強(qiáng)直性脊柱炎（AS）是一種常見(jiàn)的自身免疫性疾病，我國(guó)AS的患病率高達(dá)0.2%～0.54%。AS以炎性腰背痛及脊柱關(guān)節(jié)僵硬為主要臨床表現(xiàn)，后期可導(dǎo)致患者喪失勞動(dòng)能力及生活能力，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。但是，AS的發(fā)病機(jī)制尚不明確，給臨床診療帶來(lái)了極大的困難。

間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）是一種具有強(qiáng)大免疫調(diào)節(jié)能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞。MSCs既能通過(guò)影響體內(nèi)的免疫調(diào)節(jié)能力參與炎癥反應(yīng)，又能通過(guò)自身的成骨分化能力參與成骨的發(fā)生，與AS的發(fā)病密切相關(guān)。AS患者M(jìn)SCs成骨分化功能增強(qiáng)而抑制破骨分化的能力減弱，是導(dǎo)致AS異常成骨的關(guān)鍵因素之一。因此，深入研究ASMSCs的功能有助于明確AS的發(fā)病機(jī)制。腫瘤壞死因子-α（TNF-α）是AS患者體內(nèi)最重要的炎癥因子之一，不但參與炎癥反應(yīng)，還可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、自噬，在AS的發(fā)病中扮演著重要的角色。有研究進(jìn)一步指出，TNF-α可通過(guò)調(diào)控MSCs的功能參與AS的發(fā)病，但具體的調(diào)控機(jī)制不明。

自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種自食現(xiàn)象，具有調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)及免疫平衡的作用。研究表明，細(xì)胞自噬水平與體內(nèi)炎癥反應(yīng)及骨代謝密切相關(guān)，而MSCs自噬失調(diào)與多種自身免疫性疾病的發(fā)病密切相關(guān)。那么，AS患者M(jìn)SCs（ASMSCs）是否存在自噬失調(diào)并參與AS的發(fā)病呢？目前尚不明確。

臨近年底，備受關(guān)注的《個(gè)人所得稅專項(xiàng)附加扣除暫行辦法》（以下簡(jiǎn)稱《暫行辦法》）終于正式亮相，標(biāo)志著我國(guó)綜合與分類相結(jié)合的個(gè)稅改革邁出關(guān)鍵一步，釋放出更加惠民的積極信號(hào)。

本研究擬探討TNF-α刺激下，ASMSCs與正常人MSCs（HDMSCs）的自噬水平是否存在差異并探究其內(nèi)在機(jī)制，為AS的發(fā)病機(jī)制及治療提供新的思路和方法。

但由于越南的文化影響力目前尚處于中等水平，對(duì)華交往時(shí)仍面臨文化逆差的考驗(yàn)；越南的地緣環(huán)境也令其對(duì)中國(guó)文化傳播存在一定的警惕和敏感。所以越南在同中國(guó)開(kāi)展文化合作之余常會(huì)采取一些人為干預(yù)行為以求平衡和自保。如越南社會(huì)目前雖已興起了學(xué)中文和來(lái)華留學(xué)的熱潮，但越南政府至今只批準(zhǔn)開(kāi)設(shè)一所孔子學(xué)院——河內(nèi)大學(xué)孔子學(xué)院。該院前后經(jīng)歷了八年多的籌備努力才于2014年正式揭牌。而近年來(lái)由于中越間南海爭(zhēng)議的表面化，一些中國(guó)文化產(chǎn)品也被貼上“政治標(biāo)簽”而遭抵制。如越南通信傳媒部還曾要求中部和西原地區(qū)的電視臺(tái)加強(qiáng)捍衛(wèi)海權(quán)的宣傳力度，限制播放中國(guó)連續(xù)劇。

1 資料和方法

1.1 病例納入

傳統(tǒng)語(yǔ)文作業(yè)的內(nèi)容只局限于本學(xué)科，與其它學(xué)科之間缺乏聯(lián)系和滲透，使學(xué)生形成狹隘封閉的知識(shí)觀。新課程理念下的初中語(yǔ)文作業(yè)設(shè)計(jì)要淡化學(xué)科間界限，把語(yǔ)文學(xué)科同其他學(xué)科在知識(shí)上相關(guān)或思考方法上相似的內(nèi)容綜合在一起設(shè)計(jì)作業(yè)，使學(xué)生認(rèn)識(shí)到語(yǔ)文學(xué)習(xí)不僅包括單純的語(yǔ)文知識(shí)的掌握和運(yùn)用，還有語(yǔ)文學(xué)科與其他學(xué)科知識(shí)進(jìn)行滲透。

1.2 MSCs的分離、培養(yǎng)和鑒定

按既往報(bào)道的方法，經(jīng)髂后上棘穿刺抽取患者及健康志愿者骨髓，用密度梯度離心法分離MSCs。用含10%胎牛血清（四季青）的DMEM 培養(yǎng)液（Gibco）于25 cm的培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，貼壁后定期換液、傳代，將第4代細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。用流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞的表面抗體［CD14-APC、CD29-PE、CD44-FITC、CD45-APC、CD105-FITC 和HLA DR（BD）］。

將MSCs種于6孔板，貼壁培養(yǎng)24 h后，將含有綠色熒光蛋白輕鏈3B的慢病毒載體（GFP LC3B，吉瑪基因）加入MSCs中。再次培養(yǎng)24 h后，更換培養(yǎng)液，加入TNF-α誘導(dǎo)，以不加入TNF-α誘導(dǎo)孔為對(duì)照。轉(zhuǎn)染72 h后，通過(guò)熒光顯微鏡觀察誘導(dǎo)前后MSCs中GFP-LC3B的表達(dá)。自噬越強(qiáng)，細(xì)胞中GFP-LC3B熒光點(diǎn)更多更亮。用Image Pro軟件計(jì)算GFP-LC3B熒光點(diǎn)的數(shù)量。

1.3 細(xì)胞增殖能力檢測(cè)

將健康志愿者和患者的第4代MSCs種于96孔板上（5×10/孔），用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)，將無(wú)細(xì)胞孔作為陰性對(duì)照。采用CCK-8試劑盒（Dojindo）檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)HDMSCs和ASMSCs的增殖情況。

1.4 TNF-α誘導(dǎo)自噬

采用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。兩組之間比較采用獨(dú)立樣本檢驗(yàn)，多組之間比較用方差分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示，＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

在顯微鏡下，HDMSCs與ASMSCs均為長(zhǎng)梭形貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。HDMSCs 與ASMSCs 均持續(xù)表達(dá)CD29、CD44和CD105，但不表達(dá)CD14、CD45和HLADR。在1～7 d的培養(yǎng)過(guò)程中，HDMSCs與ASMSCs增殖能力無(wú)明顯差異（圖1）。

1.5 定量PCR（qRT-PCR）

先用TRIzol（Invitrogen）按步驟提取RNA，接著用PrimeScriptRT Master Mix(Takara)試劑盒將RNA轉(zhuǎn)錄為cDNA。按步驟設(shè)計(jì)并合成引物（Invitrogen）（引物序列詳見(jiàn)表2），在LightCycler480 PCR System(Roche)上進(jìn)行qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)。選取GAPDH 作為內(nèi)參，目標(biāo)基因Ct值以GAPDH的Ct值標(biāo)準(zhǔn)化，用2的方法計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR所用引物見(jiàn)表2。

1.6 Western blot

TNF-α 誘導(dǎo)6 h后，ASMSCs中LC3 II/LC3 I的蛋白表達(dá)水平明顯低于HDMSCs，而P62的表達(dá)水平明顯高于HDMSCs（圖2）。進(jìn)一步通過(guò)熒光顯微鏡觀察，我們發(fā)現(xiàn)自噬誘導(dǎo)后ASMSCs的GFP-LC3B熒光斑點(diǎn)明顯弱于HDMSCs（圖2）。

1.7 綠色熒光蛋白和輕鏈3B融合蛋白（GFP-LC3B）分析

綜上所述，第2代320排螺旋CT掃描技術(shù)采用AIDR-3D算法，聯(lián)合應(yīng)用自動(dòng)曝光控制技術(shù)，球管旋轉(zhuǎn)時(shí)間0.3 s，在不影響肝灌注參數(shù)HAF、PVF、PI值的情況下，輻射劑量較第1代320排螺旋CT機(jī)明顯降低。此外，兩者HAF、PVF、PI值相似說(shuō)明其聯(lián)合應(yīng)用不影響肝臟腫瘤的隨訪觀察。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將HDMSCs及ASMSCs分別種于6孔板（1×10/孔），貼壁培養(yǎng)24 h 后，實(shí)驗(yàn)組加入TNF-α（Sigma Aldrich，25 ng/mL）及培養(yǎng)液，對(duì)照組單純加入培養(yǎng)液，誘導(dǎo)6 h后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 ASMSCs與HDMSCs具有相同的形態(tài)、表型和增殖能力

藥動(dòng)學(xué) 依米珠單抗在每周單次皮下注射0．3～3 mg·kg-1的劑量范圍內(nèi)呈現(xiàn)線性藥動(dòng)學(xué)，其推薦用法為前4周每周皮下注射3 mg·kg-1，第5周開(kāi)始每周皮下注射1．5 mg·kg-1，第5周血漿谷濃度為 （54．6 ± 14．3） μg·mL-1， 后維持在 50 μg·mL-1以上， 最終穩(wěn)態(tài)血漿谷濃度為 （52．8 ± 13．5） μg·mL-1[9]。

選取2017年7月～2020年7月在我院診斷為AS的患者共14例（參照1984年紐約修訂版AS診斷標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行診斷），健康對(duì)照組共15例。所有患者均同意參加實(shí)驗(yàn)，并簽署知情同意書(shū)，倫理證明號(hào)（LAEC-2021-174）。兩組入選病例一般情況見(jiàn)表1。

2.2 TNF-α誘導(dǎo)下，ASMSCs自噬水平低于HDMSCs

按步驟提取蛋白并依次定量、變性，將變性后的蛋白與SDS混合物進(jìn)行電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜（Millipore）上。將PVDF膜洗滌后封閉1 h，4 ℃下孵育一抗過(guò)夜（GAPDH、LC3B、P62、p-PI3K、PI3K、p-AKT、AKT、pmTOR、mTOR，CST），洗膜后室溫孵育二抗（Santa Cruz）1.5 h。再次洗膜后加入顯影液（Millipore），放入Chem Studio PLUS Motorized 成像系統(tǒng)曝光。Image J軟件測(cè)量目標(biāo)蛋白灰度值，將GAPDH設(shè)為內(nèi)參，目標(biāo)蛋白的相對(duì)表達(dá)量=目標(biāo)蛋白灰度值/GAPDH灰度值。

2.3 ASMSCs自噬過(guò)程中PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通道異常激活

盡管自噬過(guò)程中ASMSCs 與HDMSCs 的PI3K、AKT 及mTOR 基因表達(dá)水平無(wú)明顯差異（圖3A），但ASMSCs 的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT 及p-mTOR/mTOR蛋白表達(dá)水平明顯高于HDMSCs（圖3B）。

2.4 阻斷PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路可恢復(fù)ASMSCs自噬水平

400 nmol/L的TG100713可有效阻斷PI3K的磷酸化（圖4A）。阻斷PI3K磷酸化后，ASMSCs中p-AKT/AKT、p-mTOR/mTOR、LC3 II/LC3 I及P62的表達(dá)恢復(fù)至HDMSCs 水平，而GFP-LC3B 熒光斑點(diǎn)強(qiáng)度也與HDMSCs相當(dāng)（圖4B）。

3 討論

TNF-α是一種多功能細(xì)胞因子，廣泛參與體內(nèi)的病理生理過(guò)程，如：增殖、分化、凋亡、自噬等。研究表明，TNF-α與AS的發(fā)病密切相關(guān)。首先，TNF-α在-238，-308，-850，-1031和rs769178位點(diǎn)上的基因多態(tài)性與AS的易感性密切相關(guān)；其次，AS患者血清及骶髂關(guān)節(jié)中TNF-α水平明顯升高，且血清中TNF-α水平與AS疾病活動(dòng)度成正相關(guān)；此外，TNF-α抑制劑可有效治療AS。但是，TNF-α參與AS發(fā)病的具體機(jī)制尚未完全明確。最近多項(xiàng)研究進(jìn)一步指出，TNF-α可通過(guò)調(diào)控MSC的功能參與AS的發(fā)生發(fā)展。TNF-α介導(dǎo)ELMO1的m6A甲基化修飾可誘導(dǎo)AS患者M(jìn)SC定向遷移；TNF-α可通過(guò)自噬調(diào)控MSC凋亡，影響MSC的免疫調(diào)節(jié)能力。我們前期研究表明，激活自噬可提高M(jìn)SC的抑炎能力，反之亦然。因此，我們推測(cè)TNF-α可能通過(guò)調(diào)控MSC自噬參與AS的發(fā)病。

細(xì)胞自噬與內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)密切相關(guān)，自噬水平異常可誘發(fā)炎癥反應(yīng)并參與自身免疫性疾病的發(fā)病。B細(xì)胞自噬增多而T細(xì)胞自噬減少與系統(tǒng)性紅斑狼瘡體內(nèi)慢性炎癥密切相關(guān)；滑膜成纖維細(xì)胞自噬增多及成骨細(xì)胞/破骨細(xì)胞自噬失調(diào)參與了類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生發(fā)展；肌成纖維細(xì)胞自噬水平下降是系統(tǒng)性硬化癥的重要發(fā)病機(jī)制。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)下ASMSCs的自噬水平明顯低于HDMSCs。ASMSCs自噬水平下降可導(dǎo)致其抑炎能力降低、體內(nèi)炎癥水平升高，這可能是AS慢性炎癥的發(fā)病機(jī)制之一。

細(xì)胞自噬是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程，多種細(xì)胞因子及信號(hào)通路參與其中，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路是其中最重要的調(diào)控通路之一。PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路激活后，既可直接抑制自噬，又可通過(guò)調(diào)控P70S6K、AMBRA1、ULK1和BECLIN1等因子的表達(dá)抑制自噬小體的形成，負(fù)向調(diào)控細(xì)胞自噬。本研究結(jié)果顯示，在ASMSCs自噬過(guò)程中，PI3K/AKT/mTOR表達(dá)明顯升高；抑制PI3K磷酸化后，AKT及mTOR的表達(dá)及ASMSCs自噬均恢復(fù)至HDMSCs水平。說(shuō)明PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路異常激活是導(dǎo)致ASMSCs自噬減弱的關(guān)鍵機(jī)制。

該模塊可以實(shí)現(xiàn)對(duì)茶園的環(huán)境溫濕度、光照強(qiáng)度、土壤含水量及溫度的采集，并通過(guò)GPRS把采集到的信息實(shí)時(shí)發(fā)送回監(jiān)控中心。根據(jù)茶園信息采集的需求，選擇AM2303數(shù)字溫、濕度傳感器檢測(cè)大氣溫、濕度，采用數(shù)字光強(qiáng)度模塊BH1750FVI對(duì)光照強(qiáng)度進(jìn)行檢測(cè)；選擇PH-TW土壤溫度傳感器采集土壤溫度，選擇SWR2型土壤水分傳感器采集土壤水分含量，以上兩個(gè)模塊都是模擬輸出，需要外接一個(gè)ADC0832轉(zhuǎn)換成數(shù)字信號(hào)，輸入到單片機(jī)進(jìn)行相應(yīng)的運(yùn)算處理。

本研究中，我們發(fā)現(xiàn)TNF-α誘導(dǎo)下，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路異常激活是導(dǎo)致ASMSCs自噬減弱的關(guān)鍵。ASMSCs自噬減弱可導(dǎo)致其抑炎能力下降并誘發(fā)或加重AS 患者體內(nèi)慢性炎癥。但是，PI3K/AKT/mTOR信號(hào)通路異常激活的關(guān)鍵分子究竟是什么？在AS患者體內(nèi)是否同樣存在這種自噬減弱的情況？上述問(wèn)題仍有待進(jìn)一步研究。