闕任燁，沈艷婷，林柳兵，李 勇

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院，上海 200071)

膽汁反流性胃炎是由于多種原因?qū)е率改c胃反流現(xiàn)象異常增多，引起胃黏膜損傷的一種疾病[1]。納達合劑是上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬市中醫(yī)醫(yī)院余莉芳老中醫(yī)擬定的經(jīng)驗方，功效為養(yǎng)陰清胃、降逆理氣，廣泛應(yīng)用于慢性胃炎患者，包括慢性淺表性胃炎、膽汁反流性胃炎、非潰瘍性消化不良等[2]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)納達合劑不僅具有顯著的促胃腸動力作用及免疫調(diào)節(jié)作用[3-5]，還具有顯著的胃黏膜保護作用，其機制可能與抑制線粒體損傷引起的胃黏膜細胞凋亡有關(guān)[6-7]。不僅如此，納達合劑亦能夠顯著抑制炎癥因子的合成與分泌，減輕胃黏膜炎癥[8]，但其作用機制尚不明確。NLRP3炎性體和炎癥性疾病的關(guān)系已被日益增多的研究所報道，但其在膽汁反流性胃炎中所扮演的角色至今尚未闡明。因此，為了深入探討納達合劑抑制胃黏膜炎癥的作用機制，本研究通過大鼠膽汁反流性胃炎模型，觀察了納達合劑對活性氧(ROS)及其下游NLRP3炎性體表達的影響。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 清潔級雄性SD大鼠60只，體重180～220 g，購自上海實驗動物中心。動物合格證號：(20170005031492)。清潔級動物房飼養(yǎng)，恒溫(25±2)℃恒濕，人工光照12 h、黑暗12 h，自由進食飲水。

1.2藥物、試劑與儀器 納達合劑(上海市中醫(yī)醫(yī)院制劑科提供，由北沙參、玉竹、天花粉、麥冬、制半夏、廣木香、枳殼、延胡索、代赭石、黃連、黃芩、蒲公英、芙蓉葉、甘草等組成)，麥滋林(日本壽制藥株式會社)；牛膽酸鈉(上海源葉生物科技有限公司)，胰酶(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)，卵磷脂(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)；NLRP3、凋亡相關(guān)斑點樣蛋白(ASC)抗體(Santa Cruz公司)，β-actin、炎性半胱天冬酶-1(Caspase-1)、山羊抗兔HRP標記二抗、山羊抗鼠HRP標記二抗(Cell signaling公司)，NLRP3、ASC、Caspase-1引物(上海生工生物公司)，TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SybrGreen Real-time PCR Master Mix(Takara公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Millipore公司)，蛋白質(zhì)分子量預(yù)染Marker、MitoSOX Red線粒體ROS檢測試劑盒(Thermo scientific公司)，組織線粒體分離試劑盒(碧云天公司)，大鼠白細胞介素-1β (IL-1β)、白細胞介素-18 (IL-18) ELISA試劑盒(上海西唐公司)。Neofuge 15R型臺式高速冷凍離心機(Heal force公司)，Var10skan Flash熒光酶標儀(Thermo scientific公司)，Wellwash 4mk2型洗板機(Labsystems dragon公司)，JX-FSTPRP-48型電動勻漿機(上海凈信公司)，微型垂直電泳、電轉(zhuǎn)移系統(tǒng)、ChemiDocTM XRS+自動顯影系統(tǒng)、CFX96TM Real-Time system、S1000TM Thermal cycler(Bio-Rad公司)。

1.3藥物配制 ①反流液的配制：將牛膽酸鈉5 g、胰酶3 g、卵磷脂0.5 g溶于雙蒸水200 mL中，充分攪拌并混勻，現(xiàn)用現(xiàn)配。②納達合劑的配制：納達合劑以臨床成人用量的5倍、10倍、15倍濃縮成低、中、高劑量，現(xiàn)用現(xiàn)配。③麥滋林的配制：將1袋(0.67 g)麥滋林溶于30 mL生理鹽水中，配制成約22 mg/mL的麥滋林藥液，現(xiàn)用現(xiàn)配。

1.4實驗方法 根據(jù)大鼠體重將其隨機分為6組，每組10只。對照組給予生理鹽水15 mL/kg灌胃8周，模型組和各藥物組給予反流液15 mL/kg灌胃8周；從第5周開始，對照組和模型組給予生理鹽水15 mL/kg灌胃，納達低、中、高劑量組分別給予12.75 g生藥/kg、25.5 g生藥/kg、38.25 g生藥/kg納達合劑灌胃，麥滋林組給予0.33 g/kg麥滋林藥液灌胃，均1次/d，連續(xù)4周。

1.5檢測指標及方法

1.5.1線粒體分離及ROS檢測 實驗結(jié)束后，麻醉處死各組大鼠，剪取50 mg新鮮胃組織(于冰上保存)，PBS洗滌后用剪刀剪碎；加入500 μL 4 ℃的含PMSF的線粒體分離試劑A后電動勻漿，60 s/次，共3次；將勻漿于4 ℃下600×g離心5 min后將上清液吸至新的EP管中，再4 ℃下11 000×g離心10 min，取沉淀物；將分離的線粒體重懸于40 μL的線粒體貯存液中；在黑色96孔板中毎孔加入300 μL MitoSOX探針工作液及10 μL重懸的線粒體，37 ℃避光孵育30 min；用HBSS/Ca/Mg溶液洗滌3次，加入適量緩沖液，用熒光酶標儀檢測，將激發(fā)光與發(fā)射光分別設(shè)置為510 nm及580 nm波長。

1.5.2胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達檢測 采用Real-time PCR法檢測：取適量大鼠胃黏膜組織，加入TRIzol研磨離心取上清，提取總RNA，Nanodrop2000檢測RNA的純度和濃度，各組取2 μL總RNA，按20 μL總反應(yīng)體積，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后以cDNA為模板分別進行PCR擴增，引物序列：NLRP3上游5’-CGG TGA CCT TGT GTG TGC TT-3’，下游5’-TCA TGT CCT GAG CCA TGG AAG-3’；ASC上游 5’-AGA CAT GGG CAT ACA GGA GC-3’，下游5’-GCAATGAGT GCT TGC CTG TG-3’；Caspase -1上游5’-GAA CAA AGA AGG TGG CGC AT-3’，下游5’-AGA CGT GTA CGA GTG GGT CT-3’；β-actin上游5’-TTG TAA CCA ACT GGG ACG ATA TGG-3’，下游5’-GAT CTT GAT CTT CAT GGT GCT AGG-3’。采用三步法進行PCR擴增，反應(yīng)結(jié)束后，得到各樣本Ct值，然后利用2-△△Ct計算各組基因的相對表達量。

1.6胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達檢測 采用Western blot法檢測：取大鼠胃黏膜組織，裂解后提蛋白，使用BCA蛋白試劑盒檢測蛋白含量。以SDS-PAGE凝膠(5%濃縮膠，12%分離膠)進行電泳分離膠分離蛋白，并通過半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至PVDF膜，PVDF膜經(jīng)5%的脫脂奶粉搖床上慢搖2 h封閉，分別與NLRP3抗體、ASC抗體、Caspase-1抗體、β-actin抗體4 ℃過夜，室溫孵育二抗2 h，ECL光化學(xué)顯色。 最后應(yīng)用Image J分析軟件對掃描條帶進行定量分析，計算各蛋白相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1各組大鼠胃黏膜線粒體ROS含量比較 模型組大鼠胃黏膜線粒體ROS含量顯著高于對照組(P<0.05)；麥滋林組和納達低、中、高劑量組大鼠胃黏膜線粒體ROS含量均顯著低于模型組(P均<0.05)，且納達各組ROS含量呈劑量依賴性降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖1。

圖1 對照組和膽汁反流性胃炎各組大鼠胃黏膜線粒體ROS含量比較(10只/組)

2.2各組大鼠胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達量比較 模型組大鼠胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA相對表達量均顯著高于對照組(P均<0.05)；麥滋林組和納達低、中、高劑量組大鼠胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA相對表達量均顯著低于模型組(P均<0.05)，且納達各組各指標呈劑量依賴性降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖2。

圖2 對照組和膽汁反流性胃炎各組大鼠胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA表達情況(10只/組)

2.3各組大鼠胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達情況 模型組大鼠胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白相對表達量均顯著高于對照組(P均<0.05)；麥滋林組和納達低、中、高劑量組大鼠胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白相對表達量均顯著低于模型組(P均<0.05)，且納達各組各指標呈劑量依賴性降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖3。

圖3 對照組和膽汁反流性胃炎各組大鼠胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 蛋白表達情況(10只/組)

2.4各組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、IL-18含量比較 模型組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、IL-18含量均顯著高于對照組(P均<0.05)；麥滋林組和納達低、中、高劑量組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、IL-18含量均顯著低于模型組(P均<0.05)，且納達各組各指標呈劑量依賴性降低，兩兩比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均<0.05)。見圖4。

圖4 對照組和膽汁反流性胃炎各組大鼠胃黏膜組織中IL-1β、IL-18含量比較(10只/組)

3 討 論

炎性體由Nod樣受體(Nod-like receptors，NLR)家族的部分成員(NLRP1、NLRC4、NLRP3、NAIP5和NLRC5)組成，它通過參與炎癥的發(fā)生發(fā)展及調(diào)控細胞存活對機體固有免疫和炎癥性疾病發(fā)揮十分重要的調(diào)節(jié)作用，是目前炎癥性疾病研究領(lǐng)域的焦點和熱點。其中NLRP3炎性體是一類相對分子質(zhì)量約為70萬的大分子蛋白復(fù)合體，由NLRP3、ASC和Caspase-1組成，具有感受內(nèi)外源性傷害性刺激的能力，可對多種理化刺激發(fā)生應(yīng)答，是目前報道最多、最為重要的炎性體之一。NLRP3炎性體通過激活Caspase-1，誘導(dǎo)IL-1β和 IL-18的切割和釋放，進而引起一系列生物學(xué)反應(yīng)，參與機體的固有免疫反應(yīng)，并且介導(dǎo)宿主細胞形成細胞膜微孔，導(dǎo)致細胞腫脹和滲透性溶解，形成一種介于壞死和凋亡之間的細胞死亡形式，稱為“pyroptosis”[9]。與凋亡不同，pyroptosis依賴于Caspase-1的激活，其特征為細胞膜上形成微孔和囊泡，細胞腫脹、破裂，分泌促炎癥反應(yīng)細胞因子和釋放細胞質(zhì)成分至細胞外而引起炎癥反應(yīng)，是促炎癥反應(yīng)的細胞死亡方式。

目前提出的NLRP3 炎性體活化途徑主要有3種：第一，鉀離子的外流。細胞外ATP通過激活質(zhì)膜上的P2X7嘌呤能受體，誘導(dǎo)與其相關(guān)的離子通道開放，促使K+流向膜外，Ca2+流向膜內(nèi)，開放質(zhì)膜表面與縫隙連接蛋白Pannexin-1相關(guān)的跨膜通道，使相應(yīng)配體轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)活化NLRP3 炎性體[10]。第二，溶酶體破壞。晶體類成分吞噬入細胞后，可損傷溶酶體，另其中所含的組織蛋白酶B游離至細胞質(zhì)中，經(jīng)由一定的方式活化NLRP3炎性體。但是此機制僅對晶體有特異性，ATP與細菌毒素介導(dǎo)的炎性小體激活并不是依賴溶酶體的破壞[11]。第三，線粒體ROS生成。所有已知的NLRP3 炎性體激活劑都能導(dǎo)致ROS 的生成。有研究表明，活化NLRP3炎性體的關(guān)鍵信號ROS是由線粒體損傷后產(chǎn)生的[12]。目前，線粒體ROS激活NLRP3炎性體的過程已被許多動物模型(結(jié)腸炎、間質(zhì)性腎炎)[13-14]及細胞模型(巨噬細胞、支氣管上皮細胞)[15-16]所證實，線粒體ROS生成是NLRP3炎性體活化的最主要途徑。

目前研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎性體的激活在非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、肝臟缺血再灌注損傷、藥物性肝損傷及肝纖維化等急慢性肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過程中具有關(guān)鍵的作用[17-21]。Cronstein等[22]發(fā)現(xiàn)，在痛風(fēng)發(fā)病的過程中，晶體激活NLRP3炎性體，產(chǎn)生IL-1β，導(dǎo)致中性粒細胞向滑膜以及關(guān)節(jié)液中聚集。Heneka等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在小鼠阿爾茨海默病(AD)模型中，NLRP3基因敲除后，β-淀粉樣蛋白沉積顯著減少，小鼠的空間記憶能力得到改善。Parajuli 等[24]報道，AD的發(fā)生機制可能與NLRP3活化后引發(fā)的炎性反應(yīng)和腦組織損傷相關(guān)。Duewell等[25]報道，動脈粥樣硬化(AS)斑塊中的膽固醇結(jié)晶可誘導(dǎo)NLRP3的激活，導(dǎo)致IL-1β的成熟與分泌，而在AS始動環(huán)節(jié)中IL-1β具有重要作用。Yang等[26]發(fā)現(xiàn)，在2型糖尿病中胰島淀粉樣多肽能直接活化NLRP3 炎性小體，其誘使巨噬細胞釋放IL-1β，從而造成炎癥反應(yīng)。Takahashi等[27]發(fā)現(xiàn)，受損心肌細胞可以通過釋放ATP，進而激活NLRP3炎性小體，促使IL-1β和IL-18的釋放，引起心肌的炎性損傷。然而，現(xiàn)階段線粒體ROS-NLRP3信號通路在胃黏膜炎癥中所起的作用仍處于空白階段。

納達合劑方中北沙參益胃生津，玉竹滋陰潤燥、生津止渴，麥冬滋養(yǎng)胃陰、生津，天花粉清熱、生津，四味共用為君藥，起濡養(yǎng)陰液、清熱養(yǎng)胃之功效；胃以通為順，故方中用制半夏降逆和胃，代赭石重鎮(zhèn)降逆，枳殼理氣寬中、行滯消脹，廣木香行氣止痛、健脾和胃，延胡索疏肝理氣、活血止痛，五藥共為臣藥，達補而不膩之功效；氣郁化熱，熱者寒之，故方選黃連、黃芩、蒲公英等苦寒之物共為佐藥，以清胃中郁熱；甘草為使，調(diào)和諸藥。諸藥配伍，濡養(yǎng)胃陰、通降氣機、清解郁熱，集潤、行、降、化、清于一爐，臨床用于治療膽汁反流性胃炎效果滿意。本研究利用膽汁反流性胃炎大鼠模型，探討了線粒體ROS-NLRP3信號通路介導(dǎo)的胃黏膜炎癥反應(yīng)機制以及納達合劑的干預(yù)作用，進一步發(fā)掘納達合劑抑制炎癥作用的新機制。

本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠胃黏膜線粒體ROS含量，胃黏膜組織中NLRP3、ASC、Caspase-1 mRNA和蛋白表達量，胃黏膜組織中IL-1β、IL-18含量均顯著高于對照組，提示ROS-NLRP3通路介導(dǎo)膽汁反流性胃炎的胃黏膜炎癥反應(yīng)；納達各劑量組上述各指標均顯著低于模型組，提示納達合劑可以顯著抑制ROS-NLRP3通路，這可能是其抑制胃黏膜炎癥的重要機制。本研究不僅對膽汁反流性胃炎的發(fā)病機制作出一定的探索，并且為中藥復(fù)方納達合劑的臨床應(yīng)用提供了現(xiàn)代分子生物學(xué)基礎(chǔ)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。