羅凱 段華彬 羅明鼎 宋世杰 舒宇輝

脊髓損傷是造成癱瘓和感覺障礙的主要原因，不僅給患者帶來嚴(yán)重的身體及心理創(chuàng)傷，還給患者家庭造成極大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。研究顯示，神經(jīng)細(xì)胞過度的氧化應(yīng)激和炎性反應(yīng)、神經(jīng)遞質(zhì)蓄積、神經(jīng)軸突損失、神經(jīng)細(xì)胞凋亡等均可引起脊髓損傷[1]。因此，尋找能夠改善神經(jīng)損傷的的藥物對預(yù)防和治療脊髓損傷十分必要。瑞舒伐他汀(rosuvastatin)是臨床常用的調(diào)節(jié)血脂的藥物，具有較好的降脂效果。研究顯示，瑞舒伐他汀可能通過抑制Sphk1-S1P信號傳導(dǎo)通路介導(dǎo)的的炎性因子表達(dá)來減輕ox-LDL誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷，延緩動脈粥樣硬化進(jìn)程[2]；瑞舒伐他汀可抑制氧糖剝奪/復(fù)氧誘導(dǎo)的腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，減輕細(xì)胞損傷，具有維持血腦屏障的潛在價值[3]。但目前，瑞舒伐他汀對神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響尚筆者未見報道。miR-122-5p是一種微小RNA(miRNA)，參與調(diào)控細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等生理或病理過程，在多種疾病發(fā)生發(fā)展中起重要作用[4,5]。有報道，miR-122-5p在乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠肝損傷中表達(dá)升高，靶向下調(diào)其表達(dá)可減輕小鼠肝損傷[6]。miR-122-5p對神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響也還未知。因此，本研究以大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤PC-12為研究對象，采用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞建立神經(jīng)細(xì)胞損傷模型，觀察瑞舒伐他汀對神經(jīng)細(xì)胞損傷的影響及其能否調(diào)控miR-122-5p發(fā)揮作用，以期為神經(jīng)損傷性疾病的治療提供新方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞與試劑 大鼠腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤株P(guān)C-12，上海通派生物科技有限公司；胎牛血清(FBS)，浙江天杭生物科技公司；DMEM培養(yǎng)基、Annexin V-FITC/PI細(xì)胞凋亡試劑盒和二喹啉甲酸(BCA)蛋白檢測試劑盒，北京索萊寶公司；LPS，美國Sigma公司；LipofectamineTM2000試劑盒和Trizol試劑，美國Invitrogen公司；miR-122-5p模擬物(mimics)、模擬對照序列(miR-NC)、miR-122-5p抑制劑(anti-miR-122-5p)、抑制劑陰性對照序列(anti-miR-NC)和PCR引物，上海生工生物工程有限公司；兔抗人活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspases-3)、白介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)抗體，美國Santa Cruz公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和PCR試劑盒，大連寶生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染:復(fù)蘇PC-12細(xì)胞，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞生長密度至80%時，0.25%胰蛋白酶消化，傳代培養(yǎng)。將對數(shù)生長期的PC-12細(xì)胞以5.0×105個/孔接種于6孔板中，采用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體法，分別轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-122-5p mimics。轉(zhuǎn)染6 h后，更換培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞備用。

1.2.2 細(xì)胞分組處理:未轉(zhuǎn)染的PC-12細(xì)胞分為對照組(NC組)、LPS組、0.01 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組、0.1 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組和1.0 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組，其中NC組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)，LPS組細(xì)胞用含1.0 mg/ml[7]LPS的培養(yǎng)基培養(yǎng)，0.01 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組、0.1 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組和1.0 μmol/L 瑞舒伐他汀+LPS組細(xì)胞分別用含0.01、0.1、1.0 μmol/L[8]的瑞舒伐他汀與1.0 mg/ml LPS共同培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-122-5p mimics的細(xì)胞均用含1.0 μmol/L的瑞舒伐他汀與1.0 mg/ml LPS共同培養(yǎng)，分別記為miR-NC+1.0 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組、miR-122-5p+1.0 μmol/L瑞舒伐他汀+LPS組。

1.2.3 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖:將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12細(xì)胞均以1.0×104個/孔接種于96孔板中，5組中每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，加10 μl CCK-8試劑。再孵育1.5 h后，酶標(biāo)儀450 nm檢測吸光度(A)值。實(shí)驗重復(fù)3次。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡:將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12細(xì)胞均以2.5×104個/孔接種于24孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，PBS清洗2次，并調(diào)整細(xì)胞濃度為2.5×104個/ml。取1.0 ml細(xì)胞懸液，1 000 r/min離心5 min，棄上清。加500 μl結(jié)合緩沖液，重懸細(xì)胞。加10 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，室溫避光孵育15 min 后，上流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 Western blot法檢測Cleaved-caspase-3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白表達(dá):將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12細(xì)胞均以2.5×104個/孔接種于24孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，PBS清洗2次。RIPA試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA法檢測蛋白含量，以每孔20 μg蛋白行SDS-PAGE電泳。電泳后，將分離蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，并于5 %脫脂奶粉中封閉1 h。然后分別于Cleaved-caspase-3(1∶1 000)、IL-1β(1∶500)、IL-6(1∶500)、TNF-α(1∶500)和β-actin(1∶1 000)一抗孵育液中4℃過夜。再于山羊抗兔二抗(1∶2 000)孵育液中37℃孵育1 h。加顯影液避光顯影，曝光拍照，Image J軟件分析蛋白條帶灰度值。

1.2.6 RT-qPCR檢測miR-122-5p表達(dá):將未轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)染miR-NC、miR-122-5p mimics的PC-12細(xì)胞均以2.5×104個/孔接種于24孔板中，每組設(shè)3個復(fù)孔。培養(yǎng)24 h后，收集細(xì)胞，PBS清洗2次。Trizol試劑提取細(xì)胞中總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，行PCR擴(kuò)增。引物序列：miR-122-5p上游5’-GGAGAGAGCCCGGCGAGC-3’，下游5’-ACGAACTCTCGCGCCGG-3’；內(nèi)參U6上游5’-CCCGAAGATAGCGCGGAG-3’，下游5’-CGATAGAGCGAGAGGG-3’。2-△△Ct法計算miR-122-5p相對于內(nèi)參U6的表達(dá)水平。

2 結(jié)果

2.1 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞活力的影響 與NC組比較，LPS組PC-12細(xì)胞A值降低(P<0.05)。與LPS組比較，不同濃度(0.01、0.1、1.0 μmol/L)瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細(xì)胞A值升高(P<0.05)。見表1。

表1 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞活力的影響

2.2 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞凋亡的影響 與NC組比較，LPS組PC-12細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與LPS組比較，不同濃度(0.01、0.1、1.0 μmol/L)瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細(xì)胞凋亡率降低(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表2，圖1。

表2 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞凋亡的影響

圖1 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞凋亡的影響；A Western blot檢測Cleaved-caspase-3蛋白的相對表達(dá)；B 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡

2.3 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響 與NC組比較，LPS組PC-12細(xì)胞中IL-1β蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。與LPS組比較，不同濃度瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細(xì)胞中IL-1β蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表3，圖2。

圖2 Western blot檢測IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的相對表達(dá)

表3 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞炎性因子表達(dá)的影響

2.4 瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞中miR-122-5p表達(dá)的影響 與NC組比較，LPS組PC-12細(xì)胞中miR-122-5p表達(dá)水平升高(P<0.05)。與LPS組比較，不同濃度(0.01、0.1、1.0 μmol/L)瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細(xì)胞中miR-122-5p表達(dá)水平降低(P<0.05)。見表4。

表4 瑞舒伐他汀對miR-122-5p表達(dá)的影響

2.5 上調(diào)miR-122-5p逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞活性、凋亡及炎性因子表達(dá)的影響 與miR-NC+1.0 μmol/L 瑞舒伐他汀+LPS組比較，miR-122-5p+1.0 μmol/L 瑞舒伐他汀+LPS組PC-12細(xì)胞中miR-122-5p水平升高(P<0.05)，細(xì)胞A值降低(P<0.05)，凋亡率升高(P<0.05)，Cleaved-caspase-3蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)，IL-1β蛋白、IL-6蛋白、TNF-α蛋白表達(dá)水平升高(P<0.05)。見表5，圖3。

表5 上調(diào)miR-122-5p逆轉(zhuǎn)瑞舒伐他汀對LPS處理的PC-12細(xì)胞活性、凋亡和炎性因子表達(dá)的影響

圖3 Western blot檢測Cleaved-caspase-3、IL-1β、IL-6、TNF-α蛋白的表達(dá)

3 討論

脊髓損傷包括初次打擊和二次損傷，其中二次損傷主要為神經(jīng)細(xì)胞損傷，預(yù)防和減輕神經(jīng)損傷對改善脊髓損傷患者預(yù)后具有重要意義[9]。PC-12細(xì)胞是從大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤克隆而來的細(xì)胞系，在細(xì)胞生長因子的誘導(dǎo)下可分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，且具有良好的神經(jīng)細(xì)胞特性，常被用作探究神經(jīng)系統(tǒng)疾病的模型細(xì)胞[10]。LPS是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分，能夠誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生過度的炎性反應(yīng)，嚴(yán)重時可引起細(xì)胞凋亡，是細(xì)胞損傷的常用誘導(dǎo)劑[11]。本研究顯示，PC-12細(xì)胞經(jīng)LPS誘導(dǎo)后，其活性降低，而凋亡率及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α的蛋白表達(dá)水平明顯升高，與相關(guān)報道結(jié)果[7]一致，說明LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷模型建立成功。

瑞舒伐他汀是一種他汀類藥物，主要用于治療高膽固醇血癥，也可用來預(yù)防心血管疾病。研究顯示，瑞舒伐他汀可能通過抑制TLR4/NFκBp65信號通路減少LPS誘導(dǎo)人外周血晚期內(nèi)皮祖細(xì)胞ROS的生成和氧化損傷[12]。瑞舒伐他汀抑制柯薩奇B3病毒誘導(dǎo)的小鼠心肌細(xì)胞凋亡和炎性反應(yīng)，改善心臟功能，對小鼠病毒性心肌炎具有保護(hù)作用[13]。本研究顯示，一定劑量(0.01、0.1、1.0 μmol/L)的瑞舒伐他汀可有效提高LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞活性，并減少其凋亡。細(xì)胞凋亡是一種神經(jīng)細(xì)胞損傷的表現(xiàn)形式，其受多種基因分子的調(diào)控。Caspases級聯(lián)反應(yīng)參與細(xì)胞凋亡，caspases-3是該級聯(lián)效應(yīng)的關(guān)鍵調(diào)控分子，其在受到上游凋亡刺激信號后活化形成Cleaved-caspases-3，進(jìn)而介導(dǎo)蛋白剪切，引起染色質(zhì)固縮，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。本研究顯示，瑞舒伐他汀可降低LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞中Cleaved-caspases-3蛋白的表達(dá)，亦表明其抑制了LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷，減輕了細(xì)胞損傷。

脊髓損傷過程中伴有大量促炎因子的生成和釋放，這些炎性因子可加重脊髓損傷。IL-1β可介導(dǎo)中性粒細(xì)胞浸潤，加重?fù)p傷區(qū)域的炎性反應(yīng)[15]。IL-6是機(jī)體應(yīng)對感染和組織損傷產(chǎn)生的重要介質(zhì)，參與炎性反應(yīng)[16]。TNF-α是巨噬細(xì)胞分泌的具有多種生物學(xué)效應(yīng)的細(xì)胞因子，可激活炎癥細(xì)胞參與炎性反應(yīng)，介導(dǎo)免疫應(yīng)答[17]。研究表明，脊髓損傷后，IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)明顯增加[18]。本研究顯示，瑞舒伐他汀降低了LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞中IL-1β、IL-6和TNF-α的蛋白表達(dá)，說明瑞舒伐他汀可減弱LPS誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞炎性反應(yīng)，減輕神經(jīng)細(xì)胞炎性損傷。

miRNA在真核生物中廣泛存在，參與調(diào)節(jié)神經(jīng)細(xì)胞凋亡、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激等生命活動，與神經(jīng)損傷性疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miR-122-5p作為一種miRNA，參與多種疾病的發(fā)展進(jìn)程。研究顯示，慢性乙型肝炎肝損傷患者血清中miR-122-5p表達(dá)升高，其診斷慢性乙型肝炎肝損傷的敏感度為83.3%，特異性為73.3%，可作為診斷慢性乙型肝炎患者肝損傷生物標(biāo)志物[19]；miR-122-5p拮抗劑可抑制脂多糖誘導(dǎo)小鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激，miR-122-5p通可能是急性肺損傷的潛在治療靶點(diǎn)[20]。本研究顯示，LPS誘導(dǎo)PC-12細(xì)胞后細(xì)胞中miR-122-5p表達(dá)水平升高，提示miR-122-5p可能參與LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷；而瑞舒伐他汀抑制了LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞中miR-122-5p的表達(dá)，且上調(diào)miR-122-5p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了瑞舒伐他汀對LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞凋亡及炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α蛋白表達(dá)的抑制作用，提示瑞舒伐他汀可能通過下調(diào)miR-122-5p表達(dá)來抑制LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞損傷。

綜上所述，瑞舒伐他汀可提高LPS誘導(dǎo)的PC-12細(xì)胞增殖活性，抑制細(xì)胞凋亡及炎性因子的表達(dá)，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中miR-122-5p的表達(dá)有關(guān)，具有減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷、治療脊髓損傷的潛在作用。