李盛前， 侯 穎， 范鑫諾， 陳陽陽， 宮 強， 李 陽， 徐建強

(1.河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽 471023；2.河南省食品微生物工程技術(shù)研究中心，河南 洛陽 471023；3.微生物資源開發(fā)與利用河南科技大學(xué)重點實驗室，河南 洛陽 471023；4.河南科技大學(xué) 園藝與植物保護學(xué)院，河南 洛陽 471023)

β-甘露聚糖酶(β-mannanase)屬于半纖維素酶類，是一類可以隨機水解含有β-1,4-D-甘露糖主鏈的葡甘露聚糖、甘露聚糖、半乳甘露聚糖等多糖， 并釋放這些糖類中的甘露糖或功能性低聚糖的酶[1]。β-甘露聚糖酶在食品加工和動物飼料中應(yīng)用廣泛。在食品中添加β-甘露聚糖酶能調(diào)節(jié)腸道菌群環(huán)境，增強有益菌抑制有害菌的生長和代謝，促進雙歧桿菌的生長[2]。將β-甘露聚糖酶加入到果汁中可降低其黏度，改善其澄清度[3]；在速溶咖啡生產(chǎn)過程中加入β-甘露聚糖酶，可提高速溶咖啡可溶性固體的產(chǎn)量[4]。β-甘露聚糖酶可分解植物細胞壁，釋放細胞壁內(nèi)的營養(yǎng)物質(zhì)，降低動物腸道內(nèi)食靡的黏度，促進十二指腸吸收表面積和空腸絨毛高度的增加，提高腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收率和飼料利用率[5-6]。此外，β-甘露聚糖酶還有助于提高仔豬機體的抗氧化能力[7]和肉雞的生長性能與免疫力[8-9]。β-甘露聚糖酶廣泛存在于植物、動物、微生物中，而微生物來源的β-甘露聚糖酶種類豐富，是β-甘露聚糖酶的最主要來源，從微生物中提取β-甘露聚糖酶具有易獲得、高活性、低成本的特點，因此，國內(nèi)外學(xué)者對微生物來源的β-甘露聚糖酶研究最為廣泛[10]。其中，研究較多的是芽胞桿菌和曲霉等微生物來源的β-甘露聚糖酶。在不同種類的芽胞桿菌中，枯草芽胞桿菌(Bacillussubtilis)能夠生產(chǎn)出高活性β-甘露聚糖酶[11]。國內(nèi)外學(xué)者對微生物生產(chǎn)β-甘露聚糖酶發(fā)酵條件的優(yōu)化也進行了較多研究，Norizan 等[12]利用枯草芽胞桿菌ATCC11774為生產(chǎn)菌株，半固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶，通過對產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基成分進行優(yōu)化，優(yōu)化后的棕櫚仁餅(Palm kernel cake)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶量比營養(yǎng)肉湯高4倍。Ozturk 等[13]利用響應(yīng)面法的Box-Behnken設(shè)計對重組大豆曲霉ATCC11906 (AsT1)搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最大條件進行了優(yōu)化，優(yōu)化后培養(yǎng)基產(chǎn)酶量是在葡萄糖培養(yǎng)基上發(fā)酵產(chǎn)酶的1.4倍。微生物資源開發(fā)與利用校級重點實驗室微生物基因工程課題組在前期研究中分離篩選到一株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的枯草芽胞桿菌BacillussubtilisJ，所產(chǎn)甘露聚糖酶最適反應(yīng)溫度為60 ℃，在70 ℃仍有一定的酶活力和穩(wěn)定性，為進一步提高該酶在工業(yè)生產(chǎn)中的潛力，本研究通過單因素和響應(yīng)面試驗對產(chǎn)酶發(fā)酵培養(yǎng)基成分和發(fā)酵條件進行探索，以提高產(chǎn)酶量為目的，同時為高溫β-甘露聚糖酶的酶學(xué)性質(zhì)和應(yīng)用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種來源 菌株BacillussubtilisJ由河南科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院基因工程實驗室分離并保存。

1.1.2 主要試劑與儀器設(shè)備 魔芋粉(河南悅欣生物科技有限公司)；刺槐豆膠(鄭州卓研生物科技有限公司)；瓜兒豆膠(河南萬邦實業(yè)有限公司)；3,5-二硝基水楊酸(上海強順化學(xué)試劑有限公司)；四水酒石酸鉀鈉、苯酚和無水亞硫酸鈉(天津市德恩化學(xué)試劑有限公司)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純或國產(chǎn)生化試劑?？梢姽夥止夤舛扔?722N，上海悅豐儀器儀表有限公司)；高速冷凍離心機(H1850R，湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(DH-500，北京中興偉業(yè)儀器有限公司)；雙人單面凈化工作臺(SW-CJ-2D，蘇州凈化設(shè)備有限公司)。

1.1.3 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基；②基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：魔芋粉10，胰蛋白胨5，K2HPO46，MgSO4·7H2O 1，pH自然，115 ℃高壓滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 菌株活化 于-80 ℃冰箱中取出冷凍保藏的菌株BacillussubtilisJ，劃線于LB固體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，然后轉(zhuǎn)接LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，180 r/min培養(yǎng)12 h。

1.2.2 菌株發(fā)酵與粗酶液制備 以2%(體積分數(shù)，下同)接種量，將培養(yǎng)12 h的菌液，接入裝有基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的錐形瓶(50 mL/250 mL)中，37 ℃、180 r/min發(fā)酵24 h后，4 ℃，8 000 r/min冷凍離心10 min去除菌體和雜質(zhì)，上清液即為粗酶液，用其測定β-甘露聚糖酶活力。

1.2.3 酶活力測定 采用DNS法[14]測酶活力，酶活力定義為以5 g/L槐豆膠為底物，60 ℃水浴反應(yīng)10 min，每1 min產(chǎn)生相當于1 μmol D-甘露糖的還原糖所需要的酶量為1個酶活力單位U。

式中：a為由標準曲線查得甘露糖微克數(shù)(μg)；b為稀釋倍數(shù)；180為甘露糖分子量；0.1為酶液毫升數(shù)(mL)；t為反應(yīng)時間(min)。

1.2.4 單因素試驗 按1.2.2發(fā)酵條件，研究基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基碳源10 g/L(魔芋粉、刺槐豆膠、蔗糖、D-甘露糖、可溶性淀粉、麥芽糖、葡萄糖、D-木糖和瓜爾豆膠)，碳源質(zhì)量濃度(10、15、20、25、30、35、40、45、50 g/L)、氮源5 g/L(蛋白胨、酵母粉、牛肉膏、尿素、硫酸銨、硝酸鉀、酪蛋白、胰蛋白胨和大豆蛋白胨)、氮源質(zhì)量濃度(5、10、15、20、25、30、35、40、45 g/L)、溫度(25、30、35、40、45 ℃)、初始pH(4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)、接種量(0.5%、1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%)、裝液量(25、50、75、100、125、150 mL)對菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響。每個水平3個重復(fù)，根據(jù)酶活力高低確定最佳發(fā)酵條件。

1.2.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計 根據(jù)單因素試驗結(jié)果，采用中心組合試驗Box-Behnken設(shè)計方案，選擇對β-甘露聚糖酶活力影響較大的4個因素(碳源、氮源、初始pH值和溫度)。使用Design Expert 8.0.6軟件進行響應(yīng)面設(shè)計。每個因素設(shè)3個水平(-1、0、1)，每個實驗組設(shè)置3個平行，以β-甘露聚糖酶活力作為響應(yīng)值，對發(fā)酵條件進行設(shè)計優(yōu)化。響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Factors and horizontal design of response surface test

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源種類及濃度對菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

選取9種不同物質(zhì)作為碳源，菌株BacillussubtilisJ在以初始碳源質(zhì)量濃度為10 g/L，發(fā)酵培養(yǎng)24 h后，β-甘露聚糖酶的酶活力如圖1A所示，不同碳源對枯草芽胞桿菌產(chǎn)酶影響較大，魔芋粉、刺槐豆膠和瓜爾豆膠為碳源時，β-甘露聚糖酶的酶活力較高，其中菌株利用魔芋粉產(chǎn)酶能力最好，達到了25.12 U/mL，而葡萄糖、蔗糖、木糖、甘露糖、麥芽糖和可溶性淀粉為碳源時，枯草芽胞桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶活力較弱，酶活力僅為5.8～7.3 U/mL，因此確定魔芋粉為最佳碳源。由圖1B可知，魔芋粉的質(zhì)量濃度在10～30 g/L范圍內(nèi)，產(chǎn)酶量隨著質(zhì)量濃度的增加而逐步升高。在碳源質(zhì)量濃度為30 g/L時，產(chǎn)酶量達到最大值，之后，隨著碳源質(zhì)量濃度的增加，菌株產(chǎn)酶活力開始緩慢下降。因此，確定碳源最佳質(zhì)量濃度為30 g/L。

圖1 碳源種類(A)及濃度(B)對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.1 Effects of carbon source types(A) and concentrations(B) on enzyme production by strain圖中不同的小寫字母分別表示在不同的碳源種類和濃度之間的顯著差異性(P<0.05)Different lowercase leters in figure A and figure B indicate significant differences (P<0.05)

2.2 氮源種類及濃度對菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

由圖2A可知，在有機氮源中胰蛋白的產(chǎn)酶效果最好，達到了46.01 U/mL，其次是蛋白胨；在無機氮源中，硝酸鉀和硫酸銨也有較好的產(chǎn)酶效果。因此，確定最佳的氮源為胰蛋白胨。由圖2B可知，以胰蛋白胨為最佳氮源時，在5～20 g/L的范圍內(nèi)，隨著胰蛋白胨濃度的升高，菌株的產(chǎn)酶能力也逐漸上升，在20 g/L時菌株的產(chǎn)酶效果最好，之后菌株產(chǎn)酶能力隨著胰蛋白胨濃度的升高而逐步降低。因此，確定最佳的氮源濃度為20 g/L。

圖2 氮源種類(A)及濃度(B)對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.2 Effects of nitrogen source types (A) and concentrations (B) on enzyme production by strain圖中不同的小寫字母分別表示在不同氮源種類和濃度之間的顯著差異性(P<0.05)Differene lowercase letters in figure 2A and figure 2B indicate significant diferences (P<0.05)

2.3 發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的影響

如圖3A所示，當發(fā)酵溫度達到30 ℃時，酶活力達到最大值45.72 U/mL，但當溫度進一步升高時，酶活力急劇下降。因此，確定最適發(fā)酵溫度為30 ℃。由圖3B可知，初始pH值在7～8之間有利于菌體產(chǎn)酶，且在4～8之間隨著pH的升高，產(chǎn)酶量逐步增加，最高酶活力可達到57.62 U/mL，而當pH值大于8，產(chǎn)酶量隨著pH的升高而降低。由圖3C可知，當裝液量為50 mL/250 mL時，酶活力達到最大值65.98 U/mL，當裝液量太少(小于50 mL)時，發(fā)酵液會在錐形瓶的內(nèi)壁上形成一層薄膜，影響菌體的生長繁殖，從而導(dǎo)致產(chǎn)酶量有所下降，因此，最佳裝液量為50 mL/250 mL。由圖3D可知，當接種量達到1%(體積分數(shù))時，酶活力達到最大值78.60 U/mL。隨著接種量的增加，產(chǎn)酶量開始緩慢下降，當接種量達到7%后，產(chǎn)酶量開始大幅度下降。這是因為隨著接種量的增加，大量的菌體會消耗有限的營養(yǎng)物質(zhì)，營養(yǎng)物質(zhì)消耗過快，有毒物質(zhì)大量積累，致使菌體產(chǎn)酶能力下降。因此，確定最佳接種量為1%。

圖3 發(fā)酵條件對菌株產(chǎn)酶的影響Fig.3 Effect of fermentation conditions on enzyme production by strains

2.4 響應(yīng)面結(jié)果與分析

通過使用Design Expert 8.0.6軟件對表2數(shù)據(jù)進行多元回歸擬合分析，得到以β-甘露聚糖酶酶活力為響應(yīng)值的回歸方程：

表2 響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface test

R=83.05-5.10A+1.20B-0.49C+5.96D-1.57AB-5.83AC+2.24AD+6.03BC+3.11BD+5.37CD-8.15A2-4.37B2-5.72C2-13.93D2

其中，R表示β-甘露聚糖酶活力的預(yù)測值(U/mL)，A、B、C和D分別代表魔芋粉(g/L)、胰蛋白胨(g/L)、溫度(℃)和pH。

響應(yīng)面可直接反應(yīng)各因素間的交互作用，所形成響應(yīng)面的坡度越陡，其影響越顯著，坡度越平緩，影響越小[15]。如果密集形成的等高線是橢圓形或鞍形，則表明2個因素的交互作用的影響越大；密集形成的等高線是圓形，則表明兩個因素交互作用的影響越小[16]。對試驗結(jié)果進行擬合二次模型方差分析如表3，模型的P值(Prob>F)為0.000 1<0.05，說明模型高度顯著。此模型的相關(guān)系數(shù)為92.55%，即預(yù)測僅有7.45%的數(shù)據(jù)不能用該模型解釋。該模型的失擬項值(0.069 5)大于0.05，故說明此模型沒有失擬現(xiàn)象?；貧w方程系數(shù)顯著性檢驗結(jié)果：一次項A、D對酶活力影響極顯著；二次項A2、C2、D2對酶活力的影響極顯著，而B2對酶活力的影響顯著；交互項AC和CD的交互作用均顯著，BC交互作用極顯著，說明魔芋粉和溫度、溫度和pH的交互作用對枯草芽胞桿菌產(chǎn)酶有顯著影響，而胰蛋白胨和溫度對枯草芽胞桿菌產(chǎn)酶有極顯著影響，AB、AD和BD交互作用不顯著。由F值得出，各因素試驗對枯草芽胞桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶活力影響的主次順序為D>A>B>C，即pH>魔芋粉>胰蛋白胨>溫度。

表3 響應(yīng)面試驗結(jié)果方差分析Table 3 ANOVA of response surface experimental results

使用Design Expert 8.0.6軟件對回歸方程中的交互項AB、AC、AD、BC、BD和CD繪制響應(yīng)面和等高線圖如圖4所示，各因素之間有不同程度的交互作用，各因素交互作用形成的響應(yīng)面圖均為曲面，且開口方向朝下，這表明隨著各個因素的增長，對枯草芽胞桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶影響變大，當其增大到最大值后，隨著各因素繼續(xù)增大，對枯草芽胞桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶影響將逐漸減小。

圖4 各因素交互作用的影響Fig.4 Influence of interaction of various factors

2.5 驗證試驗結(jié)果

經(jīng)Design Expert 8.0.6軟件分析得到的枯草芽胞桿菌產(chǎn)β-甘露聚糖酶最佳發(fā)酵條件為魔芋粉28.23 g/L，胰蛋白胨21.14 g/L，溫度31.55 ℃，pH值 8.50，在此條件下菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶酶活力預(yù)測值為84.65 U/mL。為了驗證預(yù)測值的準確性和實際試驗操作便利性，將發(fā)酵條件調(diào)整為魔芋粉28 g/L，胰蛋白胨21 g/L，溫度31 ℃，pH值 8.5，在此條件下進行3次驗證試驗測得β-甘露聚糖酶酶活力平均值為(84.38±0.30) U/mL，與理論值的相對誤差較小，說明模型可靠，可作為實際生產(chǎn)的依據(jù)。

3 討 論

本研究經(jīng)過單因素試驗和響應(yīng)面優(yōu)化后，確定菌株BacillussubtilisJ發(fā)酵生產(chǎn)β-甘露聚糖酶的最佳條件為魔芋粉28 g/L，胰蛋白胨21 g/L，K2HPO46 g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，溫度31 ℃，pH值 8.5，接種量1%(體積分數(shù))，裝液量50 mL/250 mL，發(fā)酵周期24 h，該條件下β-甘露聚糖酶活力達到84.38 U/mL，是基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基產(chǎn)酶活力(25.12 U/mL)的3.36倍。

培養(yǎng)基碳氮源種類及濃度優(yōu)化對菌株產(chǎn)酶的影響。通過單因素試驗對發(fā)酵培養(yǎng)基碳源種類進行優(yōu)化后發(fā)現(xiàn)，以魔芋粉、瓜爾豆膠、刺槐豆膠為碳源時，菌株產(chǎn)酶活力明顯高于其他碳源，分析認為這與β-甘露聚糖酶屬于誘導(dǎo)酶直接相關(guān)，在對路德維希腸桿菌(Enterobacterludwigii)[17]、類芽胞桿菌(PaenibacillusAsh)WY-01[18]等菌株發(fā)酵優(yōu)化的研究報道中，都有魔芋粉為最優(yōu)誘導(dǎo)產(chǎn)酶底物的結(jié)論，本研究結(jié)果與上述結(jié)論一致。

發(fā)酵條件優(yōu)化對菌株產(chǎn)酶的影響。龔勁松等[19]利用BacillussubtilisYH12為生產(chǎn)菌株，在初始pH為7.5、培養(yǎng)溫度30 ℃和裝液量為50 mL/250 mL的條件下，發(fā)酵33 h后產(chǎn)酶活力達到280 U/mL，相比初始水平提高約5倍。湯文晶等[20]用科氏芽胞桿菌(Bacilluscohnii)為生產(chǎn)菌株在最適培養(yǎng)溫度、pH和裝液量為55 ℃、9.5和75 mL/250 mL條件下，發(fā)酵生產(chǎn)36 h后，產(chǎn)酶活力達到0.345 U/mL，是優(yōu)化前產(chǎn)酶活力的4.3倍。本研究發(fā)現(xiàn)，在溫度為30 ℃、初始pH為8和裝液量為50 mL/250 mL時，菌株產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶活力可達到65.98 U/mL，較未優(yōu)化環(huán)境條件前(46.01 U/mL)提高了1.43倍。

從本研究結(jié)果來看，雖然優(yōu)化后菌株BacillussubtilisJ產(chǎn)β-甘露聚糖酶的酶活力比利用路德維希腸桿菌[17]高，但仍然比類芽胞桿菌WY-01[18]和BacillussubtilisYH12[19]的產(chǎn)酶活力低。做為一種不產(chǎn)生毒素，無致病性且具有較好產(chǎn)β-甘露聚糖酶能力的枯草芽胞桿菌，這為工業(yè)生產(chǎn)β-甘露聚糖酶提供了良好的菌株資源。為進一步提高β-甘露聚糖酶的產(chǎn)量，后期可以利用物理或化學(xué)方法對菌株BacillussubtilisJ進行誘變處理[21]，以及利用基因工程手段將其酶基因?qū)氲胶线m的菌中，實現(xiàn)β-甘露聚糖酶基因的高效表達。