楊金睿，吉 澤，李俊逸，姚 遙，祝春月，王文倩，肖關(guān)麗*

（1云南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)與生物技術(shù)學(xué)院，云南 昆明 650201；2云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，云南 昆明 650201）

0 引言

【研究意義】馬鈴薯是我國(guó)第四大糧食作物，除自然資源條件外，蟲害是制約我國(guó)馬鈴薯單產(chǎn)進(jìn)一步提升的重要因素（徐進(jìn)等，2019）。馬鈴薯塊莖蛾（Phthorimaea operculella）是一種世界性農(nóng)業(yè)害蟲，對(duì)馬鈴薯植株和塊莖均有危害，嚴(yán)重影響馬鈴薯的產(chǎn)量和品質(zhì)，已在我國(guó)南方馬鈴薯主產(chǎn)區(qū)大范圍發(fā)生，尤其是在云南等地發(fā)生嚴(yán)重（閆俊杰等，2019）。在我國(guó)大力推進(jìn)綠色農(nóng)業(yè)發(fā)展的今天，為促進(jìn)馬鈴薯產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，采取以微生物等為基礎(chǔ)的綠色生物防治技術(shù)是馬鈴薯塊莖蛾防控的重要舉措。植物內(nèi)生細(xì)菌作為一種新型微生物資源，其豐富的微生物種類為尋找新型抗蟲微生物及其活性物質(zhì)提供了可能。因此，從不同馬鈴薯品種中探尋對(duì)馬鈴薯塊莖蛾有防治作用的內(nèi)生細(xì)菌具有重要的研究開(kāi)發(fā)價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】植物內(nèi)生菌（Endophyte）是指生長(zhǎng)在植物各種不同組織內(nèi)部但又不會(huì)引起植物表觀癥狀的微生物（Sturz et al.，2000），主要包括內(nèi)生細(xì)菌、放線菌以及真菌3大類，普遍存在于不同的植物中（張?chǎng)危?018），在植物不同組織及其器官內(nèi)廣泛分布（賈顏等，2021）。當(dāng)前文獻(xiàn)報(bào)道的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌研究大多集中在馬鈴薯塊莖方面，研究人員通過(guò)傳統(tǒng)分離培養(yǎng)和高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）、微球菌屬（Micrococcus）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、紅球菌屬（Rhodococcus）、腸桿菌屬（Enterobacter）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）等（屈青松等，2016；戴超，2017；Liu et al.，2020；Shi et al.，2021）。在馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌功能的研究中，研究人員通過(guò)內(nèi)生細(xì)菌菌懸液浸泡馬鈴薯種薯塊莖后，根據(jù)其生長(zhǎng)狀況篩選出對(duì)馬鈴薯植株生長(zhǎng)發(fā)育或致病產(chǎn)生影響的菌株（Istifadah et al.，2018）；也有采用平板培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)對(duì)馬鈴薯病原真菌有高抑制率的芽孢桿菌屬內(nèi)生細(xì)菌——萎縮芽胞桿菌（B.atrophaeus）和貝萊斯芽胞桿菌（B.velezensis）（陳星伊等，2020），而關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌防治馬鈴薯塊莖蛾的研究則鮮有報(bào)道。微生物防治已成為近年來(lái)綠色防控馬鈴薯塊莖蛾的研究熱點(diǎn)，如蘇云金桿菌（Bacillus thuringiensis）已被應(yīng)用于防治馬鈴薯塊莖蛾，B.thuringiensisssp.Kurstaki（Btk）是一株商用蘇云金桿菌菌株，可制成可濕性粉劑作為化學(xué)殺蟲劑的替代品，在馬鈴薯收獲前施用以抵御馬鈴薯塊莖蛾幼蟲在田間對(duì)塊莖的侵害，降低儲(chǔ)藏過(guò)程中塊莖被侵染的風(fēng)險(xiǎn)（Arthurs et al.，2008）；以浸蟲法測(cè)定球孢白僵菌（Beauveria bassiana）菌株SD對(duì)馬鈴薯塊莖蛾1齡幼蟲的毒力作用，10 d后致死率高達(dá)98%，處理后的幼蟲產(chǎn)卵量、生長(zhǎng)發(fā)育期和后代的凈繁殖率均顯著降低，對(duì)馬鈴薯塊莖蛾造成潛在的長(zhǎng)期影響（Yuan et al.，2017）；采用金龜子綠僵菌（Metarhizium anisopliae）、萊氏野村菌（Nomuraea rileyi）和細(xì)腳擬青霉（Paecilomyces tenuipes）的孢子懸浮液浸泡處理馬鈴薯葉片和塊莖，對(duì)取食的馬鈴薯塊莖蛾幼蟲均有殺蟲作用，還可降低成蟲羽化率和卵孵化率，其中萊氏野村菌對(duì)防治初孵幼蟲侵入馬鈴薯塊莖的效果最好（Khorrami et al.，2018）；通過(guò)浸葉法測(cè)定發(fā)現(xiàn)黏質(zhì)沙雷氏菌（Serratia marcescens）菌株ML-1不同成分對(duì)馬鈴薯塊莖蛾幼蟲均有較強(qiáng)的殺蟲活性（蘇造堂，2020）。【本研究切入點(diǎn)】目前用來(lái)防治馬鈴薯塊莖蛾的生防菌較少，對(duì)馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌的開(kāi)發(fā)利用仍處于早期階段，且尚未有通過(guò)馬鈴薯可培養(yǎng)內(nèi)生細(xì)菌防治馬鈴薯塊莖蛾的研究報(bào)道?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以云南省2種馬鈴薯主栽品種麗薯6號(hào)和會(huì)-2為材料，采用LB培養(yǎng)基分離培養(yǎng)馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌，根據(jù)內(nèi)生細(xì)菌的形態(tài)特征和16S rDNA序列進(jìn)行種類鑒定；通過(guò)浸葉飼喂法測(cè)定內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌懸液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾的殺蟲活性，以期為馬鈴薯塊莖蛾的生物防治提供菌種資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試馬鈴薯品種：麗薯6號(hào)和會(huì)-2，由云南省曲靖市會(huì)澤縣農(nóng)技中心提供。供試蟲源：云南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院昆蟲學(xué)實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)繁殖的馬鈴薯塊莖蛾穩(wěn)定種群，待馬鈴薯塊莖蛾幼蟲羽化為成蟲后用直形管收集雌、雄成蟲并在封口紗布上沾10%蜂蜜水喂食后使其產(chǎn)卵，待紗布上的幼蟲孵化后用合作88馬鈴薯塊莖飼養(yǎng)至3齡，選擇大小一致、健康和具有活力的馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲作為試驗(yàn)蟲源。

培養(yǎng)基：LB固體培養(yǎng)基（NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2）；LB液體培養(yǎng)基（NaCl 10 g、胰蛋白胨10 g、酵母浸粉5 g、蒸餾水1000 mL，pH 7.0～7.2）。

主要試劑及儀器：3% NaClO溶液、吐溫-80、ddH2O、細(xì)菌通用引物、2×TaqPCR Master Mix、綠色熒光核酸染料。Mastercycler?Nexus型PCR儀和5430R型多用途高效離心機(jī)（德國(guó)Eppendorf公司）、DYY-2C型電泳儀（北京六一生物科技有限公司）、RXZ-260B-30恒溫光照培養(yǎng)箱（寧波賽福實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）。

1.2 樣品采集與處理

2個(gè)馬鈴薯品種種薯為根據(jù)GB 18133—2012《馬鈴薯種薯》劃分為一級(jí)種的種薯，重量50～60 g，帶有2～3個(gè)芽眼，芽長(zhǎng)1.0 cm左右。將2個(gè)品種的種薯栽種于花盆（直徑40 cm，高40 cm），用防蟲網(wǎng)罩住以防止害蟲危害。以含沙量高、通氣性好的沙質(zhì)土為栽培土壤，2個(gè)品種采用相同的種植管理方法，每個(gè)品種種植10盆，試驗(yàn)在大棚內(nèi)進(jìn)行。馬鈴薯栽種50 d其植株生長(zhǎng)至塊莖形成期時(shí)，2個(gè)品種均選擇長(zhǎng)勢(shì)相同的植株中部展開(kāi)復(fù)葉上的完整、健康、無(wú)病蟲害癥狀的葉片為試驗(yàn)材料，5次重復(fù)，取樣后即裝入密封袋帶回實(shí)驗(yàn)室分離內(nèi)生細(xì)菌。

先將2個(gè)品種采集的新鮮葉片用流水沖洗1～2 min后用無(wú)菌濾紙擦干表面，用無(wú)菌水浸泡漂洗3次，放入75%酒精浸泡1 min，再用無(wú)菌水將酒精漂洗干凈，然后把葉片放入3% NaClO溶液充分浸泡1 min后用無(wú)菌水將其漂洗，最后75%酒精浸泡30 s后用無(wú)菌水充分漂洗（楊瑞先等，2005）。取少量最后一次漂洗葉片的無(wú)菌水涂布在LB固體培養(yǎng)基作為對(duì)照，若對(duì)照培養(yǎng)基未長(zhǎng)出菌落則證明葉片表面消毒徹底。

1.3 內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定

1.3.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離 采用研磨法分離內(nèi)生細(xì)菌。取1 g已表面消毒好的新鮮葉片用無(wú)菌剪刀剪碎，加入適量無(wú)菌水在無(wú)菌研缽中研磨成勻漿狀溶液，取100 μL在LB固體培養(yǎng)基涂布培養(yǎng)，設(shè)5次重復(fù)（張海龍，2014）。

1.3.2 細(xì)菌種類鑒定

1.3.2.1 細(xì)菌形態(tài)學(xué)鑒定 將葉片中分離到的細(xì)菌菌株在LB固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)，對(duì)純化好的菌株參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊(cè)》（Buchanan and Gibbons，1999）對(duì)其菌落顏色、形態(tài)等培養(yǎng)性狀進(jìn)行初步鑒定。采用革蘭氏染色法鑒定細(xì)菌顯色反應(yīng)確定革蘭氏陰陽(yáng)性，并觀察其細(xì)胞形態(tài)。

1.3.2.2 細(xì)菌分子鑒定 以凍溶法提取細(xì)菌菌株DNA（鄭亞強(qiáng)等，2017）。將LB固體培養(yǎng)基上純化培養(yǎng)好的細(xì)菌用無(wú)菌接種環(huán)挑取少許單菌落放入裝有500 μL無(wú)菌水的無(wú)菌離心管中，震蕩儀振蕩使離心管中的菌體和無(wú)菌水充分混勻，然后將裝有菌液的離心管在液氮中冰凍10 min后取出，立即放置在漂浮盤上于沸水中水浴5 min，取出后放入離心機(jī)在12000 r/min條件下離心2 min，離心管中的上清液即為DNA模板。以細(xì)菌通用引物27F（5'-AGAGTTT GATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-TACGACTTA ACCCCAATCGC-3'）擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA基因，PCR反應(yīng)體系25.0 μL：上、下游引物各1.0 μL，PCR Master Mix 12.5 μL，DNA模板1.0 μL，ddH2O 9.5 μL。擴(kuò)增程序：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃1 min，53 ℃1 min，72 ℃2 min，進(jìn)行32個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。取3 μL PCR產(chǎn)物采用凝膠電泳檢測(cè)，合格的PCR產(chǎn)物送往生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

1.4 內(nèi)生細(xì)菌對(duì)馬鈴薯塊莖蛾的殺蟲活性測(cè)定

1.4.1 內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵液殺蟲活性測(cè)定 以分離獲得的內(nèi)生細(xì)菌為供試菌株，將已在LB固體培養(yǎng)基上純化好培養(yǎng)48 h的供試菌株分別接種于裝有100 mL無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，置于搖床28 ℃下180 r/min培養(yǎng)24 h。參考楊建云等（2014）的方法測(cè)定細(xì)菌菌懸液濃度，使用分光光度計(jì)時(shí)首先以LB液體培養(yǎng)基調(diào)零，然后測(cè)定培養(yǎng)24 h時(shí)各原始細(xì)菌發(fā)酵液的OD600，稀釋1×106～1×108倍后取100 μL涂布于LB液體培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待細(xì)菌菌落長(zhǎng)出后根據(jù)菌落數(shù)測(cè)定原始細(xì)菌發(fā)酵液濃度，以無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基為空白對(duì)照，每處理3次重復(fù)。依據(jù)上述方法，測(cè)定培養(yǎng)24 h原始發(fā)酵液中細(xì)菌菌體濃度后再稀釋到1.5×105～1.5×109CFU/mL用于試驗(yàn)。

采用浸葉飼喂法（蘇造堂等，2020）飼喂馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲。先將馬鈴薯植株復(fù)葉葉片在配置成不同濃度的細(xì)菌發(fā)酵液中分別浸漬30 s，將葉片取出自然風(fēng)干后放置在滅菌培養(yǎng)皿中（培養(yǎng)皿直徑為15 cm，墊1層吸水紙），并在葉片莖稈尾部包裹濕潤(rùn)脫脂棉以保持葉片水分，挑取20頭供試馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲置于葉片表面，保鮮膜封口，并扎一定數(shù)量的小孔透氣，在恒溫光照培養(yǎng)箱中28 ℃、濕度75%條件下培養(yǎng)。每株菌株發(fā)酵液不同濃度處理均設(shè)3個(gè)重復(fù)，以無(wú)菌LB液體培養(yǎng)基浸泡葉片為對(duì)照（CK）。

1.4.2 馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵上清液殺蟲活性測(cè)定 細(xì)菌發(fā)酵液的制備同1.4.1，將培養(yǎng)好的供試菌株發(fā)酵液配置為菌體濃度1.5×109CFU/mL，將發(fā)酵液在10000 r/min條件下離心10 min，最后用無(wú)菌注射器將上清液吸出使其通過(guò)孔徑大小為0.22 μm無(wú)菌濾膜，以獲得無(wú)菌發(fā)酵上清液（許守濤等，2018），采用浸葉飼喂法測(cè)定其對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力。

1.4.3 馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌菌懸液的殺蟲活性測(cè)定將供試細(xì)菌菌株接種在LB固體培養(yǎng)基上活化培養(yǎng)2 d，用含有0.05%吐溫-80的無(wú)菌水把培養(yǎng)好的菌落沖洗于無(wú)菌三角瓶中，在搖床180 r/min條件下充分振蕩均勻（徐超等，2019），采用1.4.1方法測(cè)定菌懸液濃度，再將其配置為菌體濃度1.5×109CFU/mL，采用浸葉飼喂法測(cè)定其對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力。

1.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)供試菌株測(cè)序結(jié)果用Contigexpress軟件進(jìn)行拼接、校對(duì)處理，把拼接好的16S rDNA序列提交至NCBI，查找并下載數(shù)據(jù)庫(kù)中同源性最高的部分菌株序列。采用MEGA 7.0，運(yùn)用鄰接法（Neighbour-joining）及Kimura’s 2-parameter矯正模型構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)行1000次Bootstrap驗(yàn)證。

用Excel 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，采用DPS version 7.05的Duncan’s新復(fù)極差法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析，采用生物測(cè)定模塊分析不同處理毒力測(cè)定數(shù)據(jù)，計(jì)算毒力回歸方程、致死中時(shí)間（LT50）和致死中濃度（LC50）。

2 結(jié)果與分析

2.1 馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌分離和鑒定結(jié)果

從馬鈴薯品種麗薯6號(hào)葉片中分離到1株內(nèi)生細(xì)菌，編號(hào)QL1；在28 ℃光照培養(yǎng)箱條件下經(jīng)LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌株QL1菌落呈近似圓形，淡白色，不透明，微隆起，邊緣規(guī)則，表面干燥粗糙，革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體為桿狀（圖1-A和圖1-B），與已報(bào)道的蘇云金芽孢桿菌（B.thuringiensis）相同（胡虓等，2020）。從馬鈴薯品種會(huì)-2葉片中分離到1株內(nèi)生細(xì)菌，編號(hào)YH2；在28 ℃光照培養(yǎng)箱條件下經(jīng)LB固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，菌株YH2菌落呈圓形，橙色，不透明，隆起，邊緣規(guī)則，表面濕潤(rùn)，革蘭氏染色陽(yáng)性，菌體為短桿狀（圖1-C和圖1-D），與已報(bào)道的帶化紅球菌（R.fascians）相同（Radhika et al.，2015）。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌菌株QL1和YH2菌落形態(tài)及革蘭氏染色Fig.1 Colony morphology and Gram staining of endophytic bacteria strains QL1 and YH2

將菌株QL1和YH2測(cè)序結(jié)果校對(duì)拼接后分別提交GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株QL1與3株蘇云金芽孢桿菌的相似性達(dá)99.79%以上，菌株YH2與2株帶化紅球菌的相似性達(dá)99.54%以上。從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖2）可看出，菌株QL1先與3株蘇云金芽孢桿菌聚為一支，且4株菌處在同一個(gè)分支長(zhǎng)度上，然后再與其他芽孢桿菌屬的菌株聚合，表明菌株QL1與蘇云金芽孢桿菌的親緣關(guān)系很近，結(jié)合形態(tài)特征等確定菌株QL1為厚壁菌門芽孢桿菌屬的蘇云金芽孢桿菌。從系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)（圖3）可看出，菌株YH2先與2株帶化紅球菌聚為一支，且3株菌處在同一個(gè)分支長(zhǎng)度上，然后再與其他紅球菌屬的菌株聚合，表明菌株YH2與帶化紅球菌的親緣關(guān)系很近，結(jié)合形態(tài)特征等確定菌株YH2為放線菌門紅球菌屬的帶化紅球菌。

圖2 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株QL1系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of strain QL1 based on 16S rDNA sequence

圖3 基于16S rDNA序列構(gòu)建的菌株YH2系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Fig.3 Phylogenetic tree of strain YH2 based on 16S rDNA sequences

2.2 馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的殺蟲活性

2.2.1 細(xì)菌發(fā)酵液濃度 2種細(xì)菌發(fā)酵液在搖床28 ℃，180 r/mim條件下培養(yǎng)24 h后用紫外分光光度計(jì)測(cè)得菌株QL1的OD600均值為0.97，對(duì)應(yīng)涂布法濃度為1.5×109CFU/mL；菌株YH2的OD600均值為0.98，對(duì)應(yīng)涂布法濃度為1.8×109CFU/mL。

2.2.2 菌株QL1發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力 菌株QL1各濃度發(fā)酵液處理后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高；第3 d開(kāi)始所有濃度處理幼蟲的累積死亡率均顯著高于對(duì)照（P＜0.05，下同）；處理后第7 d，菌株QL1發(fā)酵液濃度1.5×105～1.5×109CFU/mL處理下幼蟲的累積死亡率分別為60.00%、66.67%、73.33%、75.00%和81.67%（表1）。

表1 菌株QL1不同濃度發(fā)酵液處理后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率Table 1 Cumulative mortality rate of P.operculella 3rd instar larvae treated with strain QL1 fermentation broth of different concentrations

運(yùn)用DPS進(jìn)行生物測(cè)定，結(jié)果顯示，以濃度為1.5×105～1.5×109CFU/mL的菌株QL1發(fā)酵液處理馬鈴薯葉片，馬鈴薯塊莖蛾取食7 d后的LT50在3.03～5.73 d，濃度最高時(shí)LT50最短，表明濃度越高對(duì)3齡幼蟲的殺蟲活性越強(qiáng)，毒力方程相關(guān)系數(shù)在0.982～0.992，毒力方程擬合程度較好（表2）。各濃度菌株QL1發(fā)酵液處理葉片后，馬鈴薯塊莖蛾取食第3、5和7 d的LC50分別為7.99×108、3.21×106和2.73×103CFU/mL，表明菌株QL1對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的致死作用表現(xiàn)出明顯的劑量與效應(yīng)關(guān)系，隨時(shí)間延長(zhǎng)LC50逐漸降低（表3）。

表2 菌株QL1不同濃度發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力（7 d）Table 2 Virulence of different concentrations of strain QL1 fermentation broth to the P.operculella 3rd instar larvae（7 d）

表3 不同處理時(shí)間菌株QL1發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力Table 3 Virulence of different treatment times of strain QL1 fermentation broth to the P.operculella 3rd instar larvae

從圖4可看出，處理1 d后，菌株QL1發(fā)酵液處理馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均顯著高于發(fā)酵上清液和菌懸液處理，而發(fā)酵上清液和菌懸液處理間無(wú)顯著差異（P＞0.05，下同）；從處理第4 d起，3種處理對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均顯著高于對(duì)照；在第7 d時(shí)，菌株發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌懸液處理對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率分別達(dá)81.67%、50.00%和60.00%。

圖4 取食菌株QL1不同溶液后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率Fig.4 Daily cumulative mortality rate of P.operculella 3rd instar larvae after feeding different solutions of strain QL1

2.2.3 菌株YH2發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力 以濃度為1.5×105～1.5×109CFU/mL的菌株YH2發(fā)酵液處理馬鈴薯葉片，馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲取食后的累積死亡率均隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)而逐漸升高，第3 d開(kāi)始所有濃度處理馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均顯著高于對(duì)照；處理后第7 d，菌株YH2發(fā)酵液濃度1.5×105～1.5×109CFU/mL處理造成該幼蟲的累積死亡率分別為48.33%、53.33%、55.00%、61.67%和65.00%，除最低濃度發(fā)酵液處理外，其他濃度處理后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率間無(wú)顯著差異（表4）。

表4 菌株YH2不同濃度發(fā)酵液處理后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率Table 4 Cumulative mortality rate of P. operculella 3rd instars larvae treated by different concentrations of strain YH2 fermentation broth

運(yùn)用DPS進(jìn)行生物測(cè)定，由數(shù)量型數(shù)據(jù)機(jī)制分析可知，以濃度為1.5×105～1.5×109CFU/mL的菌株YH2發(fā)酵液處理馬鈴葉片，馬鈴薯塊莖蛾取食7 d后LT50在5.58～7.07 d，濃度最高時(shí)LT50最短，但不同濃度處理間LT50差距不明顯，毒力方程相關(guān)系數(shù)在0.965～0.991，毒力方程擬合程度較好；1.5×105CFU/mL的發(fā)酵液處理因致死率低于50.00%，故無(wú)法估算LT50（表5）。此外，菌株YH2菌體無(wú)顯著致死效應(yīng)，因此無(wú)法以菌體濃度來(lái)估算其對(duì)馬鈴薯塊莖蛾幼蟲的LC50。

表5 菌株YH2不同濃度發(fā)酵液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力（7 d）Table 5 The toxicity of different concentrations of strain YH2 fermentation broth to the P.operculella 3rd instar larvae（7 d）

從圖5可看出，在處理第7 d時(shí)，菌株YH2發(fā)酵液和發(fā)酵上清液處理對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率間無(wú)顯著差異，且均顯著高于菌懸液和對(duì)照處理；從第3 d后，發(fā)酵液處理的累積死亡率一直為3種處理中最高，且3種處理對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率均顯著高于對(duì)照處理；在第7 d時(shí)，菌株YH2發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌懸液處理對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率分別達(dá)65.00%、55.00%和38.33%。

圖5 取食菌株YH2不同溶液后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率Fig.5 Daily cumulative mortality rate of P.operculella 3rd instar larvae after being fed with different solutions of strain YH2

2.2.4 菌株QL1和YH2不同溶液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒力差異 比較供試菌株QL1和YH2不同溶液處理馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲7 d后的毒力差異，結(jié)果（表6）顯示，菌株YH2發(fā)酵液處理后幼蟲的累積死亡率顯著低于菌株QL1發(fā)酵液處理；菌株QL1和YH2發(fā)酵上清液處理后其幼蟲的累積死亡率間無(wú)顯著差異；菌株YH2菌懸液處理后幼蟲的累積死亡率顯著低于菌株QL1菌懸液處理，且累積死亡率低于50.00%，無(wú)法估算其LT50。

表6 菌株QL1與YH2不同溶液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲累積死亡率的影響Table 6 Effects of different solutions of strains QL1 and YH2 on cumulative mortality rate of P.operculella 3rd instar larvae

3 討論

本研究從云南主栽馬鈴薯品種麗薯6號(hào)和會(huì)-2葉片中分別分離到對(duì)馬鈴薯塊莖蛾有殺蟲活性的內(nèi)生細(xì)菌芽孢桿菌屬的蘇云金芽孢桿菌QL1和紅球菌屬的帶化紅球菌YH2。當(dāng)前對(duì)馬鈴薯葉片內(nèi)生細(xì)菌的研究較少，在文獻(xiàn)報(bào)道的馬鈴薯塊莖內(nèi)生細(xì)菌研究中發(fā)現(xiàn)了與本研究供試菌株相同菌屬的細(xì)菌（戴超，2017；Liu et al.，2020），但未發(fā)現(xiàn)同一個(gè)種的內(nèi)生細(xì)菌，表明在不同馬鈴薯植株部位和品種，不同馬鈴薯種植地區(qū)和生長(zhǎng)環(huán)境等條件下可能存在同菌屬的內(nèi)生細(xì)菌，但因這些條件不同也使各馬鈴薯品種存在其獨(dú)有的內(nèi)生細(xì)菌種類。此外，在研究報(bào)道分離的馬鈴薯內(nèi)生細(xì)菌中，其功能主要有促進(jìn)和抑制馬鈴薯生長(zhǎng)、使植株致病或抑制病原菌的作用（Pageni et al.，2014；Istifadah et al.，2018；陳星伊等，2020），尚未發(fā)現(xiàn)對(duì)馬鈴薯塊莖蛾有殺蟲活性的內(nèi)生細(xì)菌。

本研究通過(guò)室內(nèi)生物測(cè)定發(fā)現(xiàn)，在1.5×109CFU/mL濃度下，菌株QL1和YH2發(fā)酵液處理7 d后馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的累積死亡率可達(dá)81.67%和65.00%，表明2種供試菌株對(duì)該幼蟲有較強(qiáng)的致死率。研究表明，菌株QL1和YH2對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒殺作用有明顯差異的同時(shí)也存在相似之處：2種菌株的不同溶液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲均有殺蟲活性，且均表現(xiàn)為發(fā)酵液殺蟲活性更強(qiáng)，菌懸液及發(fā)酵上清液?jiǎn)为?dú)使用對(duì)幼蟲的毒殺效果較發(fā)酵液低，該結(jié)果與粘質(zhì)沙雷氏菌對(duì)馬鈴薯塊莖蛾的殺蟲活性特點(diǎn)相似（蘇造堂等，2020），這可能是菌體在液體培養(yǎng)基中代謝產(chǎn)生了具有殺蟲活性的次生代謝產(chǎn)物被充分溶解，幼蟲取食后導(dǎo)致死亡率升高，但其具體原因還有待深入研究驗(yàn)證。此外，在處理第7 d時(shí)，菌株QL1菌懸液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲的毒殺效果高于發(fā)酵上清液處理，而菌株YH2則相反，其原因可能與幼蟲取食2種菌株后對(duì)其腸道微生物產(chǎn)生的影響有關(guān)，因?yàn)槔ハx腸道菌群的變化可對(duì)宿主的生長(zhǎng)代謝造成直接影響，甚至可導(dǎo)致疾病等（魏博帆等，2021）

蘇云金芽孢桿菌是一種傳統(tǒng)的殺蟲細(xì)菌，已開(kāi)發(fā)為害蟲生防產(chǎn)品用于多種農(nóng)林害蟲和衛(wèi)生害蟲的生物防治，此類細(xì)菌也被應(yīng)用于防治馬鈴薯塊莖蛾（杜霞等，2021），可在馬鈴薯收獲前施用以抵御馬鈴薯塊莖蛾幼蟲在田間對(duì)塊莖的侵害，已成為印度、秘魯和埃及等國(guó)家防治馬鈴薯塊莖蛾的重要藥劑（Aryal and Jung，2015）。本研究從馬鈴薯葉片中分離獲得的蘇云金芽孢桿菌QL1，其不同溶液對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲均具有較強(qiáng)的殺蟲活性。紅球菌屬的細(xì)菌種類豐富、分布廣泛、代謝功能多樣，具有的酶種類豐富，可降解許多合成或天然的有機(jī)化合物（吳金芳等，2022），但鮮有對(duì)防治蟲害方面的研究報(bào)道。帶化紅球菌作為植物內(nèi)生菌時(shí)可釋放多種細(xì)胞分裂素對(duì)寄主植物形態(tài)造成顯著影響，還可引起寄主植物一系列的疾病癥狀（Jameson，2019）。而本研究分離到的帶化紅球菌YH2發(fā)酵液和發(fā)酵上清液飼喂馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲后，其致死率均可達(dá)50.00%以上。

4 結(jié)論

從云南2種馬鈴薯主栽品種麗薯6號(hào)和會(huì)-2葉片中分別分離到內(nèi)生細(xì)菌菌株QL1和YH2，2種菌株配制的3種溶液（發(fā)酵液、發(fā)酵上清液和菌懸液）對(duì)馬鈴薯塊莖蛾3齡幼蟲均有較強(qiáng)的殺蟲活性，可作為馬鈴薯塊莖蛾生防制劑開(kāi)發(fā)的潛力菌株。