李亞楠，朱錦明，欒曉梅，彭鳳云，李 青，杜長(zhǎng)江

(1.徐州醫(yī)科大學(xué)研究生院，徐州 221006；2.徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州婦幼保健院，徐州 221009)

胎膜早破(premature rupture of membranes,PROM)是指臨產(chǎn)前胎膜自然破裂，是產(chǎn)科常見的妊娠期并發(fā)癥，根據(jù)胎膜早破發(fā)生的時(shí)間是否達(dá)到妊娠37周可分為足月胎膜早破(time-premature rupture of membranes，TPROM)和未足月胎膜早破(preterm premature rupture of membranes，PPROM)[1]。陰道菌群上行感染、羊膜腔壓力變化等是導(dǎo)致PROM發(fā)生的常見原因，其中60%以上的PROM與感染有關(guān)。感染和胎膜早破之間互為因果關(guān)系，且感染是PROM的最重要原因，下生殖道感染容易造成胎膜早破，胎膜早破又導(dǎo)致陰道上行性感染的幾率增加。在一項(xiàng)研究中，對(duì)不明原因早產(chǎn)及合并單一妊娠期并發(fā)癥/合并癥的673例病例分析，發(fā)現(xiàn)PPROM最常見(45.6%，307/673)[2]。絨毛膜羊膜炎(chorioamnionitis，CA)是PROM的常見并發(fā)癥，可分為臨床絨毛膜羊膜炎與組織學(xué)絨毛膜羊膜炎(histological chorioamnionitis，HCA)兩類，其引發(fā)了40%～70%的早產(chǎn)，尤其是低胎齡的發(fā)病率更高[3]。HCA無明顯的臨床癥狀和體征，其定義為病理檢查絨毛膜及羊膜組織中每高倍鏡視野超過5個(gè)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)診斷為HCA[4]，故引起越來越多臨床醫(yī)生的關(guān)注。NLRP6是胞內(nèi)模式識(shí)別受體(pattern-recognition receptors，PRRs)的一種，其在多種細(xì)胞和組織中表達(dá)[5]，可被外源性或內(nèi)源性危險(xiǎn)信號(hào)激活，促動(dòng)下游炎癥細(xì)胞因子白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白細(xì)胞介素-18(interleukin-18，IL-18)并以半胱氨酸蛋白酶-1(cysteineprotease，caspase-1)依賴的方式產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，引起多種疾病的發(fā)生，如牙周炎、肺炎等。本研究將對(duì)PPROM患者合并HCA與正常對(duì)照組患者的血清及胎膜組織中NLRP6及caspase-1進(jìn)行檢測(cè)，進(jìn)一步探討導(dǎo)致胎膜早破合并HCA的原因。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2020年12月至2021年6月于徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州婦幼保健院行剖宮產(chǎn)分娩的PPROM患者60例，根據(jù)胎膜病理結(jié)果分為未合并HCA的PPROM組33例、未合并HCA的PPROM組27例；選取同期行剖宮產(chǎn)分娩的50例未合并HCA的足月孕婦為對(duì)照組。胎膜早破組和對(duì)照組孕婦的年齡、既往生產(chǎn)史比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。納入標(biāo)準(zhǔn)：臨床確診為胎膜早破且臨床資料完整；妊娠28～36+6周；單胎妊娠；分娩后常規(guī)行胎膜病理檢查；因合并疤痕子宮、羊水過少、胎位異常等行剖宮產(chǎn)術(shù)的孕婦。排除標(biāo)準(zhǔn)：排除全身感染的臨床征象；臨床絨毛膜羊膜炎；有心、肝、腎、內(nèi)分泌疾病及自身免疫性疾病；妊娠合并癥或并發(fā)癥；分娩前未使用抗生素及激素類藥物；排除羊水過多、巨大兒、多胎妊娠等可能導(dǎo)致胎膜早破的因素。對(duì)照組排除HCA。研究對(duì)象均征得患者書面同意并經(jīng)徐州醫(yī)科大學(xué)附屬徐州婦幼保健院倫理委員會(huì)同意(批準(zhǔn)號(hào)：徐州市婦幼保健院[2020]倫理第(15)號(hào))。

表1 孕婦一般情況比較

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) (1)胎膜早破診斷標(biāo)準(zhǔn)：孕婦主訴陰道流液或外陰濕潤(rùn)。窺陰器檢查見液體自宮頸口內(nèi)流出或后穹窿有液池形成，超聲檢查發(fā)現(xiàn)羊水量較破膜前減少，pH試紙檢測(cè)羊水偏堿性，陰道后穹窿積液涂片見到羊齒植物狀結(jié)晶。(2)HCA診斷標(biāo)準(zhǔn)：病理檢查絨毛膜及羊膜組織中每高倍鏡視野超過5個(gè)中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)且孕婦無臨床表現(xiàn)；(3)臨床絨毛膜羊膜炎診斷標(biāo)準(zhǔn)：①母體體溫≥38℃；②陰道分泌物異味；③胎心率增快或母體心率增快；④母體外周血白細(xì)胞計(jì)數(shù)≥15×109/L；⑤子宮呈激惹狀態(tài)、宮體有壓痛。母體體溫升高的同時(shí)伴有以上②～⑤項(xiàng)中的任何一項(xiàng)即可診斷臨床絨毛膜羊膜炎。

1.3 ELISA法檢測(cè)NLRP6、caspase-1表達(dá)水平 孕婦均于入院治療前抽取肘靜脈血4mL，靜置30min，3000r/min離心20min，留取血清，避免溶血的標(biāo)本，標(biāo)記后-80℃冰箱保存。雙抗體夾心法測(cè)定標(biāo)本中NLRP6和caspase-1表達(dá)水平，用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度(OD值)，由標(biāo)準(zhǔn)曲線得出各樣品對(duì)應(yīng)檢測(cè)結(jié)果(試劑盒：江蘇酶標(biāo)生物科技有限公司)。

1.4 免疫組化法檢測(cè)胎膜組織中NLRP6蛋白表達(dá)水平及定位 采用免疫組化SP二步法檢測(cè)胎膜組織中NLRP6蛋白，一抗為兔抗人單克隆NLRP6抗體(英國(guó)Abcam公司)，嚴(yán)格按試劑盒說明書步驟操作。利用image pro plus軟件對(duì)免疫組化結(jié)果進(jìn)行定量分析，將圖片各點(diǎn)的光密度值累計(jì)起來，得到累積光密度值(IOD)，IOD值除以有效目標(biāo)分布區(qū)域的面積，得到平均光密度值(Mean Density)值后進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

1.5 Western blot法檢測(cè)胎膜組織中NLRP6、caspase-1蛋白表達(dá) 無菌操作下取20mg胎膜組織，加200μL RIPA裂解液及2μL蛋白酶抑制劑(10∶100∶1)，-4℃條件下離心，取上清，BCA法進(jìn)行蛋白定量分析，電泳、切膠、電轉(zhuǎn)，快速封閉液室溫封閉0.5h，加NLRP6單抗(1∶1000)(Bioworld Techology.Inc)、caspase-1單抗(1∶1000)(Bioworld Techology.Inc)孵育過夜，洗膜，加相應(yīng)二抗(1∶1000)(Bioworld Techology.Inc)孵育，洗滌后曝光，以β-actin作為內(nèi)參，進(jìn)行灰度分析。

1.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)測(cè)定胎膜NLRP6、caspase-1 mRNA表達(dá)量 Trizol法處理組織樣品，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增。NLRP6引物序列，上游5'-CCGAGAAGGAACTGGAGCAACTG-3'，下游5'-CTGGAAGCTCTGGTCGATGAACTG-3'。caspase-1引物序列，上游5'-CTCAGGCTCAGAAGGGAATGA-3'，下游5'-CGCTGTACCCCAGATTTTGT-3'，目的基因擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)。GAPDH序列，上游5'-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3'，下游5'-GAAGCTGGGGCTCATTT-3'作為內(nèi)參對(duì)照，計(jì)算相對(duì)含量。2-△△CT法計(jì)算各組表達(dá)水平的倍數(shù)差異。

2 結(jié) 果

2.1 C反應(yīng)蛋白及白細(xì)胞計(jì)數(shù) PPROM組孕婦血清中CRP及白細(xì)胞計(jì)數(shù)表達(dá)高于對(duì)照組，但3組之間比較差異并無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

表2 三組孕婦外周血中CRP、白細(xì)胞計(jì)數(shù)表達(dá)

2.2 ELISA檢測(cè)結(jié)果 PPROM孕婦血清中NLRP6、caspase-1表達(dá)高于對(duì)照組(P<0.05)，其中合并HCA的PPROM組與未合并HCA的PPROM組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001)。見表3。

表3 孕婦外周血中NLRP6、Caspase-1表達(dá)量

2.3 PPROM孕婦血清中NLRP6、caspase-1水平相關(guān)性分析 PPROM孕婦血清中NLRP6、caspase-1水平呈正相關(guān)(r=0.8395，P<0.001)。見圖1。

圖1 血清中NLRP6和caspase-1水平相關(guān)性散點(diǎn)圖

2.4 免疫組化結(jié)果 NLRP6蛋白主要表達(dá)于胎膜上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞中，部分表達(dá)于細(xì)胞核(圖2)。3組孕婦胎膜中NLRP6蛋白相對(duì)表達(dá)量比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；PPROM組表達(dá)量均高于對(duì)照組，其中合并HCA的PPROM組和對(duì)照組、未合并HCA的PPROM組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

圖2 NLRP6在孕婦胎膜組織中的表達(dá)(DAB染色×200)

圖3 NLRP6在孕婦胎膜組織中的表達(dá)

2.5 孕婦胎膜組織中NLRP6、caspase-1蛋白及mRNA表達(dá)水平 胎膜組織NLRP6、caspase-1蛋白和mRNA在合并HCA的PPROM組中表達(dá)水平最高，且合并HCA的PPROM組與對(duì)照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

圖4 孕婦胎膜組織中NLRP6及caspase-1表達(dá)

3 討 論

PROM指臨產(chǎn)前胎膜自然破裂，其常見的并發(fā)癥為CA，兩者互為因果，可分為臨床絨毛膜羊膜炎與HCA兩類，CA可能導(dǎo)致嚴(yán)重的產(chǎn)婦并發(fā)癥，如敗血癥、傷口感染等[6]。隨著圍產(chǎn)期保健水平的提升，臨床絨毛膜羊膜炎的發(fā)病率明顯降低，而PPROM合并HCA并無明顯的臨床癥狀，早期診斷并不明確，目前發(fā)病率也有所增加。因此，早期識(shí)別PPROM合并HCA在臨床上十分重要。

天然免疫也稱固有免疫，其是機(jī)體免疫系統(tǒng)直接抵御病原體入侵的最初階段，可通過機(jī)體自身的特異性模式識(shí)別受體(PRRs)來識(shí)別病原體特有的保守結(jié)構(gòu)病原相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)[7]。NLRP6屬于胞漿內(nèi)NOD樣受體家族，其編碼基因位于人11號(hào)染色體(11P15.5)[8]，與NLRP3相似，其富含亮氨酸的重復(fù)序列，被認(rèn)為是天然免疫的重要效應(yīng)因子。作為胞內(nèi)的模式識(shí)別受體，有研究顯示NLRP6可從革蘭氏陽性病原體中識(shí)別病毒RNA和脂磷壁酸[9]，也可識(shí)別LPS，并在ATP刺激下自組裝成線性分子平臺(tái)[10]。多項(xiàng)研究顯示，造成胎膜早破的原因主要來自于下生殖道的上行性感染，如B族溶血性鏈球菌、支原體、弓形蟲等[11]。由此推測(cè)NLRP6在外源性因素的刺激下表達(dá)于胎膜上參與絨毛膜羊膜炎的發(fā)生。

NLRP6已被提出具有多種功能，包括控制微生物群、維持上皮完整性、調(diào)節(jié)代謝性疾病、調(diào)節(jié)微生物感染期間的宿主防御、癌癥保護(hù)和神經(jīng)炎癥調(diào)節(jié)等作用[12]。近年來，研究指出在炎癥疾病方面，NLRP6既有促炎作用也有抗炎作用。Xiao等[13]研究發(fā)現(xiàn)，炎癥是導(dǎo)致腦出血(intracerebral hemorrhage，ICH)后繼發(fā)性腦損傷的關(guān)鍵因素，在ICH大鼠模型中，NLRP6敲低可減少腦損傷、減輕炎癥，并且指出NLRP6介導(dǎo)ICH后的炎癥是炎性小體依賴性的。而在先天性巨結(jié)腸相關(guān)性小腸結(jié)腸炎(hirschsprung associated enterocolotis，HAEC)患者中NLRP6表達(dá)降低可能導(dǎo)致先天性巨結(jié)腸(hirschsprung，HSCR)患者的結(jié)腸微生物群發(fā)生改變，并增加了發(fā)生HAEC的易感性[14]。這些研究表明在機(jī)體不同的組織中NLRP6發(fā)揮的作用可能不同。

本研究結(jié)果顯示，PPROM孕婦血清中NLRP6水平與胎膜中NLRP6蛋白表達(dá)水平同步升高，可能是局部感染的因素刺激絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生NLRP6釋放入血，引起血清中NLRP6水平升高。Shen等[15]通過對(duì)NLRP6 pyrin結(jié)構(gòu)域(PYD)的低溫電子顯微鏡和晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，NLRP6 PYD能組裝成絲狀結(jié)構(gòu)，通過同型PYD-PYD的相互作用招募ASC，ASC通過CARD-CARD相互作用招募caspase-1，導(dǎo)致caspase-1的激活。Liu等[16]研究發(fā)現(xiàn)，在牙齦卟啉單胞菌刺激下，牙齦成纖維細(xì)胞中NLRP6過表達(dá)激活caspase-1，導(dǎo)致促炎介質(zhì)IL-1β和IL-18的釋放，引起牙周炎的發(fā)生。此外，與健康對(duì)照組相比，NLRP6在牙周炎牙齦組織中高表達(dá)。同樣，在一項(xiàng)NLRP6炎性小體在肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞過程中對(duì)促炎細(xì)胞因子產(chǎn)生的研究中[17]，采用ELISA法檢測(cè)上清液中炎性細(xì)胞因子的分泌情況。結(jié)果顯示，肺炎鏈球菌誘導(dǎo)WT小鼠巨噬細(xì)胞分泌大量IL-1β，而NLRP6-/-巨噬細(xì)胞分泌這些細(xì)胞因子顯著減少。表明IL-1β產(chǎn)生部分依賴于肺炎鏈球菌感染巨噬細(xì)胞NLRP6的激活，在這一過程中，caspase-1可被招募并裂解前IL-1β為IL-1β。而IL-1β和IL-18的產(chǎn)生與胎膜早破合并HCA的發(fā)生發(fā)展有關(guān)[18]。由此推測(cè)NLRP6可能是以caspase-1依賴的方式產(chǎn)生炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使胎膜組織水腫、變脆而發(fā)生破裂導(dǎo)致PPROM。Anandl等[19]研究以NLRP6為靶點(diǎn)增強(qiáng)對(duì)細(xì)菌感染的免疫力，提出中和NLRP6可能提高宿主對(duì)細(xì)胞內(nèi)外的細(xì)菌病原體和革蘭氏陽性細(xì)菌的防御能力，增強(qiáng)固有免疫防御，其藥理作用可能成為一種對(duì)抗細(xì)菌性疾病的有效療法。根據(jù)本實(shí)驗(yàn)結(jié)果推測(cè)其可作為一種血清因子，可用來預(yù)測(cè)HCA的發(fā)生，且其創(chuàng)傷性較小。

本研究結(jié)果顯示，NLRP6主要表達(dá)于胎膜上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)、絨毛膜滋養(yǎng)細(xì)胞中。Zhu等[20]研究發(fā)現(xiàn)，與NLRP6同為NOD受體家族的NLRP3表達(dá)于胎膜上皮細(xì)胞、間充質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，與本研究結(jié)果相符，合并HCA的PPROM組患者胎膜組織中NLRP6及caspase-1蛋白和mRNA表達(dá)顯著高于對(duì)照組及未合并HCA的PPROM組?？赡茉蚴翘ツそM織中NLRP6以caspase-1依賴的方式，在病原體入侵后，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)，啟動(dòng)機(jī)體的非特異性免疫應(yīng)答，導(dǎo)致下游炎癥介質(zhì)的表達(dá)升高，產(chǎn)生大量酶類，特別是膠質(zhì)酶和含金屬蛋白酶類，破壞胎膜的膠質(zhì)[21]，導(dǎo)致羊膜的張力強(qiáng)度和彈性下降，發(fā)生胎膜早破。本研究結(jié)果還顯示，合并HCA的PPROM患者血清中NLRP6以及caspase-1表達(dá)較對(duì)照組顯著增加，而未合并HCA的PPROM組患者母血中NLRP6以及caspase-1表達(dá)較對(duì)照組無顯著差異，且3組之間白細(xì)胞計(jì)數(shù)、CRP比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?？赡苁荖LRP6的釋放引起了機(jī)體的局部炎癥反應(yīng)，呈亞臨床感染狀態(tài)，并未引起全身的免疫反應(yīng)，導(dǎo)致血中CRP及白細(xì)胞計(jì)數(shù)水平升高，推測(cè)NLRP6可能作為一種體液調(diào)節(jié)因子，其在外源性因素的刺激作用下形成有功能的炎性小體。在一項(xiàng)對(duì)NLRP6在大鼠腦缺血再灌注(I/R)損傷的研究中，使用大腦中動(dòng)脈閉塞/再灌注模型(MCAO)模擬缺血性損傷，結(jié)果顯示下調(diào)NLRP6后腦組織的病理損傷得到改善，表明NLRP6在腦I/R損傷中具有促炎癥作用[22]，與本研究結(jié)果相符。這對(duì)于臨床早期發(fā)現(xiàn)合并HCA的PPROM患者具有積極的臨床意義，從而減少感染的發(fā)生以及改善新生兒預(yù)后。

綜上所述，NLRP6可能以caspase-1依賴的方式參與PPROM合并HCA的發(fā)生。本研究?jī)H從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了研究，且病例數(shù)較少，具有一定的局限性，NLRP6在感染上的具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步探討，未來可從細(xì)胞水平探究相關(guān)機(jī)制，提供一個(gè)預(yù)測(cè)HCA的因子。