雷金洪，劉天天，張廣武，傅麗容，史海濤

( 海南師范大學 生命科學學院，熱帶島嶼生態(tài)學教育部重點實驗室，海南 ?？?571158 )

紅耳龜(Trachemysscriptaelegans)具有食用、藥用及觀賞價值，自1987年引入我國以來，因生命力頑強，易飼養(yǎng)，價格低廉，一直受到養(yǎng)殖戶的青睞。紅耳龜最適養(yǎng)殖溫度為30 ℃，在集約化大規(guī)模養(yǎng)殖過程中，氣候變暖和極端天氣頻發(fā)的情況下，夏季高溫已成為影響龜鱉健康養(yǎng)殖的重要因素。研究顯示，高溫脅迫引發(fā)的熱應激直接影響機體功能，導致代謝障礙、生長遲緩、免疫力下降，引發(fā)各種病害，造成巨大的經濟損失[1-2]。因此緩解、降低熱應激的不利反應，是龜鱉養(yǎng)殖亟待解決的問題。

維生素E是一種有效的抗氧化劑和免疫增強劑，在水產養(yǎng)殖中已得到廣泛應用。維生素E可以改善水生生物飼料利用率，提高水生生物的生長速度，增強細胞免疫和體液免疫功能[3]。在大量魚類的相關研究表明，缺乏維生素E會使魚營養(yǎng)不良，降低魚的應激能力、生長率和成活率[4]。Alves等[5]研究發(fā)現(xiàn)，大西洋庸鰈(Hippoglossushippoglossus)在熱應激情況下血糖、血清皮質酮水平升高，熱應激蛋白(Hsp70)基因的表達量升高；而飼料中添加維生素E能降低熱應激狀態(tài)下大西洋庸鰈的血糖和血清皮質酮水平，下調熱應激蛋白基因的表達，說明維生素E是一種有效的抗應激劑。維生素E的抗應激效應與添加量密切相關，不同種屬水產動物對維生素E的最適需求量有一定的差異，在適宜范圍內有促進作用[6]。點帶石斑魚(Epinepheluscoioides)幼魚[7]最適維生素E需求量為139.68～149.59 mg/kg；中華鱉(Pelodiscussinensis)[8]在養(yǎng)殖過程中補充維生素E 250～350 mg/kg，足以承受不利的環(huán)境，而高水平的維生素E抑制幼鱉的生長。高溫脅迫環(huán)境下能否通過添加維生素E增強紅耳龜幼龜?shù)目箲つ芰?，提高生產性能，及維生素E的適用量范圍等相關研究未見報道。筆者擬在餌料中添加不同水平的維生素E，以(34±0.5) ℃水溫為應激源，探討不同劑量維生素E對高溫應激下紅耳龜血清中超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性、丙二醛含量及腸道消化酶活性的影響，以期改善龜鱉動物抵抗高溫環(huán)境的能力，為生產實踐中合理利用維生素E提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗動物及馴化

試驗用紅耳龜幼龜，購于?？谑袞|山泓旺養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)于實驗室玻璃缸中。每2 d于18：00投喂1次，所用飼料為龜鱉配合飼料(營養(yǎng)成分見表1)，將餌料加少量水和成面團后投喂，投餌量以使動物達到飽食并出現(xiàn)少量剩余為準。馴養(yǎng)2周，使試驗用龜充分適應環(huán)境后，挑選健康個體開始試驗。

表1 基礎日糧主要營養(yǎng)成分及其含量 %Tab.1 Approximate nutrient ingredient and contents of basal diet

1.2 試驗設計

選取40只紅耳龜幼龜健康個體，體質量(108.42±19.56) g，隨機分為4組，每組2個平行，每個平行5只，各組間體質量差異不顯著(P>0.05)，置于48 cm×36 cm×10 cm的飼養(yǎng)箱中，試驗期間條件控制與馴化相同。試驗組動物餌料中除維生素E添加量不同外，其他營養(yǎng)條件均與對照組相同，對照組不添加維生素E，試驗Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組飼料維生素E的添加量分別為150、250、350 mg/kg。試驗30 d后，斷頸取血液樣品，4 ℃、3500 r/min(離心半徑8.56 cm)下離心獲得血清，用于測定超氧化物歧化酶、過氧化氫酶活性及丙二醛含量。同時，解剖取腸道組織，加入9倍體積的磷酸緩沖鹽溶液，制成勻漿液，用于測定腸道消化酶活性。

1.3 特定生長率測定

正式試驗前測定紅耳龜幼龜初始體質量(m1)，飼養(yǎng)試驗結束后稱量幼龜終末體質量(m2)，試驗周期為t，特定生長率(RSG，%/d)參照文獻[7]進行計算：

RSG=(lnm2-lnm1)/t×100%

1.4 抗氧化指標測定

試驗選用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒，測定血清中超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)活性和丙二醛(MDA)含量。其中超氧化物歧化酶活性檢測采用羥胺法，過氧化氫酶活性選用可見光法測定，丙二醛含量則是通過硫代巴比妥酸法測定。

1.5 腸道消化酶活性測定

腸道消化酶活性測定過程中，淀粉酶選用碘—淀粉比色法，根據(jù)淀粉遇碘變藍原理，依據(jù)試劑盒說明書按要求分步加入樣品、相關試劑，混勻，在660 nm波長處測得吸光度，通過計算得出樣品淀粉酶活性；脂肪酶活性的測定采用甘油三酯法；蛋白酶活性的測定方法采用氨基酸法。3種酶均采用南京建成生物工程研究所生產的試劑盒在37 ℃條件下進行檢測，具體操作方法嚴格按照說明書進行。

1.6 數(shù)據(jù)處理及分析

數(shù)值均用平均值±標準差表示。采用F檢驗或Bartletts檢驗各組方差齊性，采用SPSS 19.0軟件進行單因素方差分析，不同處理間多重比較采用LSD法進行差異顯著性檢驗，P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結 果

2.1 不同維生素E水平對紅耳龜幼龜特定生長率的影響

高溫應激環(huán)境中，未添加維生素E的對照組紅耳龜特定生長率最低，試驗組飼喂日糧中添加維生素E可以促進紅耳龜特定生長率的增長。由圖1可見，150 mg/kg試驗組特定生長率比對照組高，但差異不顯著(P>0.05)，250、350 mg/kg試驗組特定生長率升高明顯，顯著高于對照組(P<0.05)，說明維生素E可以緩解高溫應激，有助于紅耳龜幼龜?shù)纳L。

圖1 飼料維生素E水平對紅耳龜特定生長率的影響Tab.1 Effect of vitamin E levels on specific growth rate (SGR) of red-eared turtle T. scripta elegans不同組別上標相同小寫字母表示差異不顯著(P>0.05)，不同字母表示差異顯著(P<0.05).Means with the same superscript in the different groups are not significant differences (P>0.05), and the means with different superscripts are significant differences (P<0.05).

2.2 不同維生素E水平對紅耳龜幼龜血清抗氧化指標的影響

高溫脅迫環(huán)境下添加不同水平維生素E日糧飼喂紅耳龜幼龜，血清抗氧化酶活性有不同程度的提高，250 mg/kg試驗組血清超氧化物歧化酶活性顯著高于對照組和150 mg/kg試驗組，差異極顯著(P<0.01)；3個試驗組血清過氧化氫酶活性升高幅度較大，約為對照組的3.5倍[F(3，36)=47.81，P<0.01]，各試驗組間差異不顯著(表2)。丙二醛含量與抗氧化酶活性呈負相關，對照組含量最高，不同水平維生素E試驗組的丙二醛含量均顯著低于對照組[F(3,36)=27.61，P<0.01]，各試驗組間差異不顯著(P>0.05)，但250 mg/kg試驗組降低幅度最大。說明高溫脅迫環(huán)境下，在紅耳龜幼龜日糧中添加一定水平的維生素E可以提高機體抗氧化能力，應對高溫脅迫。

表2 飼料維生素E水平對紅耳龜抗氧化指標的影響(平均值±標準差，n=10)Tab.2 Effect of vitamin E levels on antioxidant index of red-eared turtle T. scripta elegans (means±SD, n=10)

2.3 不同維生素E水平對紅耳龜幼龜腸道消化酶活性的影響

高溫應激下日糧中添加不同水平的維生素E飼喂紅耳龜30 d后，試驗組腸道3種消化酶出現(xiàn)不同程度的變化。與對照組相比試驗組淀粉酶活性有所降低，但無差異顯著性[F(3,36)=1.15,P>0.05](表3)。試驗組脂肪酶活性均顯著低于對照組[F(3,36)=6.58,P<0.01]，250 mg/kg試驗組與對照組相比差異極顯著(P<0.01)。蛋白酶活性變化與淀粉酶和脂肪酶活性變化相反，試驗組蛋白酶活性顯著高于對照組[F(3,36)=4.31,P<0.05]，250 mg/kg試驗組蛋白酶活性最高，約為對照組的3.5倍(P<0.01)，350 mg/kg試驗組蛋白酶活性下降，與對照組差異不顯著。說明不同水平的維生素E會影響紅耳龜幼龜消化功能。

表3 維生素E水平對紅耳龜消化酶活性的影響(平均值±標準差，n=10) U/mgTab.3 Effect of vitamin E levels on the digestive enzyme activities of red-eared turtle T. scripta elegans (means±SD, n=10)

3 討 論

3.1 維生素E對紅耳龜幼龜生長性能的影響

夏季高溫常導致水產動物產生熱應激，熱應激條件下體內腎上腺素和皮質醇大量分泌，使機體分解代謝加強，合成代謝減弱[9]，此外，應激可能還通過減少食物的攝入、吸收和利用影響生長[10]。如果在動物飼料中加入一定量的維生素E會使動物快速生長[11]。在中華鱉的日糧添加維生素E，顯著提高中華鱉的質量增加率、飼料利用率和蛋白利用率[12]。普遍認為維生素E能促進動物腸道的發(fā)育，提高動物的消化酶活性，從而促進營養(yǎng)物質的消化吸收，提高生長性能[13]。本試驗結果進一步證實了上述觀點，在高溫應激情況下當維生素E的添加量達250 mg/kg時，可促進生長性能的提高，這可能與改善紅耳龜幼龜消化吸收功能有關。另外，環(huán)境高溫導致的熱應激可直接影響消化道的結構，寧章勇等[14]發(fā)現(xiàn)，持續(xù)34.5 ℃高溫導致肉雞腸絨毛斷裂，胃腸黏膜上皮細胞脫落及腺胃、十二指腸、空腸和回腸黏膜完整性損傷。鄭婷[15]研究表明，飼料中添加維生素E可促進鯉(Cyprinuscarpio)腸上皮細胞的增殖，完善鯉腸上皮細胞的發(fā)育，并保護其功能和結構的完整性。因此，本試驗中，當維生素E添加量達350 mg/kg時，紅耳龜消化酶活性下降，生長性能仍顯著提高，可能與維生素E對幼龜腸道的保護和修復，加強絨毛上皮細胞的吸收有一定的關系，但還需進一步研究。

3.2 維生素E對紅耳龜幼龜抗氧化能力的影響

抗氧化酶是生物體內保護預防相關的酶類，研究表明，當動物受到熱應激侵害時，機體內的過氧化氫酶、谷胱甘肽過氧化物酶、超氧化物歧化酶的活性均會受到影響[16]。徐冬冬等[17]研究發(fā)現(xiàn)，褐牙鲆(Paralichthysolivaceus)長期在海水中受高溫脅迫，肝臟組織超氧化物歧化酶和過氧化氫酶的活性隨著脅迫溫度的上升而下降，存活率降低。脅迫環(huán)境下抗氧化酶活性降低，大量的自由基不能及時清除，會給組織和細胞造成氧化性損傷。本試驗得到類似的結果，未添加維生素E的熱應激組超氧化物歧化酶和過氧化氫酶活性最低，添加維生素E達適宜劑量時兩種酶活性顯著提高，丙二醛含量顯著減少，說明維生素E在終止脂質過氧化反應及消除自由基等方面表現(xiàn)出良好的效果。有學者認為，維生素E可能會替代體內和細胞膜上的不飽和脂肪酸與自由基反應，從而使不飽和脂肪酸免受氧化，對維護生物膜的正常生理功能起到十分重要的作用[18]。

3.3 維生素E對紅耳龜幼龜消化能力的影響

消化酶是動物機體對飼料中營養(yǎng)物質消化吸收的關鍵物質，其活性與動物生長密切相關。高溫應激會影響水生動物消化酶的活性，羅祖娟等[19]研究發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下吉富羅非魚(OreochromisniloticusGIFT)腸道胃蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶的活性，隨脅迫時間的延長，呈先升后降的趨勢。維生素E對水生動物消化功能的改善常見報道，伍曦等[20]研究表明，在高溫脅迫情況下，餌料中添加高水平的維生素E能促進建鯉(C.carpiovar.Jian)幼魚生長和消化器官生長發(fā)育，并增強建鯉幼魚的消化吸收能力。對泥鰍(Misgurnusanguillicaudatus)的消化酶影響研究結果顯示，維生素E顯著提高泥鰍幼魚腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，達到適宜維生素E水平(195 mg/kg)腸蛋白酶和腸脂肪酶活性的變化幾乎相反[21]。本試驗結果顯示，添加維生素E顯著影響紅耳龜幼龜?shù)鞍酌负椭久富钚?，蛋白酶活性顯著提高，250 mg/kg試驗組蛋白酶活性最高，脂肪酶的活性受到抑制，提示日糧中添加適量維生素E有利于蛋白酶的分泌。說明不同維生素E對動物生長的影響存在種屬和劑量上的差異。由紅耳龜野外食性研究和人工飼養(yǎng)結果可知，紅耳龜成體屬雜食性，喜肉食餌料，幼體屬肉食性[22]，本試驗結果提示，紅耳龜幼龜人工飼養(yǎng)條件下，日糧中添加維生素E可促進蛋白質的消化分解，同時餌料成分的配伍上應加大蛋白質占比，減少脂肪占比。

4 結 論

紅耳龜幼龜在34 ℃高溫應激條件下，通過在餌料中添加維生素E 150、250、350 mg/kg，可在一定范圍內顯著提高紅耳龜幼龜抗氧化能力，有助于腸道蛋白質的消化吸收，促進幼龜?shù)纳L。維生素E添加量在250 mg/kg時效果最明顯。