李彥奇，趙瓊珍，劉金瑞，黃衛(wèi)東，2*

(1.新疆碳智干細(xì)胞庫有限公司，圖木舒克 844000；2.新疆佳音醫(yī)院，烏魯木齊 830000)

體外受精(IVF)技術(shù)使女性輸卵管損傷、排卵失敗或男性因素不育的多數(shù)夫婦獲得妊娠，但臨床上仍然存在部分夫婦在IVF周期中出現(xiàn)完全受精失敗(TFF)的情況。TFF是指在一個(gè)周期中所有卵母細(xì)胞的受精失敗。據(jù)報(bào)道，在正常精子存在的情況下，IVF后TFF的發(fā)生率為4%～16%[1]。目前，普遍認(rèn)為卵母細(xì)胞活化失敗(OAF)似乎是導(dǎo)致TFF的主要原因[2]。勒布原理指出精子在受精、促進(jìn)細(xì)胞分裂和父系遺傳方面具有重要作用[3]，按照勒布的說法，精子的第二個(gè)作用是其特異性蛋白和因子觸發(fā)Ca+2振蕩激活卵母細(xì)胞，而且精子中心粒引導(dǎo)卵母細(xì)胞和精子核形成合子核[4]。這些研究結(jié)果表明，精子在卵母細(xì)胞活化、受精卵形成方面都具有積極作用。雖然目前關(guān)于TFF的研究主要集中在男性因素，但女性因素也不容忽視。排除卵母細(xì)胞儲(chǔ)備減少的周期，TFF率為1%～5%[5]。卵胞質(zhì)內(nèi)異常的紡錘體及微管結(jié)構(gòu)會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)異常模式的發(fā)生而影響受精過程[6]。卵母細(xì)胞中異常線粒體或三磷酸肌醇(IP3)信號(hào)通路導(dǎo)致Ca2+振蕩異常，使激酶/磷酸化酶信號(hào)通路異常，皮質(zhì)反應(yīng)異常，導(dǎo)致受精失敗[7]。TFF的遺傳原因是未知的，也可能是多種因素造成的，雖然通常歸因于精子因素，也極有可能是卵母細(xì)胞異常在其中起到關(guān)鍵作用。因此，本研究旨在通過對(duì)IVF周期中經(jīng)歷TFF的夫婦進(jìn)行全外顯子測(cè)序，鑒定篩選與TFF相關(guān)的候選基因，并分析其功能，以期為進(jìn)一步研究其作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

材料與方法

一、研究對(duì)象

選取2019年11月至2021年5月就診于新疆佳音醫(yī)院的IVF助孕患者，將IVF后出現(xiàn)TFF的夫婦作為實(shí)驗(yàn)組，納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性年齡≤40歲；(2)染色體核型正常(46，XN)；(3)輔助生殖治療中，女性獲卵數(shù)>4個(gè)/周期；(4)周期中所有卵母細(xì)胞均受精失??；(5)排除ICSI及補(bǔ)救ICSI。對(duì)照組選擇行IVF后至少生育一個(gè)正常孩子的夫婦，納入標(biāo)準(zhǔn)：同實(shí)驗(yàn)組(1)、(2)、(3)；(4)助孕周期中未見異常受精情況。參照WHO第5版人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)，納入研究的所有男性精液常規(guī)檢查結(jié)果均正常。

根據(jù)納入標(biāo)準(zhǔn)，實(shí)驗(yàn)組共有64對(duì)夫婦，對(duì)照組共157對(duì)夫婦。本研究已通過倫理審查會(huì)批準(zhǔn)(JKLL-KY20201221-01)，所有研究對(duì)象均簽署知情同意書。

二、研究方法

1.精液常規(guī)檢測(cè)：患者手淫取精，充分液化后參照WHO第5版人類精液檢查與處理實(shí)驗(yàn)手冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)，進(jìn)行精液常規(guī)分析。

2.全外顯子測(cè)序及基因注釋：采集實(shí)驗(yàn)組64對(duì)夫婦和對(duì)照組157對(duì)夫婦的外周血 5 ml，用血液基因組DNA提取試劑盒(北京天根生化科技)提取DNA。使用Illumina Novaseq 6000高通量測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行全外顯子組基因測(cè)序檢測(cè)，AdapterRemoval軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行處理，使用bwa軟件將數(shù)據(jù)與人類標(biāo)準(zhǔn)參考序列hg19版本比對(duì)，經(jīng)去除重復(fù)讀長(zhǎng)后，再采用sentieon軟件的Haplotyper算法進(jìn)行SNP檢測(cè)，最后使用GATK的VariantFiltration進(jìn)行過濾，生成可用于后續(xù)分析的vcf文件。同時(shí)對(duì)目標(biāo)區(qū)域的覆蓋度及測(cè)序質(zhì)量進(jìn)行評(píng)估。將所有的SNP與dbSNP以及千人基因組數(shù)據(jù)庫進(jìn)行基因注釋。

3.變異基因的篩選及驗(yàn)證：使用“overlap”法篩選基因突變，該突變僅存在于實(shí)驗(yàn)組中，而對(duì)照組中不存在，顯著縮小研究范圍。隨后利用OMIM(https：//www.omim.org/)、The Human Protein Atlas(https：//www.proteinatlas.org/)、Pubmed(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/)和GeneCards(http：//www.genecards.org/)等公共數(shù)據(jù)庫，對(duì)IVF 中TFF的顯著性差異基因位點(diǎn)進(jìn)行篩選和功能驗(yàn)證。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、基礎(chǔ)資料比較

本研究共納入實(shí)驗(yàn)組64對(duì)夫婦，對(duì)照組157對(duì)夫婦。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，兩組患者在女性平均年齡、獲卵數(shù)、男性平均年齡、精子濃度及精子活力的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 基礎(chǔ)資料比較(-±s)

二、兩組患者的差異突變基因分布情況

根據(jù)不同組別的SNP位點(diǎn)的突變頻率的不同，使用chisq.test(data)命令進(jìn)行卡方檢驗(yàn)(chi-square test)，選擇P<0.05的位點(diǎn)，在女性和男性群體中分別篩選到812和823個(gè)顯著性位點(diǎn)，分別位于606和611個(gè)基因上。其中，非同義突變最多，終止變異最少，所有變異皆位于常染色體(表2)。

表2 基因變異分布情況

三、兩組患者的顯著性基因頻率統(tǒng)計(jì)

采用“overlap”法，分析實(shí)驗(yàn)組中含有、但對(duì)照組沒有的變異位點(diǎn)，同時(shí)剔除同義突變。在實(shí)驗(yàn)組女性中獲得148個(gè)顯著基因共164個(gè)突變位點(diǎn)，在實(shí)驗(yàn)組男性中獲得120個(gè)顯著基因共132個(gè)突變位點(diǎn)。

經(jīng)數(shù)據(jù)庫篩選，將磷酯酶Cγ1(PLCG1)、驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員2B(KIF2B)和驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員4B(KIF4B)基因作為TFF的候選基因。其中基因PLCG1的rs2228246位點(diǎn)突變屬于雜合突變，實(shí)驗(yàn)組中有4人攜帶變異，突變率為6.15%(4/64)，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組存在顯著性差異(P<0.05)；在男性實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組群體中，基因KIF2B的rs76337756位點(diǎn)和KIF4B的rs10056252位點(diǎn)也屬于雜合突變，分別有3人攜帶，突變率為4.61%(3/64)，且在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組中均存在顯著差異(P<0.05)(表3)。

表3 顯著性基因頻率統(tǒng)計(jì)(部分)

四、候選基因的功能分析及驗(yàn)證

經(jīng)GeneCards(http：//www.genecards.org/)和The Human Protein Atlas(https：//www.proteinatlas.org/)分析工具對(duì)PLCG1、KIF2B和KIF4B基因功能進(jìn)行驗(yàn)證。PLCG1與IP3 的產(chǎn)生有關(guān)，IP3可作為第二信使分子激活PKC、引起細(xì)胞內(nèi)Ca+2釋放。PLCG1基因在子宮、子宮內(nèi)膜、宮頸組織中高表達(dá)，在管周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中高度表達(dá)(圖1)。KIF2B基因的突變將導(dǎo)致有絲分裂進(jìn)展延遲，出現(xiàn)單極或無序紡錘體，以及雙核或死細(xì)胞數(shù)量增加。KIF2B基因在睪丸、精母細(xì)胞中高度表達(dá)，其他組織及細(xì)胞中沒有表達(dá)(圖2)。KIF4B基因在后期紡錘體動(dòng)力學(xué)和胞質(zhì)分裂、有絲分裂期間染色體分離中起作用；還可能在有絲分裂染色體定位和雙極紡錘體穩(wěn)定中發(fā)揮作用。KIF4B基因在睪丸組織、精母細(xì)胞中高度表達(dá)，其他組織及細(xì)胞中表達(dá)較低(圖3)。

A：細(xì)胞表達(dá)特異性；B：組織表達(dá)特異性(來源https：//www.proteinatlas.org/)

A：細(xì)胞表達(dá)特異性；B：組織表達(dá)特異性(來源：https：//www.proteinatlas.org/)

A：細(xì)胞表達(dá)特異性；B：組織表達(dá)特異性(來源：https：//www.proteinatlas.org/)

討 論

全外顯子組只占整個(gè)人類基因組的1%～2%，但其中對(duì)人類疾病有影響的基因突變有85%[8]。全外顯子組測(cè)序可以針對(duì)基因組中的蛋白質(zhì)編碼區(qū)靶向富集外顯子區(qū)域測(cè)序。本研究中發(fā)現(xiàn)了4例在IVF周期中發(fā)生PLCG1基因雜合突變的TFF女性患者，在男性群體中發(fā)現(xiàn)了3例KIF2B和3例KIF4B基因突變的TFF患者，這三個(gè)基因突變均沒有在對(duì)照組中發(fā)現(xiàn)。因此，這3個(gè)候選基因突變可能是IVF 中TFF的致病突變位點(diǎn)。

TFF的原因非常復(fù)雜[9]。受精過程涉及一系列連續(xù)的步驟，從精子和卵母細(xì)胞膜的識(shí)別和融合開始，隨后觸發(fā)持續(xù)的胞質(zhì)鈣(Ca+2) 振蕩，這是刺激胚胎發(fā)育所必需的，Ca+2振蕩數(shù)小時(shí)的持續(xù)是卵母細(xì)胞活化的常見信號(hào)，并開始復(fù)雜的發(fā)育過程以形成受精卵[10]。

經(jīng)過GeneCards數(shù)據(jù)庫的基因功能驗(yàn)證，PLCG1基因位于20號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，與IP3 的產(chǎn)生有關(guān)，而IP3可作為第二信使分子激活PKC、引起細(xì)胞內(nèi)Ca+2釋放。PLCG1基因編碼蛋白在子宮內(nèi)膜、子宮、宮頸等女性生殖部位有較高表達(dá)。該基因編碼蛋白與精子卵母細(xì)胞磷脂酶C zeta 1(PLCZ1)同屬磷脂酶C(PLC)家族，該家族成員均具有保守性的C2結(jié)構(gòu)域、EF結(jié)構(gòu)域、PH結(jié)構(gòu)域[11]。大量研究表明，PLCZ1通過IP3途徑參與卵母細(xì)胞激活和原核形成，對(duì)受精后卵細(xì)胞狀態(tài)的激活至關(guān)重要[12]。有證據(jù)表明，PLCZ1在胚胎發(fā)育中具有潛在的作用，尤其是在胚胎早期分裂過程中[13]。研究顯示，女性生殖道環(huán)境對(duì)精子運(yùn)輸和受精過程中也具有重要作用[14]。因此，PLCG1基因可能參與女性受精過程中的機(jī)制調(diào)節(jié)，該基因的突變可能導(dǎo)致受精的失敗。

KIF2B基因位于17號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，屬于驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員，編碼微管運(yùn)動(dòng)蛋白，其特征在于驅(qū)動(dòng)蛋白結(jié)構(gòu)域位于多肽中間。KIF2B基因促進(jìn)微管運(yùn)動(dòng)，活躍在中心體上，參與雙極紡錘體組裝、胞質(zhì)分裂和染色體運(yùn)動(dòng)等多個(gè)有絲分裂過程中的關(guān)鍵事件。KIF2B基因編碼蛋白在睪丸、精母細(xì)胞中高度表達(dá)，其他組織及細(xì)胞中均沒有表達(dá)。KIF4B基因位于5號(hào)染色體的長(zhǎng)臂上，也屬于驅(qū)動(dòng)蛋白家族成員。該基因參與ATP依賴性微管運(yùn)動(dòng)活動(dòng)、有絲分裂胞質(zhì)分裂、有絲分裂紡錘體中區(qū)組裝等，在后期紡錘體動(dòng)力學(xué)和胞質(zhì)分裂中起著至關(guān)重要的作用，而且在有絲分裂染色體定位和雙極紡錘體穩(wěn)定中也發(fā)揮作用。KIF4B基因編碼蛋白在睪丸組織、精母細(xì)胞中高度表達(dá)，其他組織及細(xì)胞中表達(dá)較低。鞭毛是精子的尾巴，是雄性生育和有性繁殖的重要條件，它含有許多由微管蛋白組成的小管。鞭毛必須要以非常精準(zhǔn)和協(xié)調(diào)的方式跳動(dòng)，才能使精子逐步游動(dòng)，否則，則導(dǎo)致男性不育。有研究顯示，微管蛋白糖基化的酶修飾是讓精子保持直線游動(dòng)的關(guān)鍵[15]。中心體參與胞內(nèi)細(xì)胞骨架的形成、有絲分裂紡錘體的形成等許多功能。在一些畸形精子患者中，精子中心體功能表現(xiàn)出受損的情況使得受精產(chǎn)生障礙[16]。精子中心體對(duì)于鞭毛的發(fā)生起著至關(guān)重要的作用。在鞭毛的形成中，中心體遷移到細(xì)胞外圍，以中心粒為基體啟動(dòng)軸絲的組裝[17]，中心粒功能障礙也會(huì)導(dǎo)致精子尾部鞭毛的缺失[18]。目前關(guān)于KIF2B基因的研究發(fā)現(xiàn)，其與腦蛋白疏松癥[19]、肺腺瘤[20]有關(guān)；KIF4B基因與肝細(xì)胞癌[21]、胰腺癌[22]等疾病有關(guān)，在人類受精的研究中都未見報(bào)道?；谝陨戏治?，推測(cè)KIF2B和KIF4B基因可能參與精子鞭毛的形成及運(yùn)動(dòng)，但其具體功能還需進(jìn)一步研究。

本研究全外顯子測(cè)序技術(shù)篩選到與TFF相關(guān)的PLCG1、KIF2B和KIF4B這3個(gè)基因，通過生物信息方法初步分析了基因功能，但這3個(gè)基因在TFF發(fā)生過程中的確切作用及其機(jī)制還需進(jìn)一步探索。