何子文 張紅旗

精神分裂癥是一種影響中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脫髓鞘和炎癥性疾病，其特征為髓鞘丟失、神經(jīng)膠質(zhì)增生和隨后的軸突丟失的局灶性病變[1]。先前研究強(qiáng)調(diào)了膠質(zhì)細(xì)胞在精神分裂癥易感性中的重要作用[2]。在發(fā)育過程中，少突膠質(zhì)前體細(xì)胞(Oligodendrocyte Precursor Cells，OPCs)經(jīng)歷了一個(gè)復(fù)雜的增殖、遷移、分化和髓鞘形成序列[3]。髓鞘再生被認(rèn)為是通過激活OPCs啟動的。最近一項(xiàng)獨(dú)立的全基因組關(guān)聯(lián)研究已經(jīng)確定了在小膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)的精神分裂癥相關(guān)基因座，包括谷氨酸受體(α-amino-3-hydroxy-5-methylisoxazole-4-propionic acid receptor，AMPAR)基因[4]。AMPAR與精神分裂癥的病理生理學(xué)相關(guān)，因?yàn)樗鼈冊谕挥|事件中發(fā)揮核心作用，包括可塑性、神經(jīng)元成熟、記憶形成和突觸發(fā)生[5]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)細(xì)胞中，AMPAR在小膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)最高[6]。然而，AMPAR在精神分裂癥小膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘發(fā)育中的作用尚未被探索。因此，本研究參照文獻(xiàn)方法在雙環(huán)己酮草酰二腙(Cuprizone，CPZ)誘導(dǎo)的精神分裂癥模型小鼠中建立了一條AMPAR條件性敲除線(GluA1-3亞基的敲除)[7]，以此闡明 AMPAR在小膠質(zhì)細(xì)胞和髓鞘發(fā)育中的潛在調(diào)節(jié)作用。其中，CPZ是一種銅螯合劑，可選擇性地?fù)p傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的髓鞘形成細(xì)胞少突膠質(zhì)細(xì)胞[8]。因此，CPZ誘導(dǎo)的動物模型已被用于模擬與精神分裂癥相關(guān)的白質(zhì)病變和行為[9]。

1 對象與方法

1.1 對象 選取15只AMPAR條件性敲除線(GluA1-3亞基的敲除，KO)和15只野生型(WT)小鼠，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，分別納入KO組和WT組，飼養(yǎng)在無病原體的動物設(shè)施中(光/暗循環(huán))置于標(biāo)準(zhǔn)動物室條件下[溫度(21±1) ℃；濕度55%～60%；12 h)。為了檢查AMPAR在髓鞘再生中的作用，在CPZ模型中將WT與KO小鼠進(jìn)行了比較。CPZ暴露會導(dǎo)致少突膠質(zhì)細(xì)胞死亡和嚴(yán)重的脫髓鞘，而CPZ撤出會導(dǎo)致自發(fā)的髓鞘再生[8]。在本研究中，給小鼠喂食含0.2% CPZ(質(zhì)量分?jǐn)?shù)百分比，w/w)的混合鼠飼料4周以誘導(dǎo)脫髓鞘(4周時(shí)間點(diǎn))，然后喂食不含CPZ食物3周以使髓鞘再生(4+3周時(shí)間點(diǎn))。

1.2 方法

1.2.1 原代小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)[10]解剖P1-3小鼠的小鼠皮質(zhì)，并將其放入2 ml的冷Dulbecco改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium，DMEM)中。用5 ml血清移液管和玻璃巴斯德移液管研磨破壞組織。破壞的腦組織以300×g的速度離心5 min，然后將顆粒重新懸浮在1 ml的DMEM 中。將細(xì)胞懸液通過40 μm細(xì)胞過濾器過濾，并在含有10% FBS和1% Pen-Strep的10 ml DMEM中培養(yǎng)。24 h后，用1×PBS洗滌細(xì)胞，并用20 ml DMEM/FBS/P/S孵育11～13 d。為了獲得小膠質(zhì)細(xì)胞，將燒瓶以125 rpm的速度搖動1～2 h，收集培養(yǎng)基并在涂有FBS的50 ml錐形管中以300 × g離心5 min。然后將小膠質(zhì)細(xì)胞顆粒重新懸浮并以75 000個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在96孔板上，在含有10% FBS和1% P/S的DMEM中培養(yǎng)。

1.2.2 電子顯微鏡(Electron Microcopy，EM) 通過用冷PBS灌注固定小鼠，然后在PBS中加入4% PFA。解剖大腦并在4 ℃下將兩個(gè)中央1 mm矢狀切片固定在改良的Karnovski固定劑中至少24 h。用超純水洗滌后，組織在室溫下在1%三氧化鋨中固定3 h。將組織在超純水中洗滌，并在4 ℃下用1% (w/v) 醋酸鈾酰染色過夜。然后通過一系列升高的乙醇濃度對樣品進(jìn)行脫水，在環(huán)氧丙烷中沖洗兩次，并嵌入環(huán)氧樹脂Eponate-12 (Ted Pella)。使用UMC超薄切片機(jī)(德國Leica公司)切割半薄的500 nm切片并轉(zhuǎn)移到碳涂層的組織學(xué)載玻片上。然后用4%醋酸雙氧鈾水溶液和0.1%雷諾檸檬酸鉛對切片染色15 min，用超純水沖洗并在加熱板上干燥。使用配備場發(fā)射槍的GeminiSEM 300(德國Zeiss公司)進(jìn)行掃描電子顯微鏡檢查。

1.2.3 免疫組織化學(xué)染色、成像和分析 小鼠大腦用20%甘油和2%二甲亞砜處理過夜，以防止出現(xiàn)冷凍偽影。然后將樣本嵌入MultiBrain?Technology (美國NeuroScience Associates公司)，用于在明膠基質(zhì)中進(jìn)行冠狀切片。在甲醛溶液中固化后，將塊浸入用碎干冰冷卻的2-甲基丁烷中快速冷凍，并安裝在AO 860切片機(jī)的冷凍臺上。MultiBrain?塊在切片機(jī)上以30 μm的設(shè)置進(jìn)行冠狀切片。對于Solochrome染色，每隔12個(gè)切片以360 μm的間隔固定在涂有明膠的載玻片上，并按照以下順序進(jìn)行風(fēng)干：95%乙醇，95%乙醇/甲醛；95%乙醇、70%乙醇、dH2O，然后加入到80 ml Solochrome染色溶液(1.5% Solochrome，2.5% v/v硫酸)、320 ml dH2O、100 ml 4%硫酸鐵銨，用自來水沖洗，在鐵氰化鉀-硼酸鈉中分化，在自來水中沖洗，用中性紅輕輕復(fù)染，脫水，在二甲苯中澄清并蓋上蓋玻片。

對于免疫化學(xué)，以360 μm的間隔每隔12個(gè)切片進(jìn)行自由漂浮染色。從一抗開始的所有孵育溶液均使用Tris緩沖鹽水(TBS)，以Triton X-100作為載體；所有沖洗均使用TBS。在過氧化氫處理后，切片在室溫下與一抗孵育過夜(Iba1∶1∶500，dMBP∶1∶100)。沖洗后，應(yīng)用生物素化二抗(產(chǎn)生一抗的宿主動物的抗IgG)。進(jìn)一步?jīng)_洗后，使用ABC溶液(抗生物素蛋白-生物素-HRP復(fù)合物；美國CA公司)。再次沖洗切片，然后用發(fā)色劑：二氨基聯(lián)苯胺四鹽酸鹽(DAB)和過氧化氫處理以產(chǎn)生可見的反應(yīng)產(chǎn)物。對于dMBP免疫化學(xué)染色切片用淺色硫氨酸Nissl染色劑復(fù)染。

在Leica SCN400顯微鏡(德國Leica公司)對腦組織切片進(jìn)行成像。使用在高性能計(jì)算集群上運(yùn)行的MATLAB(美國Mathworks公司)以盲法進(jìn)行圖像分析。在每只動物的匹配組織切片水平上手動繪制由胼胝體中的病變區(qū)域組成的感興趣區(qū)域(ROI)。使用顏色閾值和形態(tài)學(xué)操作對dMBP、Iba1和Solochrome陽性染色區(qū)域進(jìn)行分析。從每只動物3個(gè)ROI中取平均值。

1.2.4 吞噬作用和遷移測定 對于凋亡小膠質(zhì)細(xì)胞的吞噬作用，將小膠質(zhì)細(xì)胞與1 μM Staurosporine 孵育過夜以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，然后用250 nM Cytotox Red標(biāo)記，洗滌并加入活的小膠質(zhì)細(xì)胞。2 h后，使用Incucyte S3軟件中的自定義分析腳本測量是否存在未清除的Cytotox Red陽性小膠質(zhì)細(xì)胞。

使用IncuCyte實(shí)時(shí)動態(tài)細(xì)胞成像分析系統(tǒng)(美國 Essen Bioscience公司)進(jìn)行遷移測定。前一天將原代小膠質(zhì)細(xì)胞接種在DMEM/P/S中，并用創(chuàng)口機(jī)制造“劃痕”。每2 h采集一次孔的圖像，持續(xù)72 h，并使用相對傷口密度(傷口區(qū)域中的細(xì)胞密度相對于傷口區(qū)域外的細(xì)胞密度)來量化遷移。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用SPSS 21.0處理數(shù)據(jù)。所有數(shù)據(jù)均以至少三個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的平均值 ± 標(biāo)準(zhǔn)差的形式呈現(xiàn)。使用Student’st檢驗(yàn)(雙尾)或單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果。P< 0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMPAR在CPZ誘導(dǎo)的精神分裂癥髓鞘再生中的作用 CPZ喂食4周后，觀察到WT組和KO組小鼠的胼胝體都出現(xiàn)了強(qiáng)烈的脫髓鞘(圖1A，中圖，深藍(lán)色染色缺失)。然而，在KO組中，整體細(xì)胞密度(中性紅色斑點(diǎn))降低(圖1A，中圖，核染色)?；謴?fù)3周后，與WT組相比，KO組的髓鞘再生受損(P<0.001)。為了證實(shí)在KO組小鼠中觀察到的髓鞘再生受損，通過EM直接評估有髓軸突。在4周時(shí)間點(diǎn)，WT組小鼠胼胝體中的有髓軸突幾乎完全缺失，但在停止CPZ喂食3周后恢復(fù)(圖1B)。KO組小鼠在4周時(shí)剩余的有髓軸突多于WT組(P<0.01)，表明脫髓鞘過程可能會受到AMPAR缺失的影響。在4 + 3周時(shí)，KO組小鼠的有髓軸突比WT組小鼠少(P<0.05)(圖1B)，表明AMPAR在CPZ喂食后的髓鞘再生中起重要作用。

2.2 AMPAR在小膠質(zhì)細(xì)胞對脫髓鞘反應(yīng)中的作用 脫髓鞘后的第一個(gè)細(xì)胞事件是小膠質(zhì)細(xì)胞激活和浸潤到病變中[11]。在基線時(shí)，胼胝體中的Iba1(小膠質(zhì)細(xì)胞)染色沒有差異。然而，在CPZ喂食4周后，與WT組相比，KO組小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞浸潤減少(P<0.0001)。然而，在4+3周時(shí)間點(diǎn)，在WT組和KO組小鼠的病變中觀察到相似數(shù)量的小膠質(zhì)細(xì)胞(圖2A)。接下來研究觀察了從出生后第1天(P1)-出生后第3天(P3)的WT組和KO組小鼠大腦體外分離的小膠質(zhì)細(xì)胞傷口愈合情況。與WT組小膠質(zhì)細(xì)胞相比，KO組小膠質(zhì)細(xì)胞在傷口閉合方面表現(xiàn)出缺陷(P<0.05)。見圖2B。

2.3 AMPAR在小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬中的作用 通過對降解的髓鞘堿性蛋白 (dMBP) 進(jìn)行免疫染色來檢查病變中的髓鞘碎片。在4周和4+3周時(shí)間點(diǎn)觀察到KO較WT中央和外側(cè)胼胝體中有過多的髓鞘碎片(P<0.01)，見圖3A。證明了AMPAR在清除髓鞘碎片中的作用。研究進(jìn)一步通過使用熒光激活細(xì)胞分選(FACS)從脫髓鞘的KO胼胝體中分選Annexin V+和Annexin V-細(xì)胞，觀察到KO中的Annexin V+細(xì)胞比例高于WT(平均為4.38%vs.1.14%)。與Annexin V-細(xì)胞相比，Annexin V+細(xì)胞表達(dá)的小膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記基因水平較高，而其他CNS細(xì)胞類型表達(dá)的基因水平較低(圖3B)。這些結(jié)果表明，脫髓鞘期間KO胼胝體中的垂死小膠質(zhì)細(xì)胞比WT中更多，這可能是由于KO中凋亡小膠質(zhì)細(xì)胞的清除受損。為了具體評估這一假設(shè)，在WT組和KO組小膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)物中添加了凋亡小膠質(zhì)細(xì)胞(用Cytotox Red標(biāo)記)，并觀察到KO組小膠質(zhì)細(xì)胞對凋亡細(xì)胞的清除較WT組小膠質(zhì)細(xì)胞減少(P<0.01)，見圖3C。總之，這些結(jié)果表明，AMPAR是脫髓鞘后小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬作用所必需的。

注：A、胼胝體的降解MBP (dMBP)染色顯示基線時(shí)沒有dMBP，而在4周和4 + 3周時(shí)間點(diǎn)，KO中的dMBP水平升高(比例尺=500 μm)。B、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞、星形膠質(zhì)細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和OPCs的FACS分選的Annexin V-和Annexin V+細(xì)胞的基因組分?jǐn)?shù)。C、通過星形孢菌素培養(yǎng)小膠質(zhì)細(xì)胞以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，用Cytotox Red標(biāo)記，然后用WT或KO小膠質(zhì)細(xì)胞孵育。2 h后平均熒光強(qiáng)度的變化。NS，不顯著；*P<0.05，**P<0.01，***P < 0.0001

3 討論

精神分裂癥是一種嚴(yán)重而復(fù)雜的精神疾病，表現(xiàn)為多種癥狀和高發(fā)病率，對患者和社會產(chǎn)生深遠(yuǎn)影響[1]。然而，精神分裂癥的病因和發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明，并且在揭示精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)新療法方面仍然存在挑戰(zhàn)[12]。研究精神分裂癥的發(fā)病機(jī)制和評價(jià)藥物療效需要合適的動物模型。CPZ是一種銅螯合劑，可選擇性地?fù)p傷CNS中的髓鞘形成細(xì)胞少突膠質(zhì)細(xì)胞[8]。因此，CPZ誘導(dǎo)的動物模型已被用于模擬與精神分裂癥相關(guān)的白質(zhì)病變和行為。本研究采用CPZ喂食4周在小鼠中誘導(dǎo)精神分裂癥模型，并發(fā)現(xiàn)小鼠胼胝體中的有髓軸突和髓鞘幾乎完全缺失，但在停止CPZ喂食3周后恢復(fù)，證實(shí)了有髓軸突和髓鞘丟失參與精神分裂癥的病理過程。

小膠質(zhì)細(xì)胞是髓鞘再生所必需的，因?yàn)橄谛∧z質(zhì)細(xì)胞或阻斷小膠質(zhì)細(xì)胞信號傳導(dǎo)會導(dǎo)致髓鞘再生受損[13]。此外，與年齡相關(guān)的小膠質(zhì)細(xì)胞活動下降會導(dǎo)致髓磷脂清除受損和髓鞘再生缺陷[14]。許多精神分裂癥研究都支持谷氨酸假說，并集中在谷氨酸受體AMPAR的失調(diào)上，因?yàn)樗鼈冊谕挥|事件中發(fā)揮核心作用，包括可塑性、神經(jīng)元成熟、記憶形成和突觸發(fā)生[15]。在這項(xiàng)研究中，通過使用在神經(jīng)元發(fā)育早期消除GluA1、2和3 AMPAR亞基的小鼠系，檢查了小膠質(zhì)細(xì)胞中高度表達(dá)的AMPAR在髓鞘再生中的作用。結(jié)果證明了AMPAR是小膠質(zhì)細(xì)胞對脫髓鞘反應(yīng)所必需的，這是髓鞘再生過程的關(guān)鍵組成部分。此外，還發(fā)現(xiàn)AMPAR敲除小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞在吞噬和遷移方面都存在缺陷，從而導(dǎo)致髓鞘再生受損。

最近已經(jīng)確定了小膠質(zhì)細(xì)胞在精神分裂癥易感性中的作用[6]。本研究結(jié)果證明了AMPAR在小鼠脫髓鞘/髓鞘再生過程中小膠質(zhì)細(xì)胞活化中的作用。在培養(yǎng)的人骨髓細(xì)胞中，抑制AMPAR會降低髓鞘吞噬作用和抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)[16]。重要的是，與健康對照組相比，來自精神分裂癥患者的MDM吞噬髓鞘和上調(diào)IL-10的能力降低，并且表達(dá)的AMPAR(RNA和蛋白質(zhì))水平降低[17]。髓鞘碎片抑制CNS的恢復(fù)，是CNS修復(fù)的主要障礙之一[18]。特別是，髓磷脂碎片已被證明可抑制OPC分化和隨后的髓鞘再生[19]。然而，所涉及的細(xì)胞和分子機(jī)制在很大程度上是未知的。本研究在4周和4+3周時(shí)間點(diǎn)觀察到KO組較WT組小鼠中央和外側(cè)胼胝體中有過多的髓鞘碎片，證明了AMPAR在清除髓鞘碎片中的作用。此外，還證明了脫髓鞘期間KO組胼胝體中的垂死小膠質(zhì)細(xì)胞比WT組中更多，這可能與小膠質(zhì)細(xì)胞的清除受損有關(guān)。

總之，本研究在脫髓鞘和髓鞘再生的CPZ誘導(dǎo)的精神分裂癥模型中使用GluA1-3亞基敲除小鼠證實(shí)了AMPAR是小膠質(zhì)細(xì)胞對脫髓鞘和隨后的髓鞘再生的反應(yīng)所必需的，并且AMPAR在小膠質(zhì)細(xì)胞吞噬和遷移中具有重要作用。然而，本研究尚不清楚AMPAR通過何種途徑介導(dǎo)這些作用，未來有待進(jìn)一步研究。