肖毓淼， 王旭承， 崔永一*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 集賢學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江農(nóng)林大學(xué) 農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311300)

蘭科植物主產(chǎn)于熱帶及亞熱帶地區(qū)，具有較高的觀賞與經(jīng)濟價值，種類豐富，各具特點[1]。雜交蘭K6由大花蕙蘭皇后和春蘭黃水仙雜交培育而成，雜交性狀優(yōu)良，花型典雅，花色鮮艷，觀賞價值高，具有較高的市場前景[2]。姚金澳等[3]研究發(fā)現(xiàn)，適當(dāng)濃度的生長調(diào)節(jié)劑、防褐化物質(zhì)，以及不同種類有機添加物可提高組培苗的性狀與質(zhì)量。雜交蘭K6的母本大花蕙蘭喜溫暖環(huán)境，生長適溫為15～20 ℃，低于5 ℃則發(fā)芽期延長，生長受阻[4]；其父本春蘭生長適溫為15～25 ℃，低于10 ℃則生長緩慢，0 ℃時會發(fā)生凍害[5]。其組培苗馴化成活率低，植株纖弱，開花延遲，更易受高低溫、干旱、水澇、病原菌等逆境脅迫的傷害，其中溫度對雜交蘭的生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用，低溫冷害也是雜交蘭栽培過程中常遇到的自然災(zāi)害之一，制約著雜交蘭產(chǎn)業(yè)的發(fā)展[2]。

海藻富含多種營養(yǎng)成分，包括維生素、多糖、藻朊酸、甘露醇、甜菜堿、高度不飽和脂肪酸、抗生素及多種天然植物激素等[6]，以海藻提取物為原料的海藻肥已在中國有機食品技術(shù)規(guī)范中被明確認定為有機農(nóng)業(yè)的應(yīng)用產(chǎn)品[7]。海藻肥已被證實能有效幫助植物緩解抵御非生物逆境脅迫，如干旱、低溫、鹽堿等[8]。管宇翔等[9]研究發(fā)現(xiàn)，海藻肥處理能提高黃瓜葉片相對含水量和葉綠素含量，提高SOD和POD的活性。孫錦等[10]研究發(fā)現(xiàn)，噴施海藻肥可顯著提高番茄幼苗的抗旱性。羅增濤等[11]發(fā)現(xiàn)，噴施海藻肥的黃瓜試驗苗在低溫脅迫下葉片相對含水量、葉綠素含量、呼吸強度和氣孔阻力均顯著大于對照苗，而葉片蒸騰強度低于對照苗。綜上表明，海藻肥能影響逆境脅迫下植株的生理生化特性，增強抗逆能力。

海藻肥作為一種新型生物有機肥，尚未見其施用于雜交蘭的研究報道，而低溫脅迫在一定程度上制約著雜交蘭組培苗的生長分化。本研究將海藻肥噴施處理雜交蘭K6幼苗，通過對植株活性氧、MDA含量及抗氧化酶活性的測定，表征其對雜交蘭抗低溫能力的影響，同時該研究為海藻肥在雜交蘭種苗生產(chǎn)上的應(yīng)用提供了新的方向。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試植株為浙江農(nóng)林大學(xué)組織培養(yǎng)實驗室提供的K6雜交蘭組培苗，為大花蕙蘭皇后(Cymbidiumhybridumcv. Princess Nobuko♀)和春蘭黃水仙(Cymbidiumgoeringiicv. Huangshuixian♂)雜交培育而成，K6幼苗為本試驗初始培養(yǎng)材料。海藻肥由杭州青洋科技有限公司提供，主要成分為海藻多糖、海藻多酚、微量元素等。

1.2 處理設(shè)計

試驗于2020年7—12月在浙江農(nóng)林大學(xué)智能溫室中進行，栽培基質(zhì)由松鱗、泥炭、蛭石按3∶1∶1的比例配制。

將海藻肥稀釋成1 500(T1)、1 000(T2)、500倍(T3)共3個濃度處理，以清水噴施為對照(CK)。采用完全隨機試驗，每處理20盆苗，重復(fù)3次，噴施間隔為7 d，每處理每次噴施海藻肥1 500 mL。

連續(xù)處理6個月，待冬季寒潮來臨時，將所有處理組植株進行低溫脅迫處理。上午8：00先將其從智能溫室移至室外，并用實時溫度儀監(jiān)控氣溫，此時室外平均溫度為0 ℃，然后分別于10：00、14：00、18：00作為3次取樣時間，挑選長勢健壯、生長均勻的植株10盆，隨機取各處理植株的葉片，以液氮速凍后保存于-70 ℃超低溫冰箱，供各項生理指標(biāo)測定。

1.3 生理指標(biāo)的測定方法

葉綠素總量測定采用乙醇浸提法[12]；過氧化物酶(POD)活性測定采用愈創(chuàng)木酚法[13]；超氧化物歧化酶(SOD)活性測定采用氮藍四唑光化還原法[14]；丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸比色法[15]；過氧化氫(H2O2)含量測定采用林植芳等[15]的方法。

1.4 數(shù)據(jù)分析

以上指標(biāo)重復(fù)測定3次，取平均值。將上述測得的數(shù)據(jù)在SPSS 26.0軟件中進行顯著性檢驗，采用Duncan’s進行多重比較顯著性水平，利用Excel軟件繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 海藻肥對低溫脅迫下雜交蘭葉綠素總量的影響

葉綠素含量和比例是反映植物光合能力的間接指標(biāo)[16]。由圖1可知，雜交蘭經(jīng)2 h低溫脅迫后，CK處理葉片的葉綠素含量顯著大于T1、T2、T3處理，然而CK處理經(jīng)過6 h、10 h低溫脅迫后，葉片的葉綠素含量均顯著小于T1、T2、T3處理。雖然海藻肥常溫下可能抑制了葉片葉綠素的合成，但在低溫脅迫6 h后，3組不同稀釋倍數(shù)的海藻肥處理的植株葉片的葉綠素含量均顯著大于對照，說明噴施3種不同濃度海藻肥對于雜交蘭低溫脅迫下葉綠素的降解均具有緩解作用。經(jīng)2、6 h低溫脅迫時，T1處理的葉片葉綠素含量顯著大于T2、T3處理，經(jīng)10 h低溫脅迫后，T3處理的葉片葉綠素含量顯著大于T2，T2處理的葉片葉綠素含量顯著大于T1，說明雜交蘭在較長時間的低溫脅迫下，濃度較高的T3處理對于葉片葉綠素的降解具有更好的緩解作用。

柱上不同小寫字母表示組間0.05水平上差異顯著。圖2、3同。圖1 海藻肥對低溫脅迫下雜交蘭葉綠素總量的影響

2.2 海藻肥對低溫脅迫下雜交蘭細胞膜損傷的影響

2.2.1 海藻肥對低溫脅迫下MDA含量的影響

圖2顯示，在不同低溫處理時間下，CK組的MDA含量持續(xù)增加，至低溫脅迫10 h時達到最大值。T1、T2、T3組MDA含量在低溫脅迫2 h時達到最大值，之后持續(xù)下降，在低溫脅迫6 h時達到最低值，之后呈緩慢上升的趨勢。

在相同的處理時間下，不同處理組之間也存在差異。低溫脅迫2 h時，各處理組間MDA含量無顯著差異；在6 h時，海藻肥處理的MDA含量均顯著小于CK，其中，T1、T2間差異不顯著，均顯著高于T3；在10 h時，T2、T3的MDA含量顯著小于CK，其中，T1、T2差異不顯著，均顯著高于T3，而T1與CK無顯著性差異。

2.2.2 海藻肥對低溫脅迫下H2O2含量的影響

圖2顯示，從低溫處理的不同時間來看，各處理的H2O2含量均隨著處理時間的延長而提升，并在10 h時達到最大。從相同處理時間看，在低溫脅迫2 h時，各處理之間H2O2含量無顯著性差異；在6 h時，海藻肥處理的H2O2含量均顯著低于CK，并分別較CK組下降17.73%、19.85%、33.99%；在10 h時，海藻肥處理的H2O2含量均顯著低于CK，并分別較CK組下降20.48%、26.10%、31.05%。

圖2 海藻肥低溫脅迫下對雜交蘭細胞膜損傷的影響

2.3 海藻肥對低溫脅迫下雜交蘭抗氧化酶的影響

2.3.1 海藻肥對低溫脅迫下POD活性的影響

圖3顯示，從低溫處理的不同時間來看，各處理的POD活性均隨著處理時間延長而提升，并在10 h時達到最大。從相同處理時間看，在2 h、6 h、10 h低溫處理時，海藻肥處理的POD活性均顯著大于CK。從海藻肥處理之間來看，在2 h時，T2顯著大于T1、T3；在6 h時，T2、T1顯著大于T3；在10 h時，T1、T2、T3之間無顯著性差異。

圖3 海藻肥對低溫脅迫下雜交蘭抗氧化酶的影響

2.3.2 海藻肥對低溫脅迫下SOD活性的影響

圖3顯示，從低溫處理的不同時間來看，各處理的SOD活性均隨著處理時間延長而提升，并在10 h時達到最大。從相同處理時間來看，在2、6、10 h低溫處理時，3個海藻肥處理的SOD活性均顯著大于CK。從3個海藻肥處理之間來看，在2 h時，T2顯著大于T1，而T3與T1、T2間無顯著性差異；在6 h時，T2、T3顯著大于T1；在10 h時，T2顯著大于T1、T3，T1顯著大于T3。

3 討論

3.1 海藻肥對低溫脅迫下雜交蘭葉綠素總量的影響

葉綠素含量與植株的光合作用能力、發(fā)育階段具有較好的相關(guān)性，通常是光合能力和植株發(fā)育階段的指示器，因此，葉綠素含量是作為監(jiān)測低溫脅迫后植株生長健康狀況的重要指標(biāo)之一[17]。宋修超等[18]向低溫脅迫下菜椒葉苗噴施6種不同濃度海藻酸有機水溶肥料發(fā)現(xiàn)，葉綠素含量均不同程度地提高。趙建鋒等[19]研究發(fā)現(xiàn)，草莓葉片隨著海藻肥稀釋倍數(shù)的減小，葉片葉綠素含量增多，且稀釋400倍時，草莓葉片葉綠素含量最高，這與本研究的試驗結(jié)果基本一致，說明較高濃度海藻肥能促進葉綠素合成。本試驗中，雜交蘭葉片經(jīng)低溫脅迫后，葉綠素的分解隨海藻肥濃度減小而減小，說明海藻肥對低溫脅迫下雜交蘭葉片葉綠素分解具有緩解作用。

3.2 海藻肥對低溫脅迫下雜交蘭細胞膜損傷和抗氧化酶活性的影響

植物在遭受低溫脅迫時，活性氧代謝平衡易被打破，在植物組織中大量積累。在此過程中，氧易得到單電子而形成超氧陰離子，并發(fā)生自由基連鎖反應(yīng)，經(jīng)過一系列代謝反應(yīng)生成H2O2，并在細胞內(nèi)發(fā)生哈伯-維斯(Haber-Weiss)反應(yīng)，產(chǎn)生羥基自由基(OH-)，其高度活躍，能氧化細胞內(nèi)幾乎所有組分，引發(fā)細胞損傷[20]。同時，活性氧的大量積蓄，容易破壞細胞膜系統(tǒng)，加重膜脂質(zhì)的過氧化，產(chǎn)生MDA[21]。因此，及時清除H2O2和維持較低的MDA水平能使植株保持正常的生理活動，提高植物的抗低溫脅迫能力。本試驗中，在同一處理時間內(nèi)，處理組H2O2含量和MDA含量都顯著小于對照組，其中以噴施稀釋500倍海藻肥組緩解效果最佳。

低溫脅迫下，低溫逆境敏感的植物細胞中加速產(chǎn)生活性氧，而活性氧清除能力下降，導(dǎo)致活性氧水平的升高，所以低溫脅迫下活性氧對植物細胞所引起的損傷是傷害產(chǎn)生的原因之一[22]。Liu等[23]研究發(fā)現(xiàn)，嫁接西瓜幼苗的耐冷性增強與抗氧化劑和抗氧化酶活性的增加有關(guān)。楊錦等[24]研究發(fā)現(xiàn)，海藻肥處理能顯著增強菜心葉片中抗氧化酶活性，有效清除葉片氧自由基，降低細胞膜氧化損傷，以此提高菜心抗旱性。王強等[25]研究發(fā)現(xiàn)，海藻肥處理能顯著增強黃瓜的SOD、POD活性，幫助清除植株內(nèi)活性氧，以此提高黃瓜抗鹽分脅迫能力。本試驗發(fā)現(xiàn)，噴施海藻肥能顯著提高雜交蘭抗氧化系統(tǒng)的能力，其中噴施500倍稀釋濃度海藻肥對增加POD、SOD活性最明顯。

4 小結(jié)

噴施500、1 000倍稀釋濃度海藻肥均能顯著提高雜交蘭抗低溫脅迫能力，其中以500倍為最佳，在該濃度下，雜交蘭葉綠素含量更穩(wěn)定，受低溫影響最小，細胞膜受活性氧影響損傷更小，表現(xiàn)在MDA和H2O2含量均顯著小于對照和其他處理組，抗氧化酶POD、SOD活性顯著大于對照，說明清除葉片氧自由基的能力更強。但本試驗僅在生理層面分析了海藻肥緩解雜交蘭低溫脅迫的生理特性，且只對雜交蘭K6進行了試驗，海藻肥在提高雜交蘭低溫抗性上是否具有廣譜性，后期還需進一步研究，以期能夠在雜交蘭的生產(chǎn)中進行規(guī)模化應(yīng)用。