李廣，崔曉，姚春鳳，陳東鴻，何凱，陳冠霖，韓煜軒，楊奇慧,3，遲淑艷,3*

(1.廣東海洋大學 水產(chǎn)學院，廣東 湛江 524088；2.廣東粵海飼料集團股份有限公司,廣東 湛江 524000；3.南方海洋科學與工程廣東省實驗室(湛江)，廣東 湛江 524025)

石斑魚Epinephelu作為中國四大海水養(yǎng)殖品種之一，養(yǎng)殖產(chǎn)量僅次于大黃魚Larimichthyscrocea[1]，在海水養(yǎng)殖中占據(jù)重要地位。但是，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴大，水環(huán)境、養(yǎng)殖管理及飼料等因素易導致石斑魚黏膜受損，如體表黏膜受損感染哈維氏弧菌Vibrioharveyi后出現(xiàn)皮膚潰瘍，腸道黏膜受損產(chǎn)生腸炎，從而降低養(yǎng)殖產(chǎn)量，造成經(jīng)濟損失[2]。腸炎作為石斑魚的一種常見病，雖非嚴重疾病，但由于腸道黏膜屏障損傷使機體防御能力下降會引起眾多并發(fā)癥。腸道物理屏障是腸黏膜屏障中最重要的一環(huán)，主要由腸上皮細胞與相鄰細胞間的連接蛋白構(gòu)成，包括緊密連接(tight junctions，TJ)、縫隙連接、黏附連接及橋粒。TJ位于連接復合體最頂端，是維持腸黏膜物理屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，其調(diào)控水、離子和小分子溶質(zhì)等物質(zhì)經(jīng)旁細胞途徑的轉(zhuǎn)運，是決定細胞間通透性的關(guān)鍵因素[3]。

TJ蛋白分為跨膜蛋白(Claudins家族、Occludin與Tricellulin等膜相關(guān)結(jié)構(gòu)域蛋白家族和連接黏附分子家族)和胞漿蛋白(ZO家族、扣帶素和絲狀肌動蛋白結(jié)合蛋白等)。其中，Claudins蛋白家族是構(gòu)成緊密連接的主要骨架蛋白，不僅可以調(diào)節(jié)細胞旁通透性，還參與機體抵抗病原體感染、促進器官發(fā)育和缺氧應激反應相關(guān)的生物學過程[4]。Claudins家族基因的分布具有明顯的組織特異性，且在不同魚類的組織分布中存在一定的差異。鯉Cyprinuscarpio腸道和肝臟均可高表達Claudin-3b和Claudin-3c亞型[5]，但鮭Oncorhynchusketa腸道卻不表達Claudin-3b，肝臟也不表達Claudin-3c[6]。值得關(guān)注的是，這種組織或細胞特異性表達模式與各Claudin分子所發(fā)揮的作用特點有關(guān)，有助于機體適應不同組織或不同部位的需要從而維持生理穩(wěn)態(tài)。

Claudins家族基因在飼糧因素的影響下可對腸道屏障發(fā)揮重要的調(diào)控作用。霉菌毒素可以通過降低特定亞型Claudin-3和Claudin-4的表達量破壞結(jié)腸癌細胞(Caco-2)的物理屏障性能[7]。海藻多糖可促進豬小腸上皮細胞緊密連接蛋白基因Claudin-1的表達，并且通過下調(diào)NF-κB炎癥信號通路相關(guān)基因表達維持上皮屏障功能，可有效預防腸道炎癥的發(fā)生[8]。飼糧中的大豆球蛋白會顯著降低草魚Ctenopharyngodonidellus后腸Claudin-3c基因的表達[9]，而適量的谷氨酸則可通過上調(diào)建鯉C.carpiovar Jian腸道Claudin-2、Claudin-3和Claudin-7基因的表達，維護腸道物理屏障[10]。精氨酸對腸細胞的增殖分化和維持細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)具有重要的保護作用，適量精氨酸可顯著上調(diào)草魚腸道Claudinc、Claudin-15a、Claudin-12和Claudin-3基因的表達水平[11]。本研究團隊前期通過石斑魚腸道染色切片(H.E)，觀察到適量精氨酸可改善石斑魚腸道皺襞高度和肌層厚度[12]。本研究中，克隆和分析了珍珠龍膽石斑魚Epinephelusfuscoguttatus♀×E.lanceolatus♂Claudin-3與Claudin-12的基因序列，并通過飼料精氨酸調(diào)控觀測兩基因在石斑魚腸道的表達豐度，評價Claudin-3與Claudin-12在珍珠龍膽石斑魚生長和腸道黏膜屏障中的作用，以期為石斑魚健康養(yǎng)殖提供科學參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用珍珠龍膽石斑魚幼魚購自廣東省湛江市東南碼頭石斑魚苗場。

1.2 方法

1.2.1 試驗設(shè)計

1)基因克隆及表達。挑選15尾體態(tài)健康、規(guī)格一致的石斑魚幼魚(初始體質(zhì)量11.0 g±0.5 g)，試驗設(shè)置3組，每組5尾，采用丁香酚麻醉后，于冰盤上解剖取其腦、鰓、皮膚、肌肉、肝臟、胃、前腸、中腸、后腸、頭腎、體腎、脾和心臟等13個組織，置于裝有RNAlater (Invitrogen 公司)的凍存管內(nèi)，投入液氮中速凍后移至-80 ℃超低溫冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2)精氨酸干預試驗。結(jié)合本團隊前期研究基礎(chǔ)[12]，設(shè)置3組分別含有1.96%、3.06%和3.74%精氨酸的等氮等脂試驗飼糧(表1)。每個處理設(shè)置3個平行，每個平行放養(yǎng)30尾珍珠龍膽石斑魚(初始體質(zhì)量為20.79 g±0.09 g)。每日8:00和17:00投喂兩次，飽食投喂8周。試驗用水為經(jīng)過沉淀、沙濾的天然海水，養(yǎng)殖期間水溫為(29±1)℃，鹽度為25，自然光照，持續(xù)供氧，溶解氧≥5 mg/L，養(yǎng)殖水體中氨氮含量≤0.03 mg/L。

養(yǎng)殖試驗結(jié)束后，將每個平行的魚進行稱重和計數(shù)，用于計算增重率和成活率。從每個平行隨機取3尾魚，剝離腸道取其中段，放入無酶凍存管中，立即投入液氮中速凍，隨后轉(zhuǎn)移到-80 ℃超低溫冰箱中保存，用于分析精氨酸對Claudin-3與Claudin-12基因mRNA表達的影響。

1.2.2 總RNA提取與逆轉(zhuǎn)錄 用Trizol試劑(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)提取各組織總RNA。通過10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性，并用紫外分光光度法(OD260 nm/OD280 nm)對RNA純度進行評估后，進行反轉(zhuǎn)錄(Revert Aid First Strand cDNA Synthesis Kit，F(xiàn)ermentas公司)。

1.2.3Claudin-3和Claudin-12基因克隆 根據(jù)NCBI提供的金頭鯛Sparusaurata、多刺棘光鰓鯛Acanthochromispolyacanthus、高體鰤Serioladumerili、貝氏隆頭魚Labrusbergylta、大刺鰍Mastacembelusarmatus等近緣物種的參考序列，采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計3條特異性5′RACE引物和2條特異性3′RACE引物(引物均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)。使用Super Script Ⅱ RT 酶和引物GSP-1 對總RNA進行目的基因第一鏈cDNA合成，使用RNase Mix 對合成的cDNA進行去RNA處理。使用GLASSMAX DNA isolation spin cartridges對經(jīng)RNAase處理過的cDNA進行純化。PCR擴增反應：95 ℃下預變性4 min；94 ℃下循環(huán)變性30 s，62 ℃下退火復性30 s，72 ℃下延伸1 min，共進行34個循環(huán)；最后在72 ℃下再延伸10 min,4 ℃下保存。PCR產(chǎn)物采用15 g/L瓊脂糖凝膠進行檢測，目的片段用瓊脂糖凝膠回收，將PCR回收產(chǎn)物與pMD18T克隆載體進行連接，轉(zhuǎn)化到DH-5A感受態(tài)細胞后獲得陽性克隆，送至生工生物工程(上海)有限公司進行測序。

1.2.4 實時定量PCR 13個組織及精氨酸干預試驗的腸道組織總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄后，進行實時熒光定量(TaKaRa SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ Kit)，反應體系為20 μL。qRT-PCR擴增反應：95 ℃下預變性30 s;95 ℃下循環(huán)變性15 s，58 ℃下退火復性34 s，72 ℃下延伸20 s，共進行40個循環(huán)。之后進行熔解曲線分析，結(jié)果以β-actin為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計算Claudin-3與Claudin-12基因的相對表達量，實時定量引物見表2。

1.2.5 序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析 使用ORF查找器(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)預測Claudin-3和Claudin-12氨基酸序列的OFR。使用SMART程序(http://smart.embl.de/)和Signal P軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/signal p/)預測蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)域和信號肽。使用DNAMAN 6.0對Claudin-3與Claudin-12的氨基酸多重序列進行比對，并利用MEGA 5.0軟件基于鄰接法構(gòu)建氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)生進化樹。

1.2.6 指標計算 增重率(%)和成活率(%)的計算公式為

增重率=(末均質(zhì)量-初均質(zhì)量)/初均質(zhì)量×

100%，

成活率=終末魚體數(shù)量/初始魚體數(shù)量×100%。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)均以平均值±標準誤(mean±S.E.)表示，采用SPSS 20.0軟件進行單因素方差分析(ANOVA)，采用Tukey法進行多重比較，顯著性水平設(shè)為0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 Claudin-3和Claudin-12基因克隆與序列分析

珍珠龍膽石斑魚的Claudin-3 cDNA全長序列為1 544 bp，包括一個153 bp的5′UTR和743 bp的3′UTR，ORF為648 bp，可編碼215個氨基酸的蛋白，預測該蛋白的相對分子質(zhì)量為23 100；使用SMART程序和Signal P軟件預測Claudin-3蛋白具有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號肽(圖1(a))。

珍珠龍膽石斑魚的Claudin-12 cDNA全長序列為1 236 bp，包括一個118 bp的5′UTR和92 bp的3′UTR，ORF為1 026 bp，可編碼341個氨基酸的蛋白，預測該蛋白的相對分子質(zhì)量為37 400；使用SMART程序和Signal P軟件預測Claudin-12蛋白具有3個跨膜結(jié)構(gòu)域，無信號肽(圖1(b))。

2.2 Claudin-3和Claudin-12氨基酸序列比對與系統(tǒng)發(fā)育分析

采用DNAMAN Package 6.0軟件進行氨基酸多序列比對，用MEGA 5.0采用鄰接法分別構(gòu)建Claudin-3和Claudin-12氨基酸序列的分子系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果如圖2～圖5所示。

珍珠龍膽石斑魚Claudin-3與斜帶石斑魚Epinepheluscoioides首先聚為一支，親緣關(guān)系最近，二者的同源性也最高，一致性高達98.14%，然后與高體鰤匯為一支，與兩棲類的爪蟾Xenopustropicalis、哺乳動物的人Homosapiens聚為不同分支，親緣關(guān)系較遠，同源性也較低(圖2、圖3、表3)；珍珠龍膽石斑魚Claudin-12首先與Echeneisnaucrates聚為一支，二者的同源性也最高，一致性高達91.79%，然后與庫舍劍尾魚Xiphophoruscouchianus匯為一支，與兩棲類的爪蟾、爬行類的森林響尾蛇Crotalushorridus和哺乳類的小鼠Musmusculus等物種的親緣關(guān)系較遠，同源性也較低(圖4、圖5、表3)。

表3 珍珠龍膽石斑魚Claudin-3與Claudin-12氨基酸序列與其他物種的同源性比對Tab.3 Homology comparison of amino acid sequences of Claudin-3 and Claudin-12 in hybrid grouper E.fuscoguttatus ♀ E.lanceolatus♂with other species

同一氨基酸呈黑色陰影，同源氨基酸呈灰色陰影；圖中使用的物種GenBank登錄號見表3；下同。Identity amino acids are shaded in black and homologous amino acids are shaded in grey；The GenBank accession numbers used here are the same as that in Table 3；et sequentia.圖2 Claudin-3氨基酸的多重序列比對Fig.2 Multi-alignment of Claudin-3 amino acid sequences

枝上節(jié)點旁數(shù)字表示Bootstrap驗證重復1 000次后的置信度，下同。The numbers represent bootstrap percentages，and the topology is tested using bootstrap analyses (1 000 replicates),et sequentia.圖3 基于鄰接法構(gòu)建的Claudin-3氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.3 Phylogenetic tree of Claudin-3 amino acid sequences based on Neighbor-joining method

圖4 Claudin-12氨基酸的多重序列比對Fig.4 Multi-alignment of Claudin-12 amino acid sequences

圖5 基于鄰接法構(gòu)建的Claudin-12氨基酸序列系統(tǒng)進化樹Fig.5 Phylogenetic tree of Claudin-12 amino acid sequences based on Neighbor-joining method

2.3 Claudin-3和Claudin-12基因的組織表達

從圖6可見：Claudin-3和Claudin-12基因在珍珠龍膽石斑魚的13種組織中均有表達；Claudin-3基因在鰓和體腎中的表達量顯著高于其他組織(P<0.05)，在中腸和肝臟中的基因表達量顯著高于其余9個組織(P<0.05)，其余9個組織中Claudin-3基因表達量相對較低；Claudin-12基因在腦中的表達量最高，與中腸、后腸和心臟相比無顯著性差異(P>0.05)，但顯著高于其他組織(P<0.05)，鰓、體腎、頭腎、脾中的Claudin-12基因表達量顯著高于胃、肝臟、肌肉和皮膚(P<0.05)，且這4個組織間無顯著性差異(P>0.05)。

2.4 飼料中精氨酸對石斑魚生長和存活的影響

從表4可見：飼料中的精氨酸水平對珍珠龍膽石斑魚存活率無顯著性影響(P>0.05)；3.06%精氨酸組石斑魚的增重率最高，較1.96%組顯著高出69.21%(P<0.05)，較3.74%組顯著高出9.42%(P<0.05)，但1.96%精氨酸組與3.74%精氨酸組魚體增重率無顯著性差異(P>0.05)。

表4 飼料中精氨酸水平對石斑魚存活率和增重率的影響Tab.4 Effects of dietary arginine levels on survival and weight gain of hybrid grouper Epinephelus fuscoguttatus ♀×E.lanceolatus♂

2.5 精氨酸對腸道緊密連接蛋白的影響

從圖7可見：以1.96%精氨酸組為對照，飼糧中含3.06%精氨酸顯著上調(diào)了珍珠龍膽石斑魚腸道Claudin-3表達水平(P<0.05)，其余兩組間相比無顯著性差異(P>0.05)；1.96%精氨酸組Claudin-12表達量顯著低于3.06%精氨酸組(P<0.05)，但顯著高于3.74%精氨酸組(P<0.05)。

圖7 飼料精氨酸水平對腸道中Claudin-3和Claudin-12基因相對表達量的影響Fig.7 Effected of dietary arginine levels on relative mRNA expression levels of Claudin-3 and Claudin-12 genes in intestine

3 討論

3.1 系統(tǒng)發(fā)育樹分析

對人類的研究表明，Claudins家族包括25個成員，每一個Claudin分子均由4個跨膜結(jié)構(gòu)域組成，可以與ZO-1、ZO-2及Claudin1-8序列羧基末端結(jié)合，還可與鄰近細胞相接觸，通過同源性或異源性接觸調(diào)節(jié)細胞連接處的選擇滲透性[13-14]，構(gòu)成緊密連接復合物的主鏈。本研究中,通過RT-PCR 技術(shù)克隆獲得了珍珠龍膽石斑魚Claudin-3和Claudin-12基因,Claudin-3 cDNA全長為1 544 bp，其中，開放閱讀框為648 bp，可編碼215個氨基酸的蛋白，該蛋白含有4個跨膜結(jié)構(gòu)域，而cDNA全長為1 236 bp的Claudin-12基因，可編碼341個氨基酸的蛋白，該蛋白含有3個跨膜結(jié)構(gòu)域。通過對各物種氨基酸序列的比對結(jié)果進行分析，珍珠龍膽石斑魚Claudin-3氨基酸序列與斜帶石斑魚的同源性最高，一致性高達98.14%，與鱸形目關(guān)系較遠的斑點叉尾鮰(鲇形目)也有70.37%的一致性，整體上氨基酸序列一致性為65.91%～98.14%，由此推測，Claudin-3氨基酸序列具有較高的保守性。通過系統(tǒng)發(fā)育樹可知，魚類的Claudin-3 獨立聚成一支，最終與其他物種匯聚成的分支聚為一支，雖然位于不同的進化分支，但它們具有一定的親緣關(guān)系。而珍珠龍膽石斑魚Claudin-12與同為鱸形目科的有91.79%的一致性，與其他鲀科、花鳉科、鯉科同源性較低，與其余物種氨基酸一致性為50.93%～91.79%。

標有不同字母者表示組間有顯著性差異(P<0.05)，標有相同字母者表示組間無顯著性差異(P>0.05),下同。The means with different letters are significantly different at the 0.05 probability level,and the means with the same letter are not significant differences,et sequentia.圖6 Claudin-3和Claudin-12基因的組織表達分布Fig.6 Tissue expression distribution of Claudin-3 and Claudin-12 genes

3.2 Claudin-3與Claudin-12在相應組織中的表達機理

Claudin-3蛋白是決定人體血腦屏障緊密連接的主要成分[15]。Clelland等[16]研究顯示，Claudin-3蛋白亞型還可能在調(diào)節(jié)溶質(zhì)通過上皮細胞旁路的運動中發(fā)揮作用，參與魚類體內(nèi)鹽和水平衡的穩(wěn)態(tài)調(diào)控。魚類的鰓、腎和腸道均為調(diào)節(jié)機體滲透壓的重要器官，本研究中，Claudin-3基因在珍珠龍膽石斑魚鰓、體腎和中腸中的相對表達量較高，因此，推測珍珠龍膽石斑魚的Claudin-3基因在鰓、體腎和腸道的結(jié)構(gòu)完整性及其調(diào)節(jié)水、鹽平衡和屏障功能中發(fā)揮重要作用。通過抑制小鼠腦毛細血管中Claudin-12基因的表達，可增加腦血管的滲透調(diào)節(jié)，誘導?；撬岷图“彼岬饶芰烤徑馕镔|(zhì)輸入，改變了腦部毛細血管物質(zhì)轉(zhuǎn)運的功能[17]。本研究中，Claudin-12基因在珍珠龍膽石斑魚中腸和后腸的表達水平僅低于腦部，高于其他各組織，提示該基因表達水平對腸道的功能具有較大的影響。珍珠龍膽石斑魚腸道Claudin-3與Claudin-12基因在各組織的整體表達水平表明，其可能在魚體腸道的水、鹽滲透平衡及屏障功能的維護調(diào)節(jié)方面較多地發(fā)揮作用。

3.3 精氨酸對腸道緊密連接蛋白的影響

腸道是魚類重要的營養(yǎng)和免疫器官之一，發(fā)揮消化和吸收營養(yǎng)物質(zhì)、參與攝食調(diào)控類激素的分泌及抵抗病原微生物和食物抗原等作用[18]。緊密連接蛋白在腸道中作為一個高度動態(tài)的屏障結(jié)構(gòu)，通過調(diào)節(jié)細胞間的通透性而選擇性吸收水分、離子及營養(yǎng)物質(zhì)，維持其結(jié)構(gòu)完整性，緊密連接蛋白的表達量在一定程度上可以反映腸道物理屏障功能[19-21]，如草魚中腸損傷后Claudin-12 表達顯著降低[22]。營養(yǎng)物質(zhì)可有助于維持緊密連接蛋白結(jié)構(gòu)完整性，研究表明，精氨酸可通過調(diào)節(jié)生長中期草魚緊密連接蛋白基因表達保護銅誘導的破壞鰓上皮屏障結(jié)構(gòu)[23]，可以增加草魚腸道絨毛長度、隱窩深度、腸壁厚度和隱窩寬度，改善營養(yǎng)物質(zhì)吸收的有效區(qū)域，增加營養(yǎng)吸收效率，提高終末體質(zhì)量[11]。本研究團隊前期試驗也表明，斜帶石斑魚腸道的皺襞高度和肌層厚度受到精氨酸的顯著影響，與其生長狀況呈正相關(guān)[12]。本試驗中，3.06%精氨酸組對石斑魚生長具有改善作用，而該組腸道Claudin-3與Claudin-12基因mRNA表達也顯著上調(diào)，生長效果與腸道Claudin-3和Claudin-12基因表達趨勢相呼應，進一步說明飼料中適量精氨酸可通過上調(diào)石斑魚腸道Claudin-3與Claudin-12基因表達，改善腸道屏障作用，提高魚的存活率和增重率。研究表明，不同Claudins基因異常引起腸道疾病的病理機制不同，如Claudin-3減少溶質(zhì)和水的細胞旁轉(zhuǎn)運，即增強了屏障作用，而Claudin-12增加溶質(zhì)和水的細胞旁轉(zhuǎn)運，即削弱了屏障作用，這分別致使小溶質(zhì)和水分泌通道增加，可能導致腹瀉;大分子的吸收通過通道增加，誘發(fā)炎癥反應[24]。本試驗中，3.06%精氨酸組石斑魚腸道Claudin-12基因表達上調(diào)，結(jié)合前期試驗切片的觀察，不僅未產(chǎn)生石斑魚腸道炎癥，反而改善其生長，同時3.74%精氨酸組該基因表達顯著高于1.96%精氨酸組，盡管生長未出現(xiàn)顯著性差異，但提示低濃度精氨酸相對于高濃度精氨酸對Claudin-12基因表達有抑制作用。

4 結(jié)論

1)使用同源克隆及RACE PCR技術(shù)克隆得到珍珠龍膽石斑魚Claudin-3和Claudin-12基因的全長，分別為1 544 bp和1 236 bp。

2)Claudin-3基因在珍珠龍膽石斑魚鰓、體腎和中腸中的相對表達量較高，可能在調(diào)節(jié)水、鹽平衡和屏障功能中發(fā)揮重要作用。Claudin-12在中腸和后腸的表達水平僅低于腦部，高于其他各組織，提示該基因表達水平對腸道的功能具有較大影響。

3)飼料中適量精氨酸可通過上調(diào)石斑魚腸道Claudin-3與Claudin-12基因表達，改善腸道屏障作用，從而提高魚的存活率和增重率。低濃度精氨酸相對于高濃度精氨酸對Claudin-12基因表達有抑制作用。