曲 興, 樓小玲, 張頌紅, 贠軍賢

半疏水基質(zhì)陰離子交換晶膠對(duì)-酮異己酸的層析吸附特性

曲 興, 樓小玲, 張頌紅, 贠軍賢

(浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院, 綠色化學(xué)合成技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地, 浙江 杭州 310032)

針對(duì)微生物法制備-酮異己酸中目標(biāo)物分離純化困難的問(wèn)題，以甲基丙烯酸羥乙酯和甲基丙烯酸丁酯為基質(zhì)單體，采用冷凍結(jié)晶致孔和聚合法，制備半疏水基質(zhì)晶膠，并接枝-三甲基乙烯基苯甲氯化銨，得到半疏水基質(zhì)陰離子交換晶膠，用于-酮異己酸的層析分離。結(jié)果表明：在流速為1 cm×min-1和上樣質(zhì)量濃度為2.0 mg×mL-1的條件下，半疏水基質(zhì)陰離子交換晶膠對(duì)牛血清白蛋白和-酮異己酸的吸附容量分別達(dá)4.42和17.56 mg×mL-1，其對(duì)-酮異己酸的吸附容量隨NaCl濃度的增大而降低，且用濃度高于0.3 mol×L-1的NaCl溶液可實(shí)現(xiàn)洗脫。研究結(jié)果可為微生物法制備-酮異己酸的分離材料選用提供參考。

-酮異己酸；晶膠；層析；分離

1 引 言

-酮異己酸(-ketoisocaproate，KIC)，即4-甲基-2-氧代戊酸，是一種高值有機(jī)酸，存在于人體血液和肌肉中，維持體內(nèi)氧化還原環(huán)境。在轉(zhuǎn)氨酶的作用下，KIC可與L-亮氨酸相互轉(zhuǎn)化，共同調(diào)節(jié)和維持人體代謝平衡，同時(shí)具有促進(jìn)骨骼肌合成、調(diào)節(jié)體內(nèi)氮平衡和血糖平衡等作用，在醫(yī)學(xué)應(yīng)用領(lǐng)域有重要價(jià)值[1-5]。此外，KIC常作為中間體參與有機(jī)合成和生物合成過(guò)程，在化工、食品和飼料等其他領(lǐng)域也有廣闊應(yīng)用前景[6-8]。

KIC合成方法主要有化學(xué)法、微生物法和酶法。化學(xué)法有?；杌锼夥╗9]、草酸類乙酯水解法[10]和海因法[11]，其不僅反應(yīng)條件苛刻，而且需要添加氰化物和貴金屬催化劑，反應(yīng)過(guò)程復(fù)雜且副產(chǎn)物較多。酶法[12-13]存在酶的穩(wěn)定性不高、成本昂貴和轉(zhuǎn)化率較低等問(wèn)題。微生物法主要為谷氨酸棒桿菌工程菌株發(fā)酵合成[14-15]和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成[16]等方法，具有反應(yīng)條件溫和、成本低、環(huán)境友好、操作簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，但所得KIC常常存在于含有微生物細(xì)胞的復(fù)雜發(fā)酵液或轉(zhuǎn)化液中，分離純化困難。因此，探索KIC的高效分離新方法，具有重要意義。

近年來(lái)，晶膠作為一種具有超大孔隙的新型層析材料，在生化分離領(lǐng)域受到廣泛關(guān)注。晶膠主要通過(guò)單體經(jīng)冷凍結(jié)晶致孔和聚合反應(yīng)制備得到，其內(nèi)部為尺寸在數(shù)微米到數(shù)百微米的相互連通的發(fā)達(dá)孔隙，具有生物相容性好、傳質(zhì)阻力小和分離迅速等優(yōu)點(diǎn)，在生化分離領(lǐng)域具有良好應(yīng)用前景。但是，晶膠用于層析分離時(shí)，其本身吸附能力較弱，通常需要結(jié)合目標(biāo)物分子的特性，如親疏水性、電荷特征、功能基團(tuán)等，通過(guò)接枝修飾或引入配基以提高其選擇性吸附能力[17-19]。本課題組將聚甲基丙烯酸羥乙酯晶膠接枝-三甲基乙烯基苯甲氯化銨((vinylbenzyl)trimethylammonium chloride，VBTAC)，得到具有陰離子交換功能的晶膠介質(zhì)，實(shí)現(xiàn)了一步法從澄清轉(zhuǎn)化液中分離苯乳酸，苯乳酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)96.7%～98.6%[20]。

然而，目前國(guó)內(nèi)外報(bào)道的晶膠介質(zhì)主要是親水基質(zhì)的分離介質(zhì)。最近，本課題組將疏水單體和親水單體經(jīng)結(jié)晶致孔和共聚，得到一種新型晶膠介質(zhì)，即半疏水基質(zhì)晶膠。這種晶膠具有部分疏水、部分親水的基質(zhì)骨架，有利于具有部分疏水的生物分子物質(zhì)的吸附和分離，在生物分離領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。苯乳酸和-酮異己酸等生物有機(jī)酸的分子結(jié)構(gòu)中有疏水鏈和親水基團(tuán)，其在半疏水基質(zhì)晶膠中的吸附和分離與親水基質(zhì)晶膠中有所不同。半疏水基質(zhì)晶膠有望在-酮異己酸分離方面表現(xiàn)出獨(dú)到的優(yōu)勢(shì)。

本研究以親水性甲基丙烯酸羥乙酯(2-hydroxyethy methacrylate，HEMA)和疏水性甲基丙烯酸丁酯(butyl methacrylate，BMA)作為混合單體，通過(guò)冷凍結(jié)晶致孔和聚合，制備半疏水基質(zhì)晶膠；然后通過(guò)接枝VBTAC進(jìn)行化學(xué)修飾，得到具有陰離子交換功能的半疏水基質(zhì)陰離子交換晶膠，簡(jiǎn)稱陰離子交換晶膠。測(cè)定了其滲透率、軸向擴(kuò)散和蛋白吸附能力等基礎(chǔ)性能，并探究其對(duì)KIC的吸附和分離性能，為下一步從復(fù)雜料液中分離KIC奠定基礎(chǔ)。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

-酮異己酸(KIC，99%)，上海阿拉丁；甲基丙烯酸羥乙酯(HEMA，97%)、聚乙二醇二丙烯酸酯(polyethylene glycol diacrylate，PEGDA，相對(duì)分子質(zhì)量的n=250)、四甲基乙二胺(tetramethylethylenediamine，TEMED，99%)，Sigma-Aldrich；甲基丙烯酸丁酯(BMA，99%)、十二烷基硫酸鈉(sodium lauryl sulfate，SDS，98%)、過(guò)硫酸銨(ammonium persulfate，APS，98%)、,,-三甲基乙烯基苯甲氯化銨(VBTAC，99%)及其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

2.1.2 儀器

高效液相色譜(high performance liquid chromatography，HPLC)，Shimadzu LC-16/16P，日本島津；紫外-可見(jiàn)光分光光度計(jì)，Ultrospec 3300 pro，GE Healthcare；超純水系統(tǒng)，Milli-Q Synthesis，美國(guó)Millipore公司；低溫恒溫槽(THD-3030)、數(shù)控超級(jí)恒溫槽(SC-15)，寧波天恒儀器廠。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1 陰離子交換晶膠的制備

將單體HEMA、BMA和PEGDA溶于質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的SDS溶液中，配制單體質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10% 的混合液，其中HEMA、BMA和PEGDA分別占溶液總質(zhì)量的3.5%、3.5% 和3%。以APS為引發(fā)劑，TEMED為加速劑，其質(zhì)量分別占單體(HEMA、BMA和PEGDA)總質(zhì)量的1.5% 和3%。采用冷凍結(jié)晶致孔和聚合反應(yīng)法制備p(HEMA-BMA)晶膠介質(zhì)，整個(gè)晶膠介質(zhì)的制備過(guò)程包括配液、預(yù)冷、混合、灌注、解凍和除雜6個(gè)步驟[21]。

采用孔內(nèi)原位接枝法，以二過(guò)碘酸合銅鉀(K5[Cu(HIO6)2])為催化劑[22]，在p(HEMA-BMA)晶膠柱上接枝單體VBTAC，得到具有陰離子交換功能的晶膠介質(zhì)p(HEMA-BMA)-VBTAC[20]。

2.2.2 陰離子交換晶膠基礎(chǔ)性能測(cè)試

陰離子交換晶膠柱長(zhǎng)42 mm，直徑10 mm，柱體積3.28 mL。對(duì)晶膠柱的基礎(chǔ)性能進(jìn)行測(cè)試，主要包括微觀結(jié)構(gòu)特征SEM測(cè)試[23]、停留時(shí)間分布(RTD)測(cè)試[19]、軸向擴(kuò)散[24]、滲透率[25]以及孔隙率[23]。前人常用牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)作為模型蛋白，對(duì)不同陰離子交換晶膠的吸附性能進(jìn)行評(píng)價(jià)。為了便于對(duì)比，本研究以BSA為模型蛋白，對(duì)所得陰離子交換晶膠的基礎(chǔ)吸附性能進(jìn)行測(cè)定和評(píng)價(jià)[26]。

2.2.3 陰離子交換晶膠對(duì)KIC的吸附特性

采用文獻(xiàn)[20]中方法，探究氯化鈉濃度對(duì)KIC在p(HEMA-BMA)-VBTAC陰離子交換晶膠中吸附性能的影響：配制濃度為0、0.001、0.01、0.1和0.3 mol×L-1的氯化鈉水溶液，將KIC分別溶解于相應(yīng)氯化鈉溶液中，配制成質(zhì)量濃度為1、5、10、15和20 mg×mL-1的KIC溶液，體積為20 mL。以不同濃度的氯化鈉溶液作為緩沖溶液，平衡晶膠層析柱；將含有KIC的氯化鈉溶液循環(huán)上樣，流速為1.0 cm×min-1，整個(gè)過(guò)程采用紫外檢測(cè)器同步檢測(cè)，波長(zhǎng)為220 nm。待KIC溶液在晶膠中吸附平衡，用緩沖液沖洗，除去未吸附的KIC，用1 mol×L-1的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，將循環(huán)上樣的KIC溶液和洗脫液進(jìn)行HPLC檢測(cè)，計(jì)算陰離子交換晶膠中KIC的吸附量。

根據(jù)物料衡算，通過(guò)吸附前后KIC濃度計(jì)算單位體積晶膠介質(zhì)對(duì)KIC的吸附容量，如式(1)[21]：

采用Langmuir吸附平衡方程對(duì)吸附等溫線進(jìn)行擬合，如式(2)[21]：

式中：m為飽和吸附容量(mg×mL-1)，d為解離常數(shù)(mg×mL-1)。

2.2.4 陰離子交換晶膠對(duì)KIC的層析分離特性

以不同濃度的氯化鈉溶液為溶劑，分別配制質(zhì)量濃度為2.0 mg×mL-1的KIC溶液，探究KIC在p(HEMA-BMA)-VBTAC晶膠柱中的層析情況。用超純水作為緩沖液，平衡晶膠層析柱，將配好的KIC溶液上樣，直到紫外信號(hào)值上升至最大且穩(wěn)定，用緩沖液進(jìn)行沖洗，用1 mol×L-1的氯化鈉溶液進(jìn)行洗脫，流速為1.0 cm×min-1。收集上樣與沖洗過(guò)程床柱流出液，進(jìn)行HPLC檢測(cè)，計(jì)算不同氯化鈉濃度下KIC在陰離子交換晶膠中的層析過(guò)程動(dòng)態(tài)和吸附容量。

3 結(jié)果與討論

3.1 陰離子交換晶膠微觀結(jié)構(gòu)

圖1為p(HEMA-BMA)-VBTAC陰離子交換晶膠介質(zhì)在掃描電鏡不同放大倍數(shù)下的微觀結(jié)構(gòu)。由圖1可見(jiàn)，晶膠介質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)清晰，內(nèi)部存在分布均勻的超大孔隙，且孔隙相互連通，其尺寸為10～100mm。該晶膠介質(zhì)的超大孔隙結(jié)構(gòu)不僅能夠滿足流體在其內(nèi)部低阻力流動(dòng)，也可滿足生物大分子和細(xì)胞通過(guò)，有利于從含細(xì)胞微生物發(fā)酵液進(jìn)行KIC的層析分離。實(shí)驗(yàn)測(cè)得晶膠介質(zhì)有效孔隙率和絕干孔隙率分別為73.53%和82.43%。

圖1 陰離子交換晶膠掃描電鏡圖

3.2 陰離子交換晶膠基礎(chǔ)性能

實(shí)驗(yàn)所得陰離子交換晶膠p(HEMA-BMA)-VBTAC的基礎(chǔ)性能如圖2所示。圖中，為停留時(shí)間分布函數(shù)(s-1)，q為流量(mL×min-1)，L為流速(cm×min-1)，load為層析收集體積(mL)，Dw為壓降(Pa)。

圖2 陰離子交換晶膠基礎(chǔ)性能

圖2(a)為不同流速下的RTD曲線，在測(cè)試過(guò)程中，晶膠層析柱在流速1～5 cm×min-1內(nèi)操作均無(wú)明顯壓縮，說(shuō)明該晶膠介質(zhì)可以適應(yīng)較大流速范圍的層析分離，與親水基質(zhì)的pAAM-AMPSA[27]和pHEMA-VBTAC[20]晶膠相似。晶膠床柱RTD峰形對(duì)稱性良好，無(wú)明顯拖尾現(xiàn)象，流體在晶膠介質(zhì)內(nèi)分布均勻，流體返混和壁流現(xiàn)象明顯較弱，對(duì)流傳質(zhì)過(guò)程較強(qiáng)。

圖2(b)是不同流速下的等板高度HETP，隨著流速的增大，陰離子交換晶膠的等板高度HETP沒(méi)有明顯變化，說(shuō)明床層穩(wěn)定性良好，HETP維持在0.061～0.079 cm，明顯小于Guan等[20]所得晶膠介質(zhì)pHEMA-VBTAC的HETP 0.16～0.18 cm，說(shuō)明p(HEMA-BMA)-VBTAC引入BMA單體后晶膠介質(zhì)柱內(nèi)床層結(jié)構(gòu)更好，孔隙度更為均勻，理論塔板數(shù)大，層析分離能力高。

圖3 不同氯化鈉質(zhì)量濃度下KIC的Langmuir等溫吸附曲線

表1 不同氯化鈉濃度下KIC的飽和吸附容量Qm和解離常數(shù)Kd

圖2(c)是以體積分?jǐn)?shù)為50% 的乙醇溶液測(cè)定的床層壓降Dw與流量q關(guān)系曲線，由圖可見(jiàn)，壓降與流量之間線性關(guān)系良好，計(jì)算得到的晶膠柱滲透率w為6.29′10-13m2，與親水基質(zhì)pHEMA-VBTAC晶膠[20]相比，有所減小。

圖2(d)為不同流速條件下BSA的層析動(dòng)態(tài)曲線，由圖可見(jiàn)，在流速分別為1.0、3.0、5.0 cm×min-1條件下，BSA層析曲線接近。通過(guò)檢測(cè)和計(jì)算可得BSA的吸附容量分別為4.58、4.62和4.42 mg×mL-1，表明該晶膠介質(zhì)對(duì)BSA吸附能力較強(qiáng)，在高流速下依然可以保持高吸附容量，有助于進(jìn)一步在高流速下對(duì)KIC進(jìn)行層析分離。與親水基質(zhì)pHEMA-VBTAC晶膠[20]相比，吸附容量顯著提高，表明疏水單體BMA的加入，使得晶膠介質(zhì)兼具疏水和離子交換作用，提高了高值有機(jī)物在晶膠介質(zhì)中的吸附容量。

3.3 α-酮異己酸在陰離子交換晶膠中的吸附與分離性能

3.3.1-酮異己酸在陰離子交換晶膠中的吸附性能

在-酮異己酸的實(shí)際生物合成過(guò)程中，發(fā)酵液或轉(zhuǎn)化液中通常含有不同種類的離子、殘?zhí)?、代謝產(chǎn)物等雜質(zhì)，對(duì)晶膠吸附有重要影響。而在其分離過(guò)程中，如何方便地將-酮異己酸從陰離子交換晶膠中洗脫，是需要首先解決的問(wèn)題。鹽是影響晶膠層析和洗脫的重要因素，研究鹽濃度對(duì)吸附能力的影響具有重要意義。為了探索鹽度對(duì)-酮異己酸在陰離子交換晶膠中的吸附性能和分離規(guī)律，本研究在濃度為0～0.3 mol×L-1的氯化鈉溶液中，按2.2.3節(jié)所述實(shí)驗(yàn)方法測(cè)定陰離子交換晶膠對(duì)KIC的吸附量，并將得到KIC的Langmuir等溫吸附數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，結(jié)果如圖3所示?？梢钥闯?，鹽濃度對(duì)陰離子交換晶膠吸附KIC有顯著影響。通過(guò)吸附等溫式得到不同鹽濃度下KIC的飽和吸附容量m和解離常數(shù)d等吸附平衡參數(shù)，如表1所示。

當(dāng)氯化鈉濃度為0 mol×L-1時(shí)，晶膠層析柱對(duì)KIC吸附容量最大，高達(dá)39.0 mg×mL-1，解離常數(shù)為3.56 mg×mL-1，表明陰離子交換晶膠對(duì)KIC具有較高吸附容量。隨著鹽濃度的增大，吸附容量呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，尤其是鹽濃度由0.001升至0.01 mol×L-1時(shí)，KIC的吸附容量由36.69下降至12.65 mg×mL-1；鹽濃度由0.1提升至0.3 mol×L-1時(shí)，KIC的吸附容量由8.89下降至6.01 mg×mL-1，解離常數(shù)整體呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)。表明在層析過(guò)程中用濃度高于0.3 mol×L-1的氯化鈉溶液，即可實(shí)現(xiàn)洗脫。

3.3.2-酮異己酸在陰離子交換晶膠中的層析分離性能

實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探究了氯化鈉濃度對(duì)KIC在陰離子交換晶膠層析柱中吸附性能的影響，層析過(guò)程中KIC在晶膠中的濃度變化及吸附容量如圖4所示。在層析過(guò)程中，當(dāng)KIC溶液流經(jīng)晶膠介質(zhì)時(shí)，KIC會(huì)與晶膠中的陰離子交換官能團(tuán)以離子交換作用和靜電引力作用相結(jié)合；但隨著上樣體積的增加，晶膠介質(zhì)對(duì)KIC的吸附能力減弱，越來(lái)越多的KIC穿過(guò)晶膠介質(zhì)被收集，直至吸附飽和。圖4(a)中上樣階段呈現(xiàn)出KIC濃度逐漸上升且最終趨向平緩的趨勢(shì)。而氯化鈉具有的屏蔽效應(yīng)和可以占據(jù)晶膠介質(zhì)中吸附位點(diǎn)的特性，會(huì)對(duì)KIC溶液在晶膠層析柱中流動(dòng)與吸附性能產(chǎn)生顯著影響，隨著氯化鈉濃度增大，KIC濃度上升坡度越大，達(dá)到最大濃度越快，說(shuō)明高濃度鹽會(huì)加快KIC穿透晶膠介質(zhì)，降低晶膠介質(zhì)對(duì)KIC的吸附能力。用超純水作為緩沖液，將未被吸附的KIC沖洗下來(lái)后，用1 mol×L-1NaCl作為洗脫液，將吸附在晶膠層析柱中的KIC進(jìn)行洗脫，從圖4(a)可見(jiàn)，洗脫峰的峰形對(duì)稱，且氯化鈉濃度越低，洗脫峰越高。

圖4 不同鹽濃度下α-酮異己酸的層析過(guò)程及吸附容量

通過(guò)計(jì)算得到不同氯化鈉濃度下KIC層析過(guò)程的吸附容量，如圖4(b)所示?？梢?jiàn)，KIC的吸附容量隨著氯化鈉濃度的增大呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，與吸附實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。層析過(guò)程溶液中上樣液中KIC質(zhì)量濃度僅為2 mg×mL-1，尚沒(méi)有達(dá)到飽和吸附的濃度。當(dāng)無(wú)氯化鈉時(shí)，KIC吸附容量最大，達(dá)17.56 mg×mL-1；當(dāng)氯化鈉濃度為0.3 mol×L-1時(shí)，KIC吸附容量最小，僅為1.06 mg×mL-1，說(shuō)明提高鹽濃度可以方便地洗脫。表明陰離子交換晶膠層析柱對(duì)KIC的吸附容量大，洗脫方便，可用于下一步從復(fù)雜料液中層析分離KIC。但是，由于真實(shí)KIC發(fā)酵液中往往存在細(xì)胞、培養(yǎng)基和亮氨酸等其他代謝產(chǎn)物，在一定程度上會(huì)影響KIC的競(jìng)爭(zhēng)吸附，因此，需要對(duì)層析條件做更深入的實(shí)驗(yàn)研究。

4 結(jié) 論

以甲基丙烯酸羥乙酯和甲基丙烯酸丁酯作為復(fù)合單體材料，經(jīng)過(guò)冷凍結(jié)晶聚合和原位接枝，制備得到具有陰離子交換功能的p(HEMA-BMA)-VBTAC陰離子交換晶膠層析介質(zhì)。該層析介質(zhì)具有良好的軸向擴(kuò)散性能和孔隙結(jié)構(gòu)，有效孔隙率為73.53%，絕干孔隙率為82.43%，在流速為1.0、3.0、5.0 cm×min-1下，BSA蛋白吸附容量分別為4.58、4.62和4.42 mg×mL-1，吸附能力穩(wěn)定。-酮異己酸在該晶膠層析介質(zhì)中循環(huán)上樣吸附過(guò)程中，呈現(xiàn)出較強(qiáng)的鹽敏感性，當(dāng)無(wú)氯化鈉時(shí)，陰離子交換晶膠對(duì)KIC的最大吸附容量為39.00 mg×mL-1；當(dāng)鹽濃度超過(guò)0.3 mol×L-1時(shí)，KIC吸附容量迅速降低。因此，可以通過(guò)提高鹽濃度實(shí)現(xiàn)洗脫，方便-酮異己酸的高效分離。

[1] 程申, 張頌紅, 贠軍賢.-酮異己酸的生物合成研究進(jìn)展[J]. 化工進(jìn)展, 2018, 37(12): 4821-4829.

CHENG S, ZHANG S H, YUN J X. Recent advances in microbial synthesis of-ketoisocaproate [J]. Chemical Industry and Engineering Progress, 2018, 37(12): 4821-4829.

[2] BARAZZONI R, MEEK S E, EKBERY K,. Arterial KIC as marker of liver and muscle intracellular leucine pools in healthy and type 1 diabetic humans [J]. American Journal of Physiology, 1999, 277(2): E238.

[3] ZANCHI N E, GERLINGER R F, GUIMARAES F L,. HMB supplementation: clinical and athletic performance-related effects and mechanisms of action [J]. Amino Acids, 2011, 40(4): 1015-1025.

[4] CHANG J H, KIM D K, PARK J T,. Influence of ketoanalogs supplementation on the progression in chronic kidney disease patients who had training on low-protein diet [J]. Nephrology, 2009, 14(8): 750-757.

[5] LERLERCQ-MEYER V, MARCHAND J, LECLERCQ R,. Interactions of-ketoisocaproate, glucose and arginine in the secretion of glucagon and insulin from the perfused rat pancreas [J]. Diabetologia, 1979, 17(2): 121-126.

[6] ANTIZAR L B, TURRION J L. Second generation biofuels and local bioenergy systems [J]. Biofuels Bioproducts and Biorefining, 2008, 2(5): 455-469.

[7] FORTMAN J L, CHHABRA S, MUKHOPADHYAY A,. Biofuel alternatives to ethanol: Pumping the microbial well [J]. Trends in Biotechnology, 2008, 26(7): 375-381.

[8] CANN A F, LIAO J C. Pentanol isomer synthesis in engineered microorganisms [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2010, 85(4): 893-899.

[9] NIMITZ J S, MOSHER H S. A new synthesis of .alpha.-keto esters and acids [J]. The Journal of Organic Chemistry, 1981, 46(1): 211-213.

[10] WATERS K L. The-keto acids [J]. Chemical Reviews, 1947, 41(3): 585-598.

[11] 丁威. 海因法合成幾種-酮酸及-酮酸鹽[D]. 南京: 東南大學(xué), 2007.

DING W. Synthesis of several-ketoacids and-ketoacids salts with hydantoin method [D]. Nanjing: Dongnan University, 2007.

[12] SONG Y, LI J, SHIN H D,. One-step biosynthesis of-ketoisocaproate from L-leucine by anwhole-cell biocatalyst expressing an L-amino acid deaminase from[J]. Scientific Reports, 2015, 5: 12614.

[13] SONG Y, LI J, SHIN H D,. Tuning the transcription and translation of L-amino acid deaminase inimproves-ketoisocaproate production from L-leucine [J]. PLoS One, 2017, 12(6): e0179229.

[14] BüCKEL-VALLANT V, KRAUSE F S, MESSERSCHMIDT S,. Metabolic engineering offor-ketoisocaproate production [J]. Applied Microbiology and Biotechnology, 2014, 98(1): 297-311.

[15] VOGT M, HAAS S, POLEN T,. Production of-ketoisocaproate withstrains devoid of plasmids and heterologous genes [J]. Microbial Biotechnology, 2015, 8(2): 351-360.

[16] ZHU Y H, LI J H, LIU L,. Production of-ketoisocaproate via free-whole-cell biotransformation byDSM 43250with L-leucine as the substrate [J]. Enzyme and Microbial Technology, 2011, 49(4): 321-325.

[17] YUN J X, SHEN S C, CHEN F,. One-step isolation of adenosine triphosphate from crude fermentation broth ofby anion-exchange chromatography using supermacroporous cryogel [J]. Journal of Chromatography B, 2007, 860(1): 57-62.

[18] YAO K J, SHEN S C, YUN J X,. Preparation of polyacrylamide-based supermacroporous monolithic cryogel beds under freezing-temperature variation conditions [J]. Chemical Engineering Science, 2006, 61(20): 6701-6708.

[19] YUN J X, JESPERSEN G R, KIRSEBOM H,. An improved capillary model for describing the microstructure characteristics, fluid hydrodynamics and breakthrough performance of proteins in cryogel beds [J]. Journal of Chromatography A, 2011, 1218: 5487-5497.

[20] GUAN J T, GUAN Y X, YUN J X,. Chromatographic separation of phenyllactic acid from crude broth using cryogels with dual functional groups [J]. Journal of Chromatography A, 2018, 1554: 92-100.

[21] 關(guān)今韜. 布氏乳桿菌轉(zhuǎn)化合成苯乳酸及其晶膠分離特性研究[D]. 杭州: 浙江大學(xué), 2018.

GUAN J T. Biosynthesis of phenyllactic acid byand the related separation performance with cryogel [D]. Hangzhou: Zhejiang University, 2018.

[22] HANORA A, PLIEVA F M, HEDSTROM M,. Capture of bacterial endotoxins using a supermacroporous monolithic matrix with immobilized polyethyleneimine, lysozyme or polymyxin B [J]. Journal of Biotechnology, 2005, 118(4): 421-433.

[23] UYGUN M, AKDUMAN B, AKG?L S,. A new metal-chelated cryogel for reversible immobilization of urease [J]. Applied Biochemistry and Biotechnology, 2013, 170(8): 1815-1826.

[24] CHEN F, YAO K J, SHEN S C,. Influence of grafting conditions on the properties of polyacrylamide-based cation-exchange cryogels grafted with 2-acrylamido-2-methyl-1-propanesulfonic acid [J]. Chemical Engineering Science, 2008, 63(1): 71-77.

[25] LOZINSKY V I. Cryogels on the basis of natural and synthetic polymers: Preparation, properties and application [J]. Russian Chemical Reviews, 2002, 71: 489-511.

[26] YAO K J, YUN J X, SHEN S C,In-situ graft-polymerization preparation of cation-exchange supermacroporous cryogel with sulfo groups in glass columns [J]. Journal of Chromatography A, 2007, 1157(1/2): 246-251.

[27] YAO K J, SHEN S C, YUN J X,. Protein adsorption in supermacroporous cryogels with embedded nanoparticles [J]. Biochemical Engineering Journal, 2007, 36(2): 139-146.

Chromatographic and adsorption characteristics of-ketoisocaproate in semi-hydrophobic anion exchange croygel

QU Xing, LOU Xiao-ling, ZHANG Song-hong, YUN Jun-xian

(State Key Laboratory Breeding Base of Green Chemistry Synthesis Technology,College of Chemical Engineering, Zhejiang University of Technology, Hangzhou 310032, China)

Semi-hydrophobic anion exchange cryogel was prepared by cryo-polymerization using 2-hydroxyethy methacrylate and butyl methacrylate as the key monomers via graft polymerization with monomer (vinylbenzyl)trimethylammonium chlorid, which was used for the separation of-ketoisocaproate prepared by biological methods. The results show that the binding capacity of the semi-hydrophobic cryogel for bovine serum albumin and-ketoisocaproate were 4.42 and 17.56 mg×mL-1, respectively, when the loading concentration is 2.0 mg×mL-1at the flow velocity of 1 cm×min-1. The adsorption capacity for-ketoisocaproate decreased with the increase of NaCl concentration and the elution was achieved by increasing NaCl concentration over 0.3 mol×L-1.The results of this work are helpful for the selection of materials for-ketoisocaproate acid separation from biological preparation.

-ketoisocaproate; croygel; chromatography; separation

TQ028

A

10.3969/j.issn.1003-9015.2022.01.006

1003-9015(2022)01-0046-07

2021-07-20；

2021-10-10。

國(guó)家自然科學(xué)基金(22078296，21576240)；浙江省自然科學(xué)基金(LD21B060001)。

曲興(1993-)，男，山東青島人，浙江工業(yè)大學(xué)碩士生。

張頌紅，E-mail：zhangsh@zjut.edu.cn

曲興, 樓小玲, 張頌紅, 贠軍賢.半疏水基質(zhì)陰離子交換晶膠對(duì)-酮異己酸的層析吸附特性[J]. 高?；瘜W(xué)工程學(xué)報(bào), 2022, 36(1): 46-52.

：QU Xing, LOU Xiao-ling, ZHANG Song-hong, YUN Jun-xian. Chromatographic and adsorption characteristics of-ketoisocaproate in semi-hydrophobic anion exchange croygel [J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 2022, 36(1): 46-52.