周澤璇,張婷，梁國棟，劉衛(wèi)東，肖云峰

(1.內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010010；2.內(nèi)蒙古自治區(qū)蒙藥新藥研發(fā)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010010；3.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)新藥安全評價(jià)研究中心，內(nèi)蒙古自治區(qū) 呼和浩特 010010)

藍(lán)刺頭是菊科植物多年生草本，以頭狀花序入藥，屬蒙醫(yī)藥常用傳統(tǒng)蒙藥材之一，最早記載于蒙古族著作《智慧之鑒》中，性味苦，涼，具有固骨質(zhì)，接骨愈傷，清熱止痛的功效，主要用于骨折、骨熱、刺痛、瘡瘍等病癥[1]。甘藍(lán)強(qiáng)骨片是由本公司研發(fā)中心自主研發(fā)的一味特色蒙藥，由藍(lán)刺頭、甘草、桑白皮三位味道地蒙藥材組成，具有補(bǔ)脾益氣、清熱解毒、瀉肺平喘、利水消腫、固骨質(zhì)、清熱止痛等功效，主要用于肝腎虧損之圍絕經(jīng)期、絕經(jīng)期骨質(zhì)疏松，尤其是對骨質(zhì)疏松有一定的治療效果，擁有良好的應(yīng)用前景。

上市的藥品必須具備安全、有效和質(zhì)量可控三個(gè)條件[2]，其中藥品的安全性關(guān)乎于人們的生命健康是重中之重，因此在藥品上市之前必須通過毒性研究試驗(yàn)對藥品的安全性做出評價(jià)。依據(jù)毒性研究技術(shù)指導(dǎo)原則[3-6]，本文通過開展甘藍(lán)強(qiáng)骨片的急性毒性和長期毒性試驗(yàn)研究，觀察動(dòng)物產(chǎn)生的毒性反應(yīng)及嚴(yán)重程度，對主要毒性反應(yīng)靶器官的損害，評價(jià)甘藍(lán)強(qiáng)骨片用藥安全性，確定安全劑量，為臨床用藥提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與飼養(yǎng)條件

1.1.1 動(dòng)物 SPF級昆明種小鼠和SPF級Wistar種大鼠，均由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，生產(chǎn)許可證編號均為SCXK(蒙)2015-0001，使用許可證編號均為SYXK(蒙)2015-0001。購入后檢疫適應(yīng)環(huán)境7 d，并對動(dòng)物外觀健康、臨床癥狀等情況觀察，各項(xiàng)指標(biāo)達(dá)到試驗(yàn)要求。

1.1.2 環(huán)境條件 溫度20～26 ℃，日溫差≤3 ℃；相對濕度41%～64%；換氣次數(shù)≥15 次/h；照明時(shí)間12 h/12 h(07∶30～19∶30)明暗交替，照度150～300 Lux。

1.2 藥品與試劑 甘藍(lán)強(qiáng)骨片(內(nèi)蒙古大唐藥業(yè)股份有限公司生，批號：20200324)；水合氯醛(天津市大茂化學(xué)試劑廠，批號：20181124)；羧甲基纖維素鈉(Sodium Carboxymethyl Cellulose，CMC-Na，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司，批號：20190304)；血細(xì)胞分析試劑(深圳邁瑞生物股份有限公司，批號：2019030106)；谷丙轉(zhuǎn)氨酶(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191013563)；谷草轉(zhuǎn)氨酶(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：200114305)；白蛋白(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：190923316)；總蛋白(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：200119101)；尿素(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191201352)；肌酐(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191222511)；葡萄糖(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191107307)；總膽固醇(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：191007278)；甘油三酯(寧波美康生物科技股份有限公司，批號：200119117)。

1.3 儀器 電子天平(北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司，型號：BS2202S、BS2402S)；實(shí)體解剖顯微鏡(德國Leica公司，型號：DFC 290)；封閉式全自動(dòng)組織脫水機(jī)(德國徠卡，型號：ASP 200)；切片機(jī)(德國徠卡，型號： RM 2235)；自動(dòng)染色機(jī)(德國徠卡，型號：AUTOSTAINER XL)；分體式組織包埋機(jī)(德國徠卡，型號：EG 1150 H)；烘片機(jī)(德國徠卡，型號：HI 1220)；攤片機(jī)(德國徠卡，型號：HI 1210)；倒置顯微鏡(德國徠卡，型號：DM3000)；全自動(dòng)生化分析儀(愛爾蘭藍(lán)寶石公司，型號：ADS 600)；全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(希森美康集團(tuán)，型號：Sysmex XT-1800i)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 單次給藥試驗(yàn)

2.1.1 動(dòng)物分組與給藥劑量 選取健康昆明種小鼠40只，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按性別、體重將小鼠隨機(jī)分為溶劑對照組(0.5%CMC-Na)和供試品組(甘藍(lán)強(qiáng)骨片)，每組20只，雌雄各半。根據(jù)藥物急性毒性預(yù)試驗(yàn)，無法測出LD50，故采用急性毒性限度試驗(yàn)測定方法。配制藥物最大可混懸濃度為0.847 1 g·mL-1，由于無臨床給藥劑量，采取單日內(nèi)單次給予藥物最大濃度劑量，小鼠按0.4 mL/10 g灌胃給藥1次，總給藥體積為40 mL·kg-1，給藥劑量為33.86 g·(kg·d)-1。

2.1.2 觀察、稱重及檢查 給藥后觀察動(dòng)物的臨床癥狀，連續(xù)觀察至第14天，每天對動(dòng)物進(jìn)行體重、攝食量、飲水量測定和記錄。第15天解剖動(dòng)物，并進(jìn)行大體病理學(xué)檢查，若發(fā)現(xiàn)病變，則對病變組織進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

2.2 重復(fù)給藥試驗(yàn)

2.2.1 動(dòng)物分組與給藥劑量 選取Wistar大鼠80只，體重51.0～77.3 g，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，按體重隨機(jī)分為4組，每組20只，雌雄各半。受試物按急性毒性試驗(yàn)設(shè)計(jì)劑量設(shè)4個(gè)劑量組，分別為高劑量組[22.50 g·(kg·d)-1]、中劑量組[11.25 g·(kg·d)-1]、低劑量組[0.45 g·(kg·d)-1]和溶劑對照組(0.5%CMC-Na)。各組均以40.0 mL·(kg·d)-1灌胃(溶劑對照組灌胃等容量0.5%CMC-Na)，每天一次灌胃給予受試藥物，連續(xù)給藥30 d。

2.2.2 觀察、稱重及檢查 每天觀察并記錄動(dòng)物的一般臨床癥狀，每周測定并記錄動(dòng)物的體重及進(jìn)食量。實(shí)驗(yàn)第31天，腹主動(dòng)脈取血測定血清生化指標(biāo)和血象指標(biāo)，然后進(jìn)行大體解剖，觀察有無異常，取肝、腎、脾、睪丸等臟器稱重，并將溶劑對照組和高劑量組動(dòng)物的肝、腎、脾、胃腸、睪丸(卵巢)等臟器固定，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。

3 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與處理

4 結(jié)果

4.1 急性毒性試驗(yàn)

4.1.1 對動(dòng)物臨床癥狀的影響 給藥后連續(xù)觀察動(dòng)物14 d，小鼠進(jìn)食、進(jìn)水、活動(dòng)、毛色、糞便姿勢、軀體運(yùn)動(dòng)、呼吸頻率、下腹及肛門周圍無污染、眼、鼻、口無分泌物、體溫等一切正常。

4.1.2 對動(dòng)物體重的影響 與溶劑對照組比較，供試品組雌雄小鼠體重未見明顯差異(P>0.05)，結(jié)果見表1～2。

表1 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對小鼠體重的影響(♂,

表2 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對小鼠體重的影響(♀,

4.1.3 對動(dòng)物攝食量的影響 供試品組小鼠攝食量與溶劑對照組基本一致，未見明顯差異(P>0.05)，結(jié)果見表3～4。

表3 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對小鼠攝食量的影響(♂,

表4 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對小鼠攝食量的影響(♀,

4.1.4 對動(dòng)物飲水量的影響 供試品組小鼠飲水量與溶劑對照組基本一致，未見明顯差異(P>0.05)，結(jié)果見表5～6。

表5 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對小鼠飲水量的影響(♂,

4.1.5 病理學(xué)檢查 大體病理學(xué)檢查，肉眼觀察組織、器官未發(fā)現(xiàn)異?；虿∽儭?/p>

表6 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對小鼠飲水量的影響(♀,

4.2 長期毒性試驗(yàn)

4.2.1 對動(dòng)物臨床癥狀的影響 給藥后連續(xù)觀察動(dòng)物2周，大鼠進(jìn)食、進(jìn)水、活動(dòng)、毛色、糞便姿勢、軀體運(yùn)動(dòng)、呼吸頻率、下腹及肛門周圍有無污染、眼、鼻、口有無分泌物、體溫等一切正常。

4.2.2 對動(dòng)物體重的影響 與溶劑對照組比較，供試品組大鼠體重未見明顯差異(P>0.05)，結(jié)果見表7～8。

表7 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠體重的影響(♂,

表8 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠體重的影響(♀,

4.2.3 對動(dòng)物攝食量的影響 與溶劑對照組比較，供試品組大鼠攝食量無明顯差異(P>0.05)，結(jié)果見表9～10。

表9 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠攝食量的影響(♂,

4.2.4 對大鼠血常規(guī)的影響 與溶劑對照組相比，供試品組大鼠血常規(guī)各指標(biāo)未見明顯差異(P>0.05)，主要指標(biāo)見表11～12。

表10 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠攝食量的影響(♀,

表11 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠血常規(guī)的影響(♂,

4.2.5 對大鼠生化指標(biāo)的影響 與溶劑對照組相比，供試品組雄鼠肌酐及甘藍(lán)強(qiáng)骨片22.50 g·(kg·d)-1組總膽固醇均明顯低于溶劑對照組(P<0.05、P<0.01)，但無生物學(xué)意義。其余供試組與溶劑對照組基本一致，無明顯差異(P>0.05)，主要指標(biāo)見表13～16。

表12 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠血常規(guī)的影響(♀,

表13 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠生化指標(biāo)的影響(♂,

表14 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠生化指標(biāo)的影響(♀,

表15 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠生化指標(biāo)的影響(♂,

表16 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠生化指標(biāo)的影響(♀,

4.2.3 病理學(xué)檢查

4.2.3.1 大體解剖觀察 與溶劑對照組相比，供試品組大鼠大體解剖和臟體比結(jié)果未見明顯差異(P>0.05),主要指標(biāo)見表17～18。

表17 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠臟體比的影響(♂,

表18 甘藍(lán)強(qiáng)骨片對大鼠臟體比的影響(♀,

4.2.3.2 組織病理學(xué)檢查 各主要臟器大體檢查未發(fā)現(xiàn)明顯病變，因此選擇高劑量組和溶劑對照組作組織病理學(xué)檢查。高劑量給藥組雌雄鼠各有2只肝臟小葉出現(xiàn)輕度的空泡變、顆粒變和肝細(xì)胞腫脹，溶劑對照組有2只雌鼠、3只雄鼠肝臟小葉細(xì)胞出現(xiàn)輕度的空泡變、顆粒變和肝細(xì)胞腫脹；高劑量組和溶劑對照組各有1只雌鼠、2只雄鼠肝臟匯管區(qū)出現(xiàn)輕度的炎癥細(xì)胞浸潤，各有1只雌鼠腎臟皮質(zhì)部腎小管有輕度腫脹，各有1只雄鼠脾臟有輕度的色素沉著；溶劑對照組有1只雌鼠卵巢有輕度囊腫。以上組織病變均屬于動(dòng)物自發(fā)病變，高劑量組雌、雄鼠其他臟器均未見明顯的與供試品毒性有關(guān)的病理病變，結(jié)果見圖1所示。

圖1 高劑量甘藍(lán)強(qiáng)骨片大鼠肝(A)、脾(B)、胃(C)、腎(D)、十二指腸(E)、結(jié)腸(F)、卵巢(G)和睪丸(H)組織切片

5 結(jié)論與討論

甘藍(lán)強(qiáng)骨片由藍(lán)刺頭、甘草、桑白皮三位味道地蒙藥材組成。其中，藍(lán)刺頭是甘藍(lán)強(qiáng)骨片中針對主病證起主要治療作用的一味藥材，具有抑制骨吸收，促進(jìn)骨形成，對骨吸收和骨形成偶連有一定的調(diào)節(jié)作用，降低骨轉(zhuǎn)化率從而可以達(dá)到防止骨質(zhì)疏松[7]。有研究表明[8]，藍(lán)刺頭多糖提取物無毒副作用，此外未見其他藍(lán)刺頭藥材毒性研究報(bào)道。甘草味甘、性平，是能夠調(diào)和諸藥的一味藥材，與烈性藥物配伍可緩和藥性功效[9-10]。桑白皮藥材來源于桑科植物桑的干燥根皮，具有良好的抗骨質(zhì)疏松的作用[11]，早期有研究表明桑白皮藥材無毒性作用[12-13]。

本實(shí)驗(yàn)通過對昆明種小鼠灌胃給予甘藍(lán)強(qiáng)骨片顆粒，按0.4 mL·(10 g)-1灌胃給藥，一日內(nèi)給藥1次，總給藥量為40 mL·kg-1，飼養(yǎng)觀察2周，小鼠無任何異常及中毒反應(yīng)，行為、活動(dòng)、進(jìn)食一切正常，體重增加，說明甘藍(lán)強(qiáng)骨片在低于33.86 g·(kg·d)-1劑量條件下無急性毒性作用。通過對Wistar種大鼠灌胃給予甘藍(lán)強(qiáng)骨片顆粒，在試驗(yàn)劑量22.50、11.25和0.45 g·(kg·d)-1對實(shí)驗(yàn)大鼠的生長發(fā)育、血液學(xué)、血液生化學(xué)及病理學(xué)方面各項(xiàng)相關(guān)指標(biāo)的檢驗(yàn)均未發(fā)現(xiàn)明顯不良影響，說明甘藍(lán)強(qiáng)骨片口服給藥為無毒或低毒。

實(shí)驗(yàn)同期課題組開展了甘藍(lán)強(qiáng)骨片的藥效學(xué)研究，研究結(jié)果表明甘藍(lán)強(qiáng)骨片對骨質(zhì)疏松有一定的治療效果。甘藍(lán)強(qiáng)骨片作為治療骨質(zhì)疏松的一種全新中藥產(chǎn)品，對于骨質(zhì)疏松患者的用藥提供了新的選擇。本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果表明甘藍(lán)強(qiáng)骨片給藥為無毒或低毒為其安全性評價(jià)奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為后續(xù)的臨床用藥試驗(yàn)提供了理論支撐。