孫重期，束永前，毛文君

1南京醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，江蘇 南京 210029；2南京醫(yī)科大學附屬無錫人民醫(yī)院胸外科，江蘇 無錫 214023

肺癌是全球范圍內(nèi)發(fā)病率第2以及死亡率最高的惡性腫瘤，根據(jù)2020 年全球癌癥統(tǒng)計數(shù)據(jù)，全世界肺癌新發(fā)病例數(shù)為220 萬，占全部癌癥病例的11.4%，2020 年因肺癌死亡人數(shù)達到了180 萬，占總的癌癥相關死亡的18.0%［1］。其中，非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占肺癌總數(shù)的85%左右，其5年生存率僅為23%，遠遠低于乳腺癌和結(jié)直腸癌［2］。手術(shù)仍是早期和某些局部晚期肺癌（Ⅰ～ⅢA 期）的主要治療手段。但根據(jù)統(tǒng)計，約2/3 的肺癌患者確診時已處于局部進展期或有遠處轉(zhuǎn)移［3］，針對這部分患者，單純的手術(shù)治療已無法滿足需求。近年來，除了傳統(tǒng)的化學治療手段，靶向治療及免疫治療的問世使得NSCLC治療進入“個體化治療”和“精準治療”的時代。但是，以一代表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（EGFR-TKI）吉非替尼為例，存在20%～30%的原發(fā)性耐藥患者［4］，且只有少部分患者具有EGFR 的敏感突變（白種人群10%～20%，東亞人群約48%）［5］。而新興的免疫治療也只能使15%～25%的NSCLC患者獲益，多數(shù)患者對免疫檢查點抑制劑藥物存在原發(fā)性耐藥［6］。因此，亟待開拓新的治療手段，為臨床上更多的肺癌患者提供持續(xù)、穩(wěn)定的生存獲益。

近年來，小分子多肽類化合物因其分子量小、靶向性強、活性高、毒性低、易于跨膜吸收等優(yōu)點［7］，成為腫瘤防治領域研究的熱點之一。研究人員目前已證實，多種肽類化合物可以作用于腫瘤細胞自身的靶點，誘導細胞凋亡和壞死等進而殺傷腫瘤細胞；此外，它們還可以通過作用于腫瘤組織微環(huán)境中的新生血管和免疫細胞發(fā)揮抗腫瘤作用［8-12］。例如多肽peptide 1通過減少血管生長因子的表達而抑制卵巢癌細胞的侵襲［9］；多肽MTP-NeuNT 能通過抑制ErbB2的活性從而抑制乳腺癌細胞的生長和轉(zhuǎn)移［13］。

隨著多肽組學技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)已經(jīng)成功應用于多種疾病的診斷和治療。針對人體組織的多肽組學分析，是以機體內(nèi)源性多肽和低分子量蛋白質(zhì)為研究對象，研究多肽組的結(jié)構(gòu)、功能、變化規(guī)律及其相關關系，來提供蛋白質(zhì)水解活動以及潛在生物活性肽的重要信息［14］。盡管多肽抗腫瘤的研究受到越來越多的關注，但內(nèi)源性多肽在肺癌中的作用卻鮮有報道。本研究使用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)鑒定肺腺癌組織和癌旁組織中分泌的多肽，探討這些內(nèi)源性多肽與肺腺癌惡性表型之間的關系，以期為尋找肺癌治療的新靶點提供一定幫助。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 樣本收集

收集2020年2月無錫市人民醫(yī)院初診的3例肺腺癌患者的腫瘤組織和相鄰的癌旁非腫瘤組織，3 例患者為年齡相匹配的男性，術(shù)前均未進行手術(shù)、放化療及介入等治療，且術(shù)后均得到明確的病理學診斷。本研究已經(jīng)過醫(yī)院倫理審查委員會批準，所有患者在收集前均被告知參與研究并簽署知情同意書。所有標本均在術(shù)后迅速放入液氮中冷凍保存，以備下一步的多肽提取。

1.1.2 主要試劑和材料

RPMI 1640細胞培養(yǎng)基、PBS、EDTA-胰酶、青霉素、鏈霉素、胎牛血清（Gibco 公司，美國）；苯甲基磺酰氟、二硫蘇糖醇、碘乙酰胺、乙腈、蛋白酶抑制劑混合物（Sigma-Alrich 公司，美國）；Cell Counting Kit 8（CCK-8）細胞增殖檢測試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、考馬斯亮藍染色液、蛋白裂解液（上海碧云天公司）；TMT蛋白標記試劑盒（Thermo Fisher公司，美國）；10 kDa MWCO超濾離心管（Millipore公司，美國）；相關多肽由南京金斯瑞生物公司合成。

1.2 方法

1.2.1 多肽提取和純化

收集適量的各個樣品進行多肽提取。樣品液氮研磨后加入蛋白裂解液，吹打混勻后加入蛋白酶抑制劑混合物（終濃度為1 mmol/L PMSF、2 mmol/L EDTA、10 mmol/L DTT），混合，冰上超聲10 min。接著樣品于4 ℃以12 000 r/min 離心30 min，收集上清液。使用10 kDa 超濾離心管再次離心以收集過濾液并去除蛋白質(zhì)和大于10 kDa的多肽，測定蛋白質(zhì)濃度。上清液通過Speed-vac 系統(tǒng)真空干燥并立即在-80 ℃冷凍直至使用。

1.2.2 多肽標記和LC-MS/MS

將樣本根據(jù)來源分為癌組織組（LC 組）以及癌旁組織組（PC 組），依照制造商的說明使用5 μL TMT試劑標記樣品，將標記的樣品混合并同時通過納升級液相色譜（Easy-nLC，Thermo Fisher Scientific公司，美國）以及軌道阱質(zhì)譜儀（LTQ-Orbitrap Velos mass spectrometer，Thermo Fisher Scientific 公司，美國）對標記的肽進行分析。所有相關實驗均在南京醫(yī)科大學檢測中心（http：//fxcszx.njmu.edu.cn/）完成。

1.2.3 生物信息學和生物活性肽篩選

通過在線工具Protparam（http：//web.expasy.org）計算多肽的分子量（molecular weight，MW）以及等電點（isoelectric point，PI）。癌和癌旁差異表達的多肽相關的前體基因通過在線工具DAVID（（http：//david.abcc.ncifcrf.gov/）與GO 數(shù)據(jù)庫（Gene Ontology）、KEGG 數(shù)據(jù)庫（https：//www.kegg.jp/）進行比對，對其進行功能注釋和通路富集；利用在線工具Open Targets Platform（www.targetvalidation.org/）預測這些差異多肽相關前體蛋白與肺癌之間的關系；通過網(wǎng)站（https：//string-db.org）對差異前體蛋白進行蛋白互作網(wǎng)絡（protein protein interaction network，PPI network）分析。

1.2.4 細胞培養(yǎng)和多肽制備

人肺腺癌細胞株A549 和H1975 細胞購自中國科學院上海生命科學研究院細胞庫。細胞傳代培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，置于5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中進行常規(guī)培養(yǎng)。每隔2 d用EDTA-胰酶消化傳代。取對數(shù)生長的細胞用于后續(xù)實驗。相關多肽由南京金斯瑞生物公司定制合成，獲得后溶解于無菌蒸餾水（疏水性的多肽溶解時使用冰上超聲處理3 min），儲存于-40 ℃冰箱中。

1.2.5 CCK-8實驗

取對數(shù)生長期的A549 和H1975 細胞，以每孔4 000 個接種于96 孔細胞培養(yǎng)板，每孔加入200 μL培養(yǎng)基，正常培養(yǎng)過夜。按試驗要求處理細胞（每組3個平行孔，獨立重復3次），加入等體積PBS做為對照，分別置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)0～48 h 后，移除培養(yǎng)基，每孔加入提前配制的10%CCK-8溶液100 μL，1～2 h后于波長450 nm測各孔吸光度值。

1.2.6 Transwell實驗

收集饑餓培養(yǎng)12 h的細胞，制備細胞懸液。取出Transwell 小室置于24 孔板中，小室上層加入無血清RPMI1640 培養(yǎng)基200 μL，下層加入含有BSA 或小分子多肽的RPMI1640培養(yǎng)基650 μL；取稀釋過的Matrigel 30 μL加到Transwell上室，在37 ℃下孵育2 h，使Matrigel聚合成膠（研磨組織提取上清僅做遷移實驗）。將細胞懸液（細胞數(shù)約5×104個）加入小室內(nèi)，置于5%CO237 ℃的恒溫培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)24 h。取出小室，室溫下用甲醛固定15 min，去除固定液后予結(jié)晶紫染色，用棉簽擦去孔膜上層的細胞，在燒杯中反復用清水漂洗小室，用倒置顯微鏡拍攝膜底層的細胞，每個小室至少取5個視野，統(tǒng)計細胞數(shù)目，從而判斷細胞侵襲能力。

1.2.7 劃痕實驗

制備培養(yǎng)單層細胞，用針頭在6 孔板底部劃出“一”字線，可作為后續(xù)拍照、觀察的位點，將適當密度的細胞（1×106個/孔）接種于6孔板中，各樣本均設3 個復孔，37 ℃靜置過夜后，分別接受相應的處理。將處理過的細胞置入5%CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，取出換液后，用10 μL移液器吸頭沿板底部作“｜”字形劃痕，用滅菌的PBS洗滌細胞，更換培養(yǎng)基。按0～48 h的時間點，在倒置顯微鏡下尋找“十”字交叉處確定劃痕邊緣并拍照。測量前后兩次照片固定點劃痕邊緣的相對距離，并計算不同時間點相對距離的差值，以此數(shù)據(jù)判斷細胞遷移能力的大小。

1.3 統(tǒng)計學方法

使用SPSS25.0 統(tǒng)計軟件，部分作圖使用Graphpad Prism 8以及R（version 4.0.5）。本研究所有實驗數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標準差（）表示；通過配對t檢驗和雙因素方差分析進行組間比較分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 肺腺癌組織和癌旁組織分泌的內(nèi)源性多肽對A549和H1975細胞惡性表型的影響

將年齡匹配的3 例男性肺腺癌患者的癌組織（LC 組）和癌旁組織（PC 組）研磨提取上清后，SDSPAGE 膠結(jié)果顯示研磨組織上清中的確含有許多14 kDa 以下的小分子多肽（圖1A）。后續(xù)通過相關實驗提取組織中的小分子多肽，為了驗證兩組多肽是否有功能，將兩組多肽以20 μmol/L的濃度加入到肺腺癌細胞株A549和H1975中。CCK-8結(jié)果顯示，與PBS 對照組相比，LC 組多肽顯著促進了A549 和H1975 的增殖，而PC 組多肽則抑制了A549 和H1975 的增殖（圖1B、C）；Transwell 實驗顯示LC 組多肽能促進A549 和H1975 細胞的遷移能力，PC 組多肽則能抑制A549 和H1975 細胞的遷移能力（圖1D）。這些結(jié)果提示，肺腺癌組織分泌的多肽可能促進肺腺癌細胞株的惡性表型，而癌旁組織分泌的多肽則具有抑制肺腺癌細胞株惡性表型的能力。

圖1 肺腺癌和癌旁組織分泌多肽檢測以及功能驗證Figure 1 Detection and functional verification of peptides secreted by lung adenocarcinoma and adjacent tissues

2.2 肺腺癌和癌旁組織分泌多肽的基本特征

以LC-MS/MS技術(shù)鑒定了上清中分泌的4 538條多肽，結(jié)果發(fā)現(xiàn)了242 條在兩組間有差異表達的多肽，共關聯(lián)202個前體蛋白（部分前體蛋白關聯(lián)數(shù)個多肽）；其中，相對于PC組，LC組中有低表達的多肽95 條，差異高表達的多肽147 條（差異倍數(shù)≥2.0，F(xiàn)DR＜0.05）（圖2A、B）。通過在線工具計算了這些差異多肽的分子量和等電點，其分子量主要分布在≥2 000、700～＜900、500～＜700 Da這3個區(qū)間；等電點主要分布在10～＜11、8～＜9、9～＜10 這3 個區(qū)間（圖2C、D）。先前研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)源性多肽的功能往往與其前體蛋白的功能相關，為了尋找這些差異多肽前體蛋白的潛在功能，進一步進行了GO 分析和KEGG 通路富集分析（圖2E、F），此外，通過在線工具對這些差異多肽前體蛋白繪制了蛋白互作網(wǎng)絡圖（圖2G）。

圖2 多肽的基本特征及其潛在功能分析Figure 2 Basic characteristics and potential function analysis of peptides

2.3 功能性差異多肽的篩選及其基本特征

用Open Targets Platform 在線工具預測這些差異前體蛋白與肺癌之間的關系，在分析的202 個前體蛋白中，有79個蛋白可能與肺癌發(fā)生與發(fā)展存在關聯(lián)。與這些前體蛋白對應的共有101 條多肽，根據(jù)LC-MS/MS 分析的結(jié)果，選取了其中組間差異較大（差異倍數(shù)≥3）、組內(nèi)差異相對較小、質(zhì)譜信號較高，同時在PC組高表達的7條多肽進行進一步的功能研究。擬研究的這7 條多肽的前體蛋白分別是：KAT6B、IQGAP1、ITGA2、BRD4、HSPA1A、VDR 和IGSF10。研究發(fā)現(xiàn)，這7種前體蛋白（或?qū)幋a基因）都被明確報道與肺癌相關［15-21］。為了便于研究，將這7條多肽分別命名為LACRP1～7（lung adenocarcinoma related peptide1-7）。在此基礎上，利用在線工具ProtParam tool，對這7 條多肽進行進一步的分析（表1），結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LACRP4、LACRP6 這兩條多肽不穩(wěn)定系數(shù)較高（＞40），故在后續(xù)研究中將其剔除。

表1 7條內(nèi)源性多肽的基本特征Table 1 Basic characteristics of 7 endogenous peptides

2.4 多肽LACRP2 在A549 和H1975 細胞中的體外功能實驗

將通過化學合成得到的多肽LACRP1、LACRP2、LACRP3、LACRP5、LACRP7，以 20、50 μmol/L 的濃度加入到人肺腺癌細胞株A549 和H1975 中進行生物學功能實驗。劃痕結(jié)果顯示，在濃度為50 μmol/L時，僅有多肽LACRP2能同時抑制A549 和H1975 的遷移（圖3A）；然而CCK-8 試驗未能證實LACRP2 對A549 和H1975 增殖能力的抑制（圖3B、C），Transwell 實驗結(jié)果顯示LACRP2能抑制A549和H1975的侵襲能力（圖3D）。這些結(jié)果證實多肽LACRP2具有體外抑制肺腺癌細胞株部分惡性表型的功能。

圖3 多肽LACRP2在細胞水平功能驗證Figure 3 Functional verification of polypeptide LACRP2 at the cell level

3 討論

近年來，由于存在低分子量、高靈敏度、低耐藥性和易于修飾等優(yōu)點，肽類藥物成為眾多研究的熱點，多種抗腫瘤肽已上市并應用于患者的臨床治療［22］。肽可以通過多種機制誘導細胞死亡，包括破壞細胞膜、細胞凋亡、腫瘤血管生成抑制、免疫調(diào)節(jié)、細胞信號通路破壞、細胞周期調(diào)節(jié)、DNA 修復通路或其他細胞死亡途徑。但抗腫瘤肽的研究主要集中于通過文庫制備生物合成肽，內(nèi)源性肽的研究相對較少。

隨著研究的深入，內(nèi)源性多肽被發(fā)現(xiàn)在大多數(shù)生理過程中發(fā)揮著重要作用，例如神經(jīng)遞質(zhì)、激素、細胞因子調(diào)控、免疫調(diào)節(jié)等［23］。由于質(zhì)譜技術(shù)的進步，多肽組學成為蛋白質(zhì)組學分化出來的新興領域，以機體內(nèi)源性多肽為研究對象，研究多肽組的結(jié)構(gòu)、功能、變化規(guī)律及其相關關系。這項技術(shù)可以更好地幫助了解腫瘤細胞及其復雜而特殊的基質(zhì)微環(huán)境以及尋找特定的新生物標志物和治療策略。本研究首次報道了人類肺腺癌和癌旁組織的多肽組學研究結(jié)果。分別提取了3對年齡匹配的男性肺腺癌組織和癌旁組織的內(nèi)源性多肽，體外實驗證實，這些多肽可以影響A549和H1975細胞株的部分惡性表型。后續(xù)使用LC-MS/MS技術(shù)，鑒定了10 kDa以下的4 538條多肽，約85%的多肽分子量小于3 kDa（3 843/4 538）；經(jīng)過比較，共篩選出242條存在差異表達的多肽，對應202個前體蛋白。

對這些差異前體蛋白進行生物信息學分析，GO分析的結(jié)果顯示這些差異多肽的前體蛋白主要涉及細胞周期、染色質(zhì)修飾、細胞黏附以及細胞骨架等重要生物學功能的調(diào)控；KEGG 通路富集分析顯示這些蛋白主要涉及上調(diào)MYC通路、細胞有絲分裂等，以及下調(diào)細胞EMT、對紫外線反應、蛋白分泌等。這些功能和通路均與腫瘤發(fā)生發(fā)展存在密切聯(lián)系。而蛋白互作網(wǎng)絡圖表明這些差異前體蛋白之間存在較強的相互作用，位于網(wǎng)絡圖中蛋白互作最密切的區(qū)域，可以看到這些蛋白大多與細胞周期調(diào)節(jié)、染色質(zhì)修飾、DNA損傷修復、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等功能有關。以上結(jié)果也進一步佐證了上一步體外實驗中的發(fā)現(xiàn)，這些差異多肽可能與腫瘤細胞的凋亡和遷移等有關。

通過公共數(shù)據(jù)庫以及在線工具的挖掘，篩選出5條多肽進行后續(xù)研究。人工合成這5條多肽，驗證它們對A549和H1975細胞株惡性表型的影響，最終發(fā)現(xiàn)LACRP2具有一定程度上抑制肺腺癌細胞惡性表型的功能。此外，檢索了多肽數(shù)據(jù)庫（BIOPEP、PeptideDB、APD2）和文獻，未發(fā)現(xiàn)有關LACRP2 多肽及同源序列的相關研究，說明這是一條全新的與肺腺癌細胞惡性表型相關的內(nèi)源性多肽。該多肽氨基酸序列為KTEVSLTL，其分子量為890.04 Da，屬于小分子多肽，等電點為6.0，不穩(wěn)定系數(shù)32.83，屬于穩(wěn)定結(jié)構(gòu)；其脂肪指數(shù)133.75，親水性0.275，屬于親脂性多肽。這也提示LACRP2易通過擴散或胞吞作用進入細胞內(nèi)，其前體蛋白為IQGAP1。研究證實，MAP4K3 轉(zhuǎn)基因小鼠揭示了該基因可通過形成蛋白復合物、磷酸化來激活IQGAP1，進而促進肺癌細胞的遷移，并誘導肺癌細胞產(chǎn)生遠處轉(zhuǎn)移；并且，MAP4K3-IQGAP1 蛋白復合體的過表達亦會導致肺癌患者預后不良［24］。然而，LACRP2 在肺腺癌發(fā)生發(fā)展中的分子機制沒有闡明，其下游結(jié)合蛋白仍然未知，今后將通過進一步實驗來研究和證實LACRP2在肺腺癌中的作用。

綜上所述，本研究通過多肽組學手段，從肺腺癌組織和癌旁組織中篩選出具有抑制肺腺癌細胞惡性表型的新型內(nèi)源性多肽LACRP2，目前該多肽未見其他報道。鑒于多肽類藥物具有分子量小、腫瘤靶向性、低免疫原性、低耐藥性、易于合成和改造等諸多優(yōu)勢，有望成為腫瘤治療的新選擇。