寇德麟，楊豐偉，吳征宇，劉晴晴，毛碧瑩，謝柯沁，王鴻飛，許 鳳

（寧波大學(xué)食品與藥學(xué)學(xué)院，浙江 寧波 315211）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種天然的非蛋白質(zhì)的功能性氨基酸[1]，也是一種新型的功能食品因子[2]，許多研究表明，它在降低血壓[3]、誘導(dǎo)放松和增強(qiáng)免疫[4]、改善視覺(jué)皮層功能[5]、提高肝臟應(yīng)激功能、降低癌癥發(fā)病率等多個(gè)方面[6-7]起到重要的作用，因此研發(fā)富含GABA的相關(guān)產(chǎn)品是當(dāng)前研究的重點(diǎn)。植物性來(lái)源的GABA因其安全性高而受到廣泛的關(guān)注，但大多數(shù)植物體內(nèi)的GABA含量很低，僅為0.3～32.5μmol·g-1[8-9]，因此采用適當(dāng)?shù)姆椒ㄊ怪参矬w內(nèi)的GABA得到有效的富集可以拓寬目前GABA的植物性來(lái)源。前期研究發(fā)現(xiàn)，外源甘露糖處理青花菜芽菜可以通過(guò)GABA富集的兩條途徑影響GABA含量，且不影響芽菜本身的功能性物質(zhì)[10]。

近年來(lái)，隨著居民生活水平的提高，人們對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)健康方面注重程度提高，酸奶因其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值而受到消費(fèi)者青睞[11-12]。通過(guò)在乳制品中加入適當(dāng)?shù)墓δ苄晕镔|(zhì)可以提高其市場(chǎng)競(jìng)爭(zhēng)力[13-14]。Abdel-Hamid等[15]研發(fā)了一種具有抗氧化性和抗菌活性的添加羅漢果提取物的酸奶，付榮霞等[16]也研發(fā)了一種具有良好食療效果的山藥薏米芡實(shí)褐色酸奶。傳統(tǒng)生產(chǎn)過(guò)程中，在酸奶發(fā)酵以后加入水果果粒、果蔬汁等添加物，但它們不參與發(fā)酵[17]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，在發(fā)酵過(guò)程中，微生物的代謝作用可以影響果蔬本身的活性物質(zhì)[18]，例如范媛媛等[19]利用乳酸菌和酵母菌協(xié)同發(fā)酵發(fā)芽糙米來(lái)制備GABA。韓梅等[20]雖然也研制了一款富含GABA的酸奶，但其是利用優(yōu)化后的菌種進(jìn)行發(fā)酵制成的，而通過(guò)外源添加富含GABA的青花菜芽菜，同時(shí)利用乳酸菌發(fā)酵來(lái)進(jìn)一步提升其含量的方法研究較少。

本試驗(yàn)通過(guò)向酸奶中添加青花菜芽菜，并利用發(fā)酵技術(shù)來(lái)制作一種富含GABA的酸奶，通過(guò)單因素和響應(yīng)面試驗(yàn)研究青花菜芽菜添加量、白砂糖添加量、菌種接種量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶品質(zhì)的影響，并測(cè)定最優(yōu)條件下制備出的青花菜芽菜酸奶的各項(xiàng)理化指標(biāo)，為功能性乳制品的研發(fā)開(kāi)拓新的方向。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

青花菜種子：品種為炎秀，日本坂田；全脂純牛奶：內(nèi)蒙古伊利實(shí)業(yè)集團(tuán)股份有限公司；葡萄糖：南京甘汁園糖業(yè)有限公司；5菌型酸奶發(fā)酵劑：北京川秀科技有限公司；白砂糖：太古糖業(yè)有限公司；次氯酸鈉、甲醇、氯化鑭、氫氧化鉀、硼砂、四硼酸鈉、苯酚、無(wú)水乙醇，均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

DYJ-S6108型種子機(jī)：廣東佛山小熊官方旗艦店；AFX-2001-U型超純水機(jī)：上海純浦實(shí)業(yè)有限公司；745型紫外分光光度計(jì)：上海美譜達(dá)科技有限公司；BPZ11D型分析天平：德國(guó)賽多利斯公司；FJL型酸奶發(fā)酵機(jī)：煙臺(tái)凱達(dá)電器有限公司；DW-HL528型超低溫冷凍儲(chǔ)存箱：中科美菱低溫科技股份有限公司；RT2122型電磁爐：美的集團(tuán)；XHF-D型高速分散器（內(nèi)切式均質(zhì)機(jī)）：寧波新芝生物科技股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 最適外源糖處理芽菜濃度的篩選

1.2.1.1 青花菜芽菜的培養(yǎng)

挑選完整、飽滿(mǎn)、無(wú)病害的種子，用1.5%次氯酸鈉消毒15 min，純凈水沖洗3次，30℃水浴4 h，將種子置于發(fā)芽機(jī)中。分別配制濃度為0、30、60、90、120、150 mmol·L-1的葡萄糖溶液作為培養(yǎng)液，每天更換培養(yǎng)液。培養(yǎng)8 d后去除芽菜根部取樣，用液氮速凍后置于-80℃冰箱進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.2.1.2 GABA的提取

準(zhǔn)確稱(chēng)取0.4 g樣品置于研缽中，加入400μL甲醇研磨，靜置，待甲醇完全揮干后加入2mL 70mmol·L-1氯化鑭，轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，室溫下振蕩15 min，10000 r·min-1離心15 min。轉(zhuǎn)移1.6 mL上清液到新離心管中，加入320μL 1 mol·L-1氫氧化鉀，室溫振蕩5 min，上清液即為待測(cè)液體。

1.2.1.3 GABA含量的測(cè)定

GABA含量測(cè)定參考Hu等[21]的方法。取0.2 mL上清液按順序加入0.6 mL 0.2 mol·L-1硼酸緩沖液（pH 9.0）、2 mL 5%苯酚溶液、1 mL 6%次氯酸鈉溶液并分別搖勻，放入沸水浴中加熱5 min，并立即冰浴5 min，溶液出現(xiàn)藍(lán)綠色，此時(shí)加入2.0 mL 60%酒精終止反應(yīng)，在645 nm處測(cè)定吸光度。分別配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 g·mL-1的GABA標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照上述方式測(cè)定相應(yīng)的吸光度，并以吸光度為縱坐標(biāo)，相應(yīng)的GABA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，繪制GABA含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線并擬合標(biāo)準(zhǔn)方程。試驗(yàn)重復(fù)進(jìn)行3次。

1.2.2 青花菜芽菜酸奶制作工藝流程

青花菜芽菜、全脂純牛奶、白砂糖→調(diào)配→均質(zhì)→滅菌→冷卻→接種→密封發(fā)酵→后熟→成品

1.2.3 操作要點(diǎn)

1.2.3.1 青花菜芽菜的處理

按照“1.2.1”的方法，以最適葡萄糖處理濃度培養(yǎng)青花菜芽菜，將芽菜去除根部、挑除種皮后，用無(wú)菌紗布包裹，放入沸水中煮1～2 min，瀝干殘余水分。

1.2.3.2 調(diào)配、均質(zhì)

奶瓶使用前沸水浴高溫滅菌，倒置冷卻干燥，加入均質(zhì)后的青花菜芽菜、純牛奶、白砂糖，適當(dāng)加熱使白砂糖溶解。

1.2.3.3 滅菌、冷卻

將混合均勻的乳制品在高溫下滅菌處理，迅速蓋上蓋子，保持密封狀態(tài)，在室溫下冷卻。

1.2.3.4 接種、發(fā)酵

在無(wú)菌操作的條件下分別在冷卻的乳制品中接入發(fā)酵劑，充分混勻并封口。設(shè)置發(fā)酵溫度為42℃，發(fā)酵后呈凝固狀態(tài)的酸奶即為半成品。

1.2.3.5 后熟、成品

將酸奶在4℃條件下冷藏后熟16 h即為成品。

1.2.4 富含GABA酸奶的感官評(píng)定細(xì)則

邀請(qǐng)15位有一定感官評(píng)定基礎(chǔ)的食品學(xué)院學(xué)生組成感官評(píng)定小組，分別從色澤、滋味、組織、氣味4方面對(duì)酸奶進(jìn)行感官評(píng)定，評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。

表1 富含GABA的青花菜芽菜酸奶感官評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Reference of sensory score indicatorsof GABA riched broccolisprout yogurt

1.2.5 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

設(shè)置基礎(chǔ)試驗(yàn)條件為：青花菜芽菜添加量2%，白砂糖添加量7%，菌種接種量0.3%，發(fā)酵時(shí)間6 h。改變單一因素用量，分別考察不同青花菜芽菜添加量（0、1%、2%、3%、4%）、白砂糖添加量（5%、6%、7%、8%、9%）、菌種接種量（0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及發(fā)酵時(shí)間（4、5、6、7、8 h）對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響，確定各因素的最適范圍。

1.2.6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，利用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以感官評(píng)分為響應(yīng)值，利用Design-Expert 11.0軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，從而確定最優(yōu)的富含GABA青花菜芽菜的酸奶發(fā)酵工藝，試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平Table 2 Factors and levels of response surface experiment

1.2.7 酸奶中GABA含量測(cè)定

方法同“1.2.1.3”，將酸奶于10 000 r·min-1條件下離心5 min，取0.2 mL酸奶上清液進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.8 理化及微生物指標(biāo)測(cè)定

1.2.8.1 酸度及蛋白質(zhì)含量

酸度：使用酸度計(jì)測(cè)定。

蛋白質(zhì)含量：采用GB 5009.5—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》[22]中的分光光度法測(cè)定。

1.2.8.2 微生物指標(biāo)

乳酸菌：采用GB 4789.35—2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[23]中乳酸細(xì)菌培養(yǎng)基（MRS）培養(yǎng)基的方法測(cè)定。

金黃色葡萄球菌：采用GB 4789.10—2016《食品國(guó)家安全標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 金黃色葡萄球菌檢驗(yàn)》[24]中金黃色葡萄球菌平板計(jì)數(shù)法測(cè)定。

1.2.9 數(shù)據(jù)處理

采用Origin Pro 9.0和SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析，用鄧肯氏多重比較法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著。以上指標(biāo)均取3個(gè)平行樣，重復(fù)測(cè)定3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 最適外源糖處理濃度對(duì)青花菜芽菜培養(yǎng)中GABA含量的影響

由圖1可以看出，在不同濃度的葡萄糖處理下，青花菜芽菜中的GABA含量呈現(xiàn)下降—上升—下降的趨勢(shì)，在處理濃度為120 mmol·L-1時(shí)達(dá)到最高。因此，選用濃度為120mmol·L-1的葡萄糖培養(yǎng)出來(lái)的芽菜GABA富集效果最好。

圖1 不同濃度的葡萄糖處理對(duì)GABA含量的影響Fig.1 Effectsof different glucoseconcentrationson GABA contents in yogurt

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 青花菜芽菜添加量對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響

由圖2可以看出，在芽菜添加量為0～2%時(shí)，隨著芽菜添加量的增加，酸奶的感官評(píng)分隨之升高，正是由于芽菜的加入，使酸奶具有良好的色澤（呈青綠色）且具有芽菜的獨(dú)特清香。在芽菜添加量達(dá)到2%時(shí)，酸奶的色澤與口感都達(dá)到最好的平衡；而當(dāng)芽菜添加量大于2%時(shí)，感官評(píng)分明顯下降，是因?yàn)檫^(guò)多加入芽菜會(huì)產(chǎn)生苦澀味，且芽菜氣味過(guò)濃掩蓋了酸奶本身的氣味。因此，選擇青花菜芽菜的添加量為1%～3%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖2 不同青花菜芽菜添加量對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響Fig.2 Effects of different broccolisprout additionson sensory scores of yogurt

2.2.2 白砂糖添加量對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響

由圖3可以看出，白砂糖添加量在5%～7%時(shí)，感官評(píng)分逐漸上升，可能是因?yàn)楹橇康纳仙?，甜味更加突出，掩蓋了芽菜本身帶有的苦澀味。而白砂糖添加量大于7%時(shí)，產(chǎn)品感官評(píng)分顯著降低（P＜0.05），可能是由于含糖量過(guò)高，使人產(chǎn)生甜膩感。閆志鵬[25]研制的姜汁酸奶最佳配方中白砂糖的添加量同樣也為7%，而袁云霞等[26]研制的西瓜椰果粒酸奶中雖然白砂糖的最適添加量為6%，但是果粒本身具有一定的甜味，所以適當(dāng)降低白砂糖添加量可賦予產(chǎn)品更好的口感。因此，選擇白砂糖添加量為6%～8%進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖3 不同白砂糖添加量對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響Fig.3 Effectsof different granulated sugar additionson sensory scores of yogurt

2.2.3 菌種接種量對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響

由圖4可以看出，菌種接種量在0.1%～0.3%時(shí)，感官得分呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，當(dāng)菌種接種量大于0.3%時(shí)，產(chǎn)品感官評(píng)分變化不明顯，表明此時(shí)菌種已經(jīng)達(dá)到飽和，對(duì)酸奶的評(píng)分影響不明顯。董悅陽(yáng)等[27]在麻山藥酸奶中的接種量同樣為0.3%，束俊霞等[28]在研究紫薯酸奶時(shí)對(duì)發(fā)酵劑的添加量有不同的結(jié)論，這可能是由于菌種種類(lèi)不同導(dǎo)致。因此，本研究選擇菌種添加量范圍為0.2%～0.4%來(lái)進(jìn)行后續(xù)響應(yīng)面試驗(yàn)。

圖4 不同菌種接種量對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響Fig.4 Effectsof different lactobacillus additionson sensory scoresof yogurt

2.2.4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響

由圖5可以看出，發(fā)酵時(shí)間在4～6 h時(shí)，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，酸奶中的菌群擁有更為充足的時(shí)間分解蛋白質(zhì)，營(yíng)造更為良好的感官品質(zhì)。而當(dāng)發(fā)酵時(shí)間大于6 h時(shí)，感官評(píng)分明顯下降，可能是由于菌群大量繁殖，代謝產(chǎn)物大量積聚，使酸奶過(guò)酸、產(chǎn)生異味等現(xiàn)象。尹雄等[29]所研制的云南小?？Х裙し郯l(fā)酵酸奶和屈小媛等[30]研制的黑樹(shù)莓酸奶在單因素試驗(yàn)中采用的最佳發(fā)酵時(shí)間均為6 h，這與本研究試驗(yàn)結(jié)果一致。因此，酸奶的發(fā)酵時(shí)間在5～7 h為宜。

圖5 不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)酸奶感官評(píng)分的影響Fig.5 Effects of different fermentation time on sensory scores of yogurt

2.3 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，依據(jù)Box-Behnken原理，分別以白砂糖添加量（A）、菌種接種量（B）、發(fā)酵時(shí)間（C）、青花菜芽菜添加量（D）這4個(gè)因素作為考察因素，研究各因素間交互作用對(duì)富含GABA的青花菜芽菜酸奶品質(zhì)的影響，響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Design and resultsof response surfaceexperiment

通過(guò)軟件Design-Expert 11.0對(duì)青花菜芽菜酸奶試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元響應(yīng)面分析，經(jīng)擬合得到多元回歸模型，表4為回歸模型的方差分析結(jié)果。將響應(yīng)值與各個(gè)因素進(jìn)行回歸擬合，得到回歸方程：

根據(jù)表4的回歸模型方差分析可知，該模型P值＜0.000 1，說(shuō)明回歸模型極顯著，證明該模型較理想，且失擬項(xiàng)P值（0.596 7）＞0.05，不顯著，表明該回歸方程擬合度較高，誤差對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小。

表4 回歸模型的方差分析Table4 Variance analysisof regression model

從回歸方程系數(shù)顯著性檢驗(yàn)可知，一次項(xiàng)A、C和D對(duì)青花菜芽菜酸奶的感官評(píng)分影響極顯著（P＜0.01），交互項(xiàng)AB、AD和二次項(xiàng)A2、B2、C2、D2對(duì)青花菜芽菜酸奶的感官評(píng)分影響均達(dá)到極顯著（P＜0.01）水平，BC對(duì)青花菜芽菜酸奶的感官評(píng)分影響顯著（P＜0.05）。由各因素F值的大小可知，對(duì)酸奶感官評(píng)分影響程度大小依次為：白砂糖添加量＞青花菜芽菜添加量＞發(fā)酵時(shí)間＞菌種接種量。通過(guò)對(duì)方程的手動(dòng)優(yōu)化，去除不顯著的B、AC、BD和CD項(xiàng)后，得到優(yōu)化后的方程為：Y=97.66+1.48A+1.38C+1.39D+2.63AB+4.19AD-2.02BC-7.91A2-2.28B2-3.83C2-8.84D2，優(yōu)化后的方程能夠很好地?cái)M合真實(shí)值。

續(xù)表4 回歸模型的方差分析Continue table4 Variance analysisof regression model

根據(jù)Design-Expert 11軟件得到的響應(yīng)曲面圖和等高線圖可以直觀地表示響應(yīng)值與因素水平之間的關(guān)系[31]。由圖6可知，6個(gè)響應(yīng)面圖都是開(kāi)口向下的，說(shuō)明酸奶感官評(píng)分在試驗(yàn)設(shè)計(jì)的范圍內(nèi)存在最大值。通過(guò)軟件可以預(yù)測(cè)出青花菜芽菜酸奶的理論最佳制作工藝條件為：白砂糖添加量7.1%，菌種接種量0.29%，發(fā)酵時(shí)間6.19 h，青花菜芽菜添加量2.1%，此時(shí)酸奶的感官評(píng)分最高，為97.95分。

圖6 各因素交互作用對(duì)酸奶感官評(píng)分影響的響應(yīng)面圖和等高線圖Fig.6 Responsesurfacediagramsand contour mapsshowinginteraction effectsof variousfactorson sensory scoresof yogurt

2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

為了方便進(jìn)行試驗(yàn)操作，將響應(yīng)面預(yù)測(cè)的最優(yōu)工藝進(jìn)行一定的修正，即：白砂糖添加量7.1%，菌種接種量0.3%，發(fā)酵時(shí)間6.2 h，青花菜芽菜添加量2.1%。在該工藝條件下，分別進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得酸奶感官評(píng)分平均值為98.5分，與響應(yīng)面預(yù)測(cè)結(jié)果無(wú)顯著性差異，說(shuō)明本試驗(yàn)中得到的青花菜芽菜酸奶的制作工藝可靠。

2.5 酸奶產(chǎn)品中GABA含量檢測(cè)結(jié)果

在上述最佳工藝條件下測(cè)得的酸奶GABA含量達(dá)0.789 g·L-1，而未添加青花菜芽菜的酸奶中GABA含量為0.245 g·L-1，說(shuō)明通過(guò)添加青花菜芽菜發(fā)酵酸奶能使GABA含量有明顯提高。

2.6 酸奶產(chǎn)品理化及微生物指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

經(jīng)檢測(cè)，酸奶產(chǎn)品酸度值為41°T，蛋白質(zhì)含量為30.25 g·L-1，乳酸菌數(shù)量為1.5×108CFU·mL-1，未檢出金黃色葡萄球菌，符合國(guó)家乳制品要求。

3 結(jié)論

在酸奶中加入葡萄糖處理后的青花菜芽菜共同發(fā)酵，制成富含GABA的酸奶，既符合當(dāng)代人的健康需求，也起到了良好的保健功效，同時(shí)，酸奶中添加適量的青花菜芽菜，不僅可賦予酸奶清新的口感，還可讓人在視覺(jué)上有更舒服的感受，具有很高的商業(yè)價(jià)值。經(jīng)過(guò)單因素試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化得到酸奶制作最佳工藝參數(shù)為：白砂糖添加量7.1%，青花菜芽菜添加量2.1%（采用120 mmol·L-1葡萄糖溶液培養(yǎng)青花菜芽菜），菌種接種量0.3%，發(fā)酵時(shí)間6.2 h。在此工藝條件下，酸奶中的GABA有明顯的富集，達(dá)到0.789 g·L-1，且理化指標(biāo)和微生物指標(biāo)均符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。