié)果圖Fig.6 The response surface plots and contour lines of interaction of various factors on the extraction rate of total flavonoids

2.4 驗證試驗

由回歸模型預(yù)測得到[C6mim]Br提取黃花菜總黃酮的最佳條件：[C6mim]Br濃度為0.83 mol/L，料液比為1∶20(g/mL)，提取時間為30.02 min，提取溫度為60.35 ℃，總黃酮提取率預(yù)測值為23.47%。為方便實際試驗操作，修正條件為：離子液體濃度0.8 mol/L、料液比1∶20(g/mL)、提取時間30 min、提取溫度60 ℃。 在此條件下進行重復(fù)試驗，重復(fù)試驗值為23.30%，與預(yù)測值相對誤差為0.72%，說明此方法所得工藝參數(shù)可靠。

3 結(jié)論

采用[C6mim]Br提取黃花菜總黃酮的最佳工藝條件為：[C6mim]Br水溶液濃度0.8 mol/L，料液比1∶20(g/mL)，提取時間30 min，提取溫度60 ℃，在此條件下黃花菜總黃酮提取率為23.30%，與傳統(tǒng)有機溶劑提取工藝(提取率0.581%[18])相比，黃花菜總黃酮提取率有了大幅提高。上述試驗結(jié)論為黃花菜黃酮在食品、藥品、功能型調(diào)味品方面的應(yīng)用提供了理論依據(jù)，可以提高黃花菜的附加價值。