陳 亮，柏 潔，鄭扣龍

南通大學(xué)第二附屬醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南通 226001

急性冠狀動(dòng)脈綜合征（acute coronary syndrome，ACS）是以冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂或侵襲，繼發(fā)完全或不完全閉塞性血栓形成為病理基礎(chǔ)的一組臨床綜合征。包括急性ST 段抬高性心肌梗死（acute ST segment elevation myocardial infarction，STEMI）、急性非ST 段抬高性心肌梗死（non ST segment elevation myocardial infarction，NSTEMI）和不穩(wěn)定型心絞痛（unstable angina，UA）。該組疾病發(fā)病急、病死率高，是心血管系統(tǒng)的急危重癥之一?？焖贉?zhǔn)確判斷患者病情和預(yù)后，對(duì)ACS的治療至關(guān)重要。

研究證明吸煙、大量飲酒、高血壓、高脂血癥及糖尿病是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病的危險(xiǎn)因子［1-4］。動(dòng)脈粥樣硬化不僅是大量脂質(zhì)堆積在動(dòng)脈壁的結(jié)果，從脂紋產(chǎn)生到復(fù)雜的動(dòng)脈粥樣斑塊形成及其并發(fā)癥的出現(xiàn)，白細(xì)胞浸潤和內(nèi)皮炎癥因子表達(dá)改變貫穿于每個(gè)階段，炎癥反應(yīng)在其中均起重要作用，因此抑制炎癥反應(yīng)，消除炎癥因子誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答，可能成為治療冠心病的新方法［5］。

Kruppel 樣轉(zhuǎn)錄因子2（Kruppel-like factor 2，KLF2）屬于鋅指Kruppel 樣轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，廣泛表達(dá)于各種組織，編碼轉(zhuǎn)錄激活劑和阻遏蛋白［6］。近年來的研究發(fā)現(xiàn)，KLF2在T淋巴細(xì)胞激活、分化、增殖、凋亡和遷移等方面扮演重要角色。特異性敲除KLF2 表達(dá)的小鼠T 細(xì)胞CD62L、CCR7下降，且T細(xì)胞KLF2表達(dá)與CD62L、CCR7表達(dá)正相關(guān)，而與趨化因子受體CCR5 等負(fù)相關(guān)［7］。此外，KLF2 表達(dá)缺失的T 細(xì)胞表面CXCR3 表達(dá)升高，導(dǎo)致T細(xì)胞歸巢減少而異常聚集于外周靶器官［8］。因此轉(zhuǎn)錄因子KLF2可能是調(diào)控CD62L、CCR7和CXCR3等T細(xì)胞遷移相關(guān)分子的上游因子。

研究發(fā)現(xiàn)，常用于ACS 防治的他汀類藥物，也可通過升高人類及小鼠T 細(xì)胞KLF2 表達(dá)，降低T細(xì)胞炎性效應(yīng)，減輕T 細(xì)胞介導(dǎo)的組織病理損傷，且既往研究表明，他汀類藥物可通過促使T 細(xì)胞向Th2 分化，減少Th1 及其效應(yīng)因子產(chǎn)生，從而減輕炎性反應(yīng)［9］。然而其減輕組織炎性反應(yīng)的作用是否通過調(diào)控KLF2 表達(dá)實(shí)現(xiàn)尚未證實(shí)，其作用機(jī)制亦不清楚。

越來越多的研究表明，KLF2 與炎癥的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，而KLF2在ACS中的研究甚少，本研究擬通過檢測KLF2基因及相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子在ACS患者中的表達(dá)，探討KLF2在ACS的發(fā)生、發(fā)展中的作用及潛在的臨床意義；并研究KLF2 與Gensini 評(píng)分的相關(guān)性，可能成為ACS防治及檢測的靶點(diǎn)。

1 對(duì)象和方法

1.1 對(duì)象

收集2020年1月—2021年5月收治于南通市第一人民醫(yī)院心內(nèi)科住院部確診為ACS 患者123 例（ACS組），包括UA組45 例，NSTEMI組38例，STEMI組40 例。同時(shí)選取同時(shí)間段冠脈造影正常的患者45例為對(duì)照組，冠脈造影及手術(shù)報(bào)告由2名經(jīng)驗(yàn)豐富的介入人員完成。ACS診斷參照2014年美國心臟病學(xué)會(huì)（American College of Cardiology，ACC）和美國心臟協(xié)會(huì)（American Heart Association，AHA）發(fā)布的心血管診療指南標(biāo)準(zhǔn)［10-11］。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021KT138），所有患者均簽署知情同意書。

1.2 方法

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：UA 組，根據(jù)病史上出現(xiàn)典型的心絞痛癥狀、典型的缺血性心電圖改變（新發(fā)或一過性ST 段壓低≥0.1 mV，或T波倒置≥0.2 mV），實(shí)驗(yàn)室檢查cTNI不升高。NSTEMI組，根據(jù)病史上出現(xiàn)典型的心絞痛癥狀、典型的缺血性心電圖改變（新發(fā)或一過性ST段壓低≥0.1 mV，或T波倒置≥0.2 mV），實(shí)驗(yàn)室檢查心肌肌鈣蛋白I（cardiac troponin I，cTNI）升高。STEMI組，根據(jù)典型的臨床表現(xiàn)，特征性的心電圖改變（T 波高尖、ST 段弓背向上抬高、新發(fā)的完全性左束支傳導(dǎo)阻滯）以及實(shí)驗(yàn)室檢查cTNI升高。對(duì)照組，行冠狀動(dòng)脈造影提示冠狀動(dòng)脈主支［左主干（left main，LM）、前降支（left anterior descending artery，LAD）、回旋支（left circumflex，LCX）或右冠狀動(dòng)脈（right coronary artery，RCA）］及其主要分支血管管腔直徑無明顯狹窄。既往無冠心病史，心電圖無心肌缺血改變，心肌酶學(xué)正常。

排除標(biāo)準(zhǔn)：排除發(fā)熱、急慢性感染、惡性腫瘤、嚴(yán)重肝腎功能不全、自身免疫性疾病、血液疾病、腦卒中、肌源性疾病、瓣膜性心臟病、心肌病、心力衰竭患者，B 超提示頸內(nèi)動(dòng)脈狹窄、腎動(dòng)脈狹窄患者，其他重大疾病患者，不愿入組者和精神心理疾病、長期臥床不能自理者。

1.2.2 蛋白印跡（Western blot）試驗(yàn)

收集血液后提取總蛋白，SDS/PAGE 電泳，冰浴下80 V 轉(zhuǎn)膜60 min。室溫封閉2 h，一抗（KLF2 及GAPDH 均為1∶1 000 稀釋），二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的IgG均為1∶10 000稀釋），室溫孵育1～2 h，化學(xué)發(fā)光法檢測后分析結(jié)果。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

應(yīng)用TRIzol 裂解細(xì)胞并提取各組細(xì)胞總RNA后，按試劑說明反轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR 檢測表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。引物由Invitrogen 公司合成（表1）。

表1 PCR引物序列Table 1 The sequences of PCR primers

1.2.4 外周血單個(gè)核細(xì)胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）提取

取ACS 組及對(duì)照組的外周血2 mL 于EDTA-Na抗凝管內(nèi)，輕輕混勻，梯度密度離心，加入與管內(nèi)剩余部分血漿相應(yīng)體積的PBS緩沖液稀釋，混勻，加入5倍體積的紅細(xì)胞裂解液，適量PBS緩沖液洗滌2次，100 μL PBS緩沖液重懸細(xì)胞，即為PBMC懸液。

1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)

在PBMC 懸液中，先加入Fc 受體阻斷劑，抗-CD16/32，孵育10 min阻斷非特異性結(jié)合后，再加入流式抗體，抗人CD3 及抗人CD8 標(biāo)記T 細(xì)胞群，PE標(biāo)記抗人CD62L、PE-Cyanine7標(biāo)記抗人CCR7、APC標(biāo)記抗人CXCR3、異硫氰酸熒光素（FITC）標(biāo)記抗人CD44（eBioscience公司，美國）。避光孵育15 min后，加入1 mL PBS 洗細(xì)胞，400g離心5 min 后，400 μL PBS重懸，待上機(jī)檢測。

1.2.6 Gensini評(píng)分

Gensini評(píng)分又稱冠狀動(dòng)脈評(píng)分，是用于量化急性心肌梗死嚴(yán)重程度、制定治療方案及評(píng)估預(yù)后的重要指標(biāo)（表2）。

表2 Gensini評(píng)分表Table 2 Gensini Score

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)至少3 次。采用SPSS22.0 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)服從正態(tài)或近似正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)描述，多組間比較采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用率（%）進(jìn)行描述，多組間比較采用卡方檢驗(yàn)，組間兩兩比較采用Bonferroni 法調(diào)整。P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 基本特征

各組患者的臨床特征如表3 所示。各組在年齡、性別、吸煙史、糖尿病、低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）、腎功能（creatinine，Cr）等臨床指標(biāo)上差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表3）。

表3 各組臨床資料比較Table 3 Comparison of clinical data in each group

2.2 KLF2基因在各組中的表達(dá)情況

為了探討KLF2基因是否參與了ACS 的炎性反應(yīng)過程，分別采用Western blot和qRT-PCR方法檢測外周血中KLF2 蛋白（圖1A）和mRNA（圖1B）在各組的表達(dá)水平，結(jié)果見KLF2 mRNA 和蛋白水平在ACS 組中均顯著減低，STEMI 組和NSTEMI 組KLF2基因的表達(dá)量明顯低于UA 組及對(duì)照組，且STEMI組外周血中的KLF2水平低于NSTEMI組。

圖1 各組KLF2 mRNA及蛋白表達(dá)情況Figure 1 The expressions of KLF2 protein and mRNA in each group

檢測NSTEMI 組、STEMI 組治療前后外周血中KLF2 蛋白（圖2A）及mRNA（圖2B）表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)NSTEMI 組及STEMI 組的患者外周血中KLF2 表達(dá)水平較治療前明顯增加，STEMI 組中KLF2 變化更大；上述結(jié)果表明KLF2 不僅在ACS 中發(fā)揮著重要作用，并且在急性心肌梗死中的作用更明顯。

圖2 STEMI 和NSTEMI 組治療前后KLF2 蛋白和mRNA的表達(dá)情況Figure 2 The expressions of KLF2 protein and mRNA in STEMI and NSTEMI group before and after treatment

2.3 KLF2基因可減輕ACS的炎性反應(yīng)

越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，KLF2 廣泛表達(dá)于各種組織，編碼轉(zhuǎn)錄激活劑和阻遏蛋白［12］，尤其在T 淋巴細(xì)胞激活、分化、增殖、凋亡和遷移等方面扮演重要角色。

研究表明CD62L是表達(dá)于T細(xì)胞表面的歸巢受體，介導(dǎo)T 細(xì)胞歸巢入外周淋巴組織，CCR7 亦是介導(dǎo)T細(xì)胞歸巢的重要因素之一。因此分別檢測各組CD62L（圖3A）和CCR7（圖3B）在T細(xì)胞中的陽性表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，STEMI 組、NSTEMI、UA 組CD62L 和CCR7 表達(dá)水平均低于對(duì)照組，且表達(dá)量上，STEMI 組＜NSTEMI＜UA 組，提示發(fā)生ACS 后，KLF2的水平下降，可使T細(xì)胞歸巢至淋巴組織的能力降低，增加炎性反應(yīng)的可能。

雖然KLF2 的降低可使T 細(xì)胞表面的CD62L 和CCR7 表達(dá)降低，減少T 細(xì)胞歸巢，但并不能證明效應(yīng)T細(xì)胞隨之增多，導(dǎo)致心臟炎性反應(yīng)發(fā)生。因此，進(jìn)一步檢測ACS 組中CXCR3（圖3C）和CD44（圖3D）在T 細(xì)胞中的陽性表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STEMI組、NSTEMI 組、UA 組CXCR3 和CD44 均高于對(duì)照組，且表達(dá)量上，STEMI組＞NSTEMI組＞UA組。由于初始T細(xì)胞不表達(dá)或低表達(dá)趨化因子受體CXCR3，炎性環(huán)境下細(xì)胞活化后CXCR3表達(dá)升高，介導(dǎo)T細(xì)胞向炎性部位遷移?；罨蜃覥D44在一定程度上反映了T 細(xì)胞激活狀態(tài)。因此上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)，KLF2的減少直接下調(diào)了T細(xì)胞表面CD62L和CCR7的表達(dá)水平，增加了CXCR3和CD44表達(dá)，減少T細(xì)胞歸巢及在外周循環(huán)定植，而向靶器官聚集增加，提示KLF2的降低可促使T細(xì)胞活化，增加效應(yīng)T細(xì)胞的功能，加重ACS患者的炎癥損傷。

圖3 各組T細(xì)胞表面分子表達(dá)情況Figure 3 Expression of T cell surface molecules in each group

2.4 KLF2基因與Gensini評(píng)分的相關(guān)性研究

證實(shí)KLF2基因在ACS 炎性反應(yīng)中發(fā)揮重要作用后，進(jìn)一步探討KLF2基因可否成為評(píng)估冠脈病變嚴(yán)重程度的有效指標(biāo)。Gensini評(píng)分是臨床上常用的評(píng)估冠脈狹窄嚴(yán)重程度的指標(biāo)。因此運(yùn)用Spearman相關(guān)分析比較ACS患者Gensini評(píng)分和KLF2 mRNA表達(dá)的相關(guān)性（圖4）。經(jīng)統(tǒng)計(jì)，Gensini 評(píng)分與KLF2 mRNA的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（r=-0.292，P=0.001）。

圖4 Gensini評(píng)分與KLF2的mRNA表達(dá)的相關(guān)性Figure 4 The correlation of Gensini score and the mRNA expression of KLF2

3 討論

ACS 不僅在發(fā)生、發(fā)展過程中與各種急慢性炎癥密切相關(guān)，而且在治療后也需要解決炎癥反應(yīng)及新生內(nèi)膜增生等導(dǎo)致的再狹窄問題［13］。隨著冠狀動(dòng)脈介入治療（percutaneous coronary intervention，PCI）的快速發(fā)展和普及，PCI 術(shù)后的再狹窄問題愈來愈受到關(guān)注，目前普遍公認(rèn)的機(jī)制為病變血管組織缺氧或低氧及反復(fù)球囊擴(kuò)張及血管內(nèi)支架置入術(shù)致血管內(nèi)膜機(jī)械性損傷、局部組織壞死，產(chǎn)生的潛在致炎因子可引起血管壁的急性和慢性炎癥反應(yīng)。因此找到炎癥反應(yīng)的開關(guān)，從源頭監(jiān)控炎癥反應(yīng)的發(fā)生至關(guān)重要［14］。

KLF2 廣泛表達(dá)于肺臟、脾臟、心臟、骨骼肌、胰腺和胎盤等組織，編碼轉(zhuǎn)錄激活劑和阻遏蛋白［15］。因最初發(fā)現(xiàn)其主要在肺內(nèi)表達(dá)，也稱肺Kruppel 樣轉(zhuǎn)錄因子（lung kruppel-like factor，LKLF）。KLF2 包含一個(gè)轉(zhuǎn)錄激活域、自抑制域和鋅指結(jié)構(gòu)域（即特定的DNA 結(jié)合域），通過轉(zhuǎn)錄激活或抑制在體內(nèi)發(fā)揮重要的生物學(xué)功能。KLF2對(duì)于肺發(fā)育、血管形成是必不可少的［16］。KLF2 可通過抑制單核細(xì)胞炎癥因子，如白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-1β、IL-8、腫瘤壞死因子（tumor necrosis fuctor，TNF）-α和單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）等的表達(dá)發(fā)揮抗炎作用［17］。

本研究分別從mRNA 及蛋白水平檢測了ACS患者外周血中KLF2 的表達(dá)水平，結(jié)果顯示ACS 患者中KLF2 表達(dá)水平明顯低于對(duì)照組，并且在AMI組中尤為明顯。同時(shí)經(jīng)手術(shù)及相應(yīng)治療后AMI 患者外周血中KLF2 的表達(dá)水平較治療前明顯升高，與對(duì)照組KLF2 表達(dá)水平相仿。初步證明KLF2 基因參與了ACS的發(fā)生發(fā)展。本研究發(fā)現(xiàn)4組LDL均不高，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與本研究中患者在懷疑疾病初期已預(yù)防性使用他汀類藥物有關(guān)，而他汀類藥物已被普遍證實(shí)可減輕機(jī)體部分炎癥反應(yīng)，但其是否通過調(diào)控KLF2的表達(dá)來發(fā)揮功能仍需進(jìn)一步研究。

近年研究表明，轉(zhuǎn)錄因子KLF2 在T 細(xì)胞激活、分化、增殖及凋亡、遷移等方面扮演著重要角色。KLF2在CD4+CD8+雙陽性T細(xì)胞中不表達(dá)，而在成熟的CD4+或CD8+單陽性初始T細(xì)胞中高表達(dá)。T細(xì)胞激活時(shí)，KLF2 mRNA 及蛋白水平均明顯下降。此外，維持KLF2表達(dá)可保持T細(xì)胞靜息狀態(tài)［18-20］。研究顯示，通過檢測非淋巴組織，如肝、腎、骨骼肌等部位的T 細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)KLF2-/-小鼠這些部位的T細(xì)胞數(shù)明顯高于野生型對(duì)照組小鼠，且浸潤的T 細(xì)胞表型發(fā)生改變，表達(dá)一些正常的初始T 細(xì)胞不表達(dá)的趨化因子受體，如CCR1、CCR3、CCR5、CCR6、CXCR1、CXCR2、CXCR3、和XCR1 等［21-22］。

推測在ACS中，KLF2表達(dá)缺失可導(dǎo)致T細(xì)胞表面分子表達(dá)異常，改變了T細(xì)胞遷移模式，導(dǎo)致T細(xì)胞在體內(nèi)分布異常，可能表現(xiàn)為T 細(xì)胞在外周淋巴組織中減少，而在非淋巴組織中聚集增多，促使心肌炎癥反應(yīng)的爆發(fā)。KLF2 涉及多種T 細(xì)胞遷移相關(guān)表面分子的表達(dá)［21］。KLF2 可結(jié)合CD62L 啟動(dòng)子序列，通過轉(zhuǎn)錄激活直接促進(jìn)CD62L 表達(dá)［23］，在初始及效應(yīng)T細(xì)胞中，KLF2與CD62L、CCR7的表達(dá)水平正相關(guān)，而與CCR5表達(dá)負(fù)相關(guān)［7］。

因此，進(jìn)一步檢測ACS 患者外周血中T 細(xì)胞表面CD62L、CCR7、CXCR3 和CD44 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)STEMI 組、NSTEMI 組、UA組CD62L和CCR7低于對(duì)照組，而CXCR3和CD44高于對(duì)照組，并且隨著ACS病變程度的加重，差異越大。結(jié)果很好地證實(shí)了本研究的猜想，KLF2缺失導(dǎo)致T細(xì)胞表面分子表達(dá)異常，即CD62L和CCR7等減少，而炎性趨化因子受體，如CXCR3表達(dá)增加，引起T細(xì)胞遷移模式發(fā)生改變，導(dǎo)致T細(xì)胞歸巢減少，同時(shí)CD44的增加說明處于激活狀態(tài)的T 細(xì)胞增多，而向炎癥反應(yīng)區(qū)域的遷移增加，進(jìn)一步說明KLF2可減輕ACS的炎性反應(yīng)。

本研究發(fā)現(xiàn)，UA組、NSTEMI組、STEMI組、對(duì)照組KLF2的表達(dá)，各組間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，并且與Gensini 評(píng)分緊密相關(guān)，進(jìn)一步體現(xiàn)了KLF2 基因在評(píng)估冠狀動(dòng)脈阻塞方面的優(yōu)越性。

綜上所述，KLF2基因在ACS患者中顯著低表達(dá)，KLF2 可通過調(diào)控T 細(xì)胞表面CD62L、CCR7、CXCR3和CD44 等水平參與ACS 的炎癥反應(yīng)。KLF2 在診斷ACS方面可能比心肌標(biāo)志物效能更高，對(duì)于監(jiān)測病情可能有輔助價(jià)值，可能成為預(yù)防冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的新的炎癥指標(biāo)。尤為重要的是，KLF2有望作為ACS的治療靶點(diǎn)，值得進(jìn)一步深入研究。