鄧 歡，呂藝蓁，劉 宣，肖 香，喬利春，郭紫薇，趙 妍，劉家欣，韓 晶

（西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)部公共衛(wèi)生學(xué)院，陜西西安 710061）

大骨節(jié)病(Kashin-Beck disease,KBD)是一種兒童發(fā)育中以四肢關(guān)節(jié)透明軟骨變性、壞死以及繼發(fā)性骨關(guān)節(jié)病為主要病變特征的地方性、多發(fā)性、慢性變形性骨關(guān)節(jié)病。情況嚴重時，還會引發(fā)化骨障礙和干骺早閉，導(dǎo)致骨骼發(fā)育不良和畸形，或出現(xiàn)患者身材矮小，同時可能繼發(fā)骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)和晚期殘疾[1]。OA是一種全球性的十分常見的骨關(guān)節(jié)疾病，以關(guān)節(jié)疼痛和腫脹反復(fù)發(fā)作并加重、活動受限和畸形為主要臨床癥狀。這兩種骨關(guān)節(jié)疾病都嚴重影響了患者的生活質(zhì)量和身心健康，給家庭和社會帶來一定的經(jīng)濟負擔(dān)。近年來，大量研究從疾病相關(guān)蛋白的表達水平對KBD、OA等骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)病機制進行了深入探索?，F(xiàn)有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/AKT信號通路對KBD及OA的發(fā)生和發(fā)展有重要作用[2]，且該通路與骨關(guān)節(jié)疾病患者關(guān)節(jié)軟骨細胞自噬和損傷密切相關(guān)。因此，以下對PI3K/AKT信號通路調(diào)控KBD及OA軟骨細胞自噬和損傷及機制的研究現(xiàn)狀進行綜述，為進一步探索KBD及OA的發(fā)病機制和治療方案提供科學(xué)依據(jù)。

1 骨關(guān)節(jié)疾病軟骨細胞中的自噬

細胞自噬的概念于1963年由著名細胞生物學(xué)家Christian De Duve首先提出，是一種通過降解細胞成分以響應(yīng)營養(yǎng)限制的過程[3]。在此過程中，溶酶體參與水解細胞質(zhì)內(nèi)容物從而產(chǎn)生營養(yǎng)和能量，以維持基本的細胞活動。自噬作為重要的細胞應(yīng)激反應(yīng)機制，在維持細胞穩(wěn)態(tài)中起著至關(guān)重要的作用，在正常生理狀態(tài)時處于低水平狀態(tài)；而在應(yīng)激情況如營養(yǎng)缺乏、生長因子缺乏、缺氧等條件下，可促進細胞自噬上調(diào)，使得細胞內(nèi)大分子或細胞器降解成可循環(huán)利用的細胞成分[4]。另外，在某些條件下，自噬與細胞死亡也相關(guān)[5]。

廣泛研究表明，磷酸腺苷活化蛋白激酶(adenosine monophosphate activated protein kinase,AMPK)是一種能夠通過調(diào)節(jié)細胞代謝以維持能量平衡的能量感受器，可促進自噬。相反，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一種能夠整合生長因子和營養(yǎng)信號的細胞生長調(diào)節(jié)劑，能夠抑制自噬[6]。自噬是一個嚴格調(diào)控的過程，自噬缺陷與許多人類疾病密切相關(guān)，保持自噬程度的穩(wěn)定不僅是軟骨細胞重要的生存條件，還可預(yù)防或延緩軟骨退行性改變。

骨關(guān)節(jié)疾病中軟骨細胞的自噬、損傷與壞死關(guān)系密切。自噬本身作為一種保護機制，在軟骨細胞受到不利刺激的初期，有助于對抗和延緩細胞損傷的進程；當損傷性刺激持續(xù)存在或不斷加重，軟骨細胞的自噬能力出現(xiàn)障礙或缺陷，不足以清除細胞累積的大分子和受損細胞器，呈現(xiàn)自噬活性降低狀態(tài)，細胞穩(wěn)態(tài)被打破，代謝失衡，直至細胞壞死，即軟骨細胞損傷包含了軟骨細胞壞死。

2 PI3K/AKT信號通路對軟骨細胞自噬的調(diào)控作用

2.1 PI3K/AKT信號通路的組成及功能

PI3K/AKT是重要的細胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。近年來因其參與調(diào)控軟骨細胞增殖、分化、存活等，作為KBD和OA發(fā)病的核心通路而備受關(guān)注[2]。3-磷酸肌醇激酶(phosphoinositide 3 kinase,PI3K)是一種由一個催化亞基和一個調(diào)節(jié)亞基組成的異源二聚體蛋白，共有3種同工酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型，其中Ⅰ型被認為與關(guān)節(jié)軟骨損傷的發(fā)生進展關(guān)系密切而備受研究者關(guān)注[7]。Ⅰ型PI3K的亞型PI3Kγ和PI3Kδ可促進巨噬細胞激活，從而調(diào)控滑膜炎、介導(dǎo)軟骨損傷過程[8]。Ⅰ型PI3K的催化亞基在哺乳動物細胞中又分為ⅠA亞型和ⅠB亞型。其中ⅠA亞型由催化亞基p110和調(diào)節(jié)亞基p85組成，p85亞基在生理狀態(tài)下抑制PI3K的表達。PI3K的激活主要分為兩種途徑，一種是通過生長因子受體信號通路激活，即酪氨酸殘基發(fā)生磷酸化，與p85亞基的src同源序列2相互作用引起p110亞基構(gòu)象調(diào)節(jié)，導(dǎo)致PI3K二聚體自身發(fā)生變構(gòu)而被激活；另一種是通過p110亞基直接結(jié)合Ras而被激活[9]。被激活后的PI3K進一步向下游傳導(dǎo)刺激，其p110亞基通過作用于細胞膜上的4,5-雙磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate,PIP2)的第三位羥基位點，催化并磷酸化該位點后轉(zhuǎn)化為第二信使3,4,5-三磷酸磷脂酰肌醇(phosphatidylinositol 3,4,5-triphosphate,PIP3)，為具有PH結(jié)構(gòu)域的脂類蛋白激酶結(jié)合到細胞膜上提供必要的結(jié)合位點。

PI3K下游靶蛋白AKT位于細胞中，是一種絲/蘇氨酸蛋白激酶，也被稱為蛋白激酶B(protein kinase B,PKB)，共有3種亞型AKT 1、AKT 2、AKT 3，其中AKT 1與AKT 2參與骨細胞合成和代謝的平衡調(diào)節(jié)。AKT和PI3K由于兼具PH結(jié)構(gòu)域，二者均可在PIP3的介導(dǎo)下由細胞內(nèi)遷移結(jié)合到細胞膜上，轉(zhuǎn)位后的AKT可發(fā)生變構(gòu)使其T-Loop區(qū)的催化位點得以暴露。膜上的PDK 1(3-phosphoinositide-dependent protein kinase,也稱PDK或PKBK)通過協(xié)同催化PIP3與AKT的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合，激活A(yù)KT，也可通過PDK2使AKT被完全激活[10]。

2.2 PI3K/AKT信號通路對軟骨細胞的作用

PI3K/AKT信號通路具有促進軟骨細胞增殖和抑制自噬的作用。激活的AKT可以通過磷酸化作用于多種相關(guān)下游靶分子如Bad、NF-κB、mTOR和Caspase-3等調(diào)節(jié)軟骨細胞存活、自噬與凋亡，介導(dǎo)軟骨組織損傷過程[11-12]。抑制PI3K/AKT信號通路的活性將阻礙軟骨細胞中蛋白多糖的合成，并降低軟骨細胞存活率[13]。此外，AKT的活化抑制是IL-β誘導(dǎo)軟骨細胞發(fā)生自噬的重要機制，AKT抑制劑能夠明顯阻斷某些藥物（如人參皂苷、紫草醌等）對軟骨細胞自噬的效應(yīng)作用[14]。ULICIETAL[15]在培養(yǎng)成長期鼠脛骨軟骨細胞過程中加入PI3K抑制劑，發(fā)現(xiàn)阻斷PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑后發(fā)生自噬的軟骨細胞增多。

2.3 PI3K/AKT信號通路和m TOR共同調(diào)控細胞自噬

細胞自噬活性受mTOR的抑制。mTOR包含兩種不同形式的復(fù)合物mTORC1和mTORC2，其中mTORC1在自噬中的負調(diào)控功能已被證實，且AMPK對細胞自噬的促進作用也通常被認為是通過在TSC2和Raptor水平上抑制mTORC1而間接實現(xiàn)[16]。例如，在葡萄糖饑餓的誘導(dǎo)作用下，mTORC1上游通路激活A(yù)MPK，進而磷酸化結(jié)節(jié)性硬化癥復(fù)合物2（tuberous sclerosis complex 2,TSC2），抑制mTORC1的活性，使mTORC1間接失去對下游ULK自噬起始復(fù)合物的自噬抑制位點的控制，細胞的自噬活性上調(diào)。另外，mTORC2與細胞骨架的重組與細胞的存活有關(guān)，其磷酸化可激活A(yù)KT，進而抑制細胞自噬的發(fā)生[17]。

研究表明，PI3K/AKT與mTOR可構(gòu)成PI3K/AKT/mTOR信號通路并參與到多種生物調(diào)節(jié)過程中，調(diào)節(jié)細胞生長、分化和代謝。其中AKT承接上游PI3K信號，并將信號傳遞給AKT下游靶點mTOR，起到“承上啟下”的作用。PI3K通過生長因子受體信號通路激活，作用并磷酸化AKT，AKT作用于TSC1/2復(fù)合物抑制其活性，使得mTORC1被激活，進而磷酸化下游的ULK1自噬起始復(fù)合物的自噬抑制位點，抑制細胞自噬[18]（圖1）。

圖1 PI3K/AKT/mTOR信號通路示意圖Fig.1 Schematic diagram of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway

3 KBD和OA中PI3K/AKT通路調(diào)控軟骨細胞自噬的機制

3.1 KBD和OA軟骨細胞損傷和自噬的表現(xiàn)

近年來已發(fā)現(xiàn)在KBD和OA這兩種疾病中有一些相似的病理改變，包括細胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)降解、軟骨退變等[19]。OA典型的病理表現(xiàn)為關(guān)節(jié)軟骨的退行性改變、增生及骨贅形成，關(guān)節(jié)軟骨和骺板軟骨等軟骨組織損傷和壞死等[20-21]。

相比于OA，KBD的特征性病理改變主要是深層軟骨細胞的壞死，壞死可蔓延至中層、表層。超微結(jié)構(gòu)改變主要表現(xiàn)為軟骨細胞膜質(zhì)膜節(jié)段性缺損；線粒體腫脹，嵴斷裂、溶解，部分線粒體空泡化；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈現(xiàn)池樣擴張，核膜節(jié)段性缺損；胞質(zhì)內(nèi)出現(xiàn)髓樣小體和變性空泡。軟骨細胞邊緣基質(zhì)疏松，膠原纖維變少，最終崩解[22]。KBD軟骨細胞出現(xiàn)損傷時，其軟骨表現(xiàn)出與OA相似的臨床特征和病理改變，如ECM降解、軟骨變性和軟骨細胞凋亡。

研究表明，當KBD和OA軟骨細胞自噬缺陷時，表現(xiàn)出細胞核、線粒體、糖原沉積和微絲等多種異常；細胞嚴重變形，細胞核明顯扭曲，線粒體腫脹，細胞質(zhì)中存在大量的溶酶體；由于細胞壞死和破壞，在軟骨中可觀察到空腔[23]。此外，KBD還伴有不同軟骨損傷表現(xiàn)，包括細胞過度去分化、生長板和關(guān)節(jié)軟骨的局灶性細胞壞死，以及軟骨細胞表型、線粒體功能、基因和蛋白表達譜的改變[24-31]。

3.2 KBD和OA軟骨細胞中PI3K/AKT通路與自噬的研究

目前，針對PI3K/AKT信號通路異常和軟骨細胞自噬進行的骨關(guān)節(jié)疾病的研究主要集中于OA，PI3K/AKT信號通路在OA中的研究已經(jīng)相當廣泛[32]。有證據(jù)表明，自噬在OA軟骨中具有保護和促進軟骨細胞存活的功能，而自噬的喪失或紊亂被認為是導(dǎo)致OA的一種機制[33]。

在OA發(fā)病過程中，從宏觀來講，關(guān)節(jié)軟骨處于退變的發(fā)展過程，早期機體軟骨細胞自噬水平增強，保護軟骨細胞免受代謝異常、炎癥刺激或氧化應(yīng)激等因素的損害；隨著病情進展，軟骨細胞中受損的細胞器和大分子逐漸積累，軟骨細胞抗氧化能力和自噬水平下降，導(dǎo)致軟骨組織修復(fù)能力降低。從微觀來看，OA早期，PI3K/AKT信號通路相關(guān)蛋白的正常表達受到了抑制，軟骨細胞的自噬活性升高，一定程度上發(fā)揮了延緩軟骨退變、抑制炎癥反應(yīng)的作用。但隨著衰老或內(nèi)外環(huán)境持續(xù)刺激，受損細胞器在軟骨細胞中累積，PI3K/AKT信號通路水平升高，自噬活性受到抑制，軟骨細胞降解增加，炎癥和細胞死亡增加，導(dǎo)致OA。因此，在OA疾病不同階段，軟骨細胞的損傷、自噬水平和PI3K/AKT信號通路的活性有著不同表現(xiàn)，具體為早期PI3K/AKT通路活性受到抑制，軟骨細胞自噬增強，到中晚期PI3K/AKT通路上調(diào)，軟骨細胞自噬受到抑制。

然而，目前以KBD軟骨細胞作為研究對象的自噬相關(guān)研究相對較少，直接從PI3K/AKT信號通路角度進行KBD軟骨細胞自噬的研究更少。對KBD人群全血進行檢測，結(jié)果顯示，相比于正常人群，KBD患者全血中PI3K/AKT信號通路分子蛋白PI3Kp110、pAKT、pGSK 3β表達明顯增加，PI3K/AKT信號通路呈激活狀態(tài)[34]。在關(guān)于一種硒蛋白SEPS1的基因多態(tài)性與PI3K/AKT信號通路的研究中，發(fā)現(xiàn)這種硒蛋白的基因多態(tài)性能夠影響KBD的PI3K/AKT信號通路的表達，并與KBD的疾病風(fēng)險有一定關(guān)聯(lián)性[35]。還有研究提出，KBD患者和氧化損傷軟骨細胞中PI3K/AKT通路上調(diào)[36]，KBD軟骨細胞中存在自噬缺陷，但缺陷的程度輕于OA[23]。

隨后，整合基因組DNA甲基化和mRNA表達譜的研究同樣表明，PI3K/AKT信號通路在KBD與OA軟骨中顯示出不同的基因表達水平和DNA甲基化水平[37]。與正常人群對比，發(fā)現(xiàn)KBD軟骨細胞中自噬易感基因ATG4表達降低，進一步佐證了KBD的軟骨細胞存在自噬功能障礙[38]。

3.3 PI3K/AKT通路調(diào)控軟骨細胞自噬的機制

有研究證實，激活PI3K/AKT信號通路促進軟骨中膠原降解基質(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP13)的表達，導(dǎo)致軟骨細胞的肥大分化顯著提前，促進前成骨細胞和間充質(zhì)干細胞的分化。特異性阻斷PI3K/AKT信號通路可影響骨細胞增殖，引起骨質(zhì)流失等[39]。PI3K/AKT信號通路表達的下調(diào)可抑制軟骨細胞增殖，引起軟骨組織肥大細胞分化延遲、促進軟骨細胞凋亡等軟骨損傷性改變[40]。

在OA大鼠模型中，大鼠軟骨PI3K/AKT/mTOR自噬通路上調(diào)，自噬相關(guān)蛋白ATG5、ATG7、Beclin-1出現(xiàn)下調(diào)，自噬受到抑制，這一過程可能參與OA軟骨病變過程[41-42]。將PI3K/AKT通路抑制劑芍藥苷直接作用于人軟骨細胞C28/I2的炎癥復(fù)制模型，增強了軟骨細胞自噬能力，減少炎癥因子生成，從而達到治療OA炎癥反應(yīng)的效果[43]。使用PI3K/AKTmTOR信號通路抑制劑鹽酸青藤堿注射液注射于兔OA模型膝關(guān)節(jié)腔關(guān)節(jié)軟骨，觀察到關(guān)節(jié)軟骨自噬水平上調(diào)[44]。因此，PI3K/AKT/mTOR通路下調(diào)軟骨細胞自噬活性，引起細胞損傷，當該通路受到抑制時，軟骨細胞自噬水平增強，可適當對抗或延緩軟骨細胞的炎癥和病變過程。

此外，在KBD和OA軟骨病變中，細胞自噬活性缺陷可能與線粒體功能障礙有關(guān)。軟骨細胞自噬水平下降可導(dǎo)致細胞內(nèi)受損或衰老細胞器的分解過程受阻，線粒體功能出現(xiàn)障礙[45]，而存在功能障礙的線粒體將產(chǎn)生高水平的活性氧，所造成的炎癥、氧化應(yīng)激和能量代謝障礙又是軟骨細胞發(fā)生自噬及損傷的重要誘因[46]。有研究表明，PI3K/AKT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與線粒體氧化應(yīng)激水平負相關(guān)，17β-雌二醇可通過PI3K/AKT/mTOR信號通路抑制小鼠軟骨細胞ATDC5的線粒體自噬[47]，提示PI3K/AKT信號通路還可能調(diào)控了軟骨細胞的線粒體自噬，但目前尚沒有更多的證據(jù)解釋線粒體功能障礙或自噬與軟骨細胞自噬的具體關(guān)聯(lián)，及其在OA和KBD發(fā)病中的作用。

4 展 望

在既往研究中，PI3K/AKT信號通路已被證實具有促進軟骨細胞增殖和抗凋亡作用。然而，關(guān)于PI3K/AKT信號通路在軟骨細胞損傷和自噬過程中的調(diào)控作用尚處在初步探索階段。PI3K/AKT信號通路可通過抑制細胞自噬活性引起KBD和OA的軟骨細胞損傷。大多數(shù)針對KBD的自噬研究認為，KBD軟骨細胞自噬功能存在障礙或缺陷，部分研究認為PI3K/AKT通路在KBD軟骨細胞中呈現(xiàn)激活或上調(diào)狀態(tài)，發(fā)揮對自噬活性的抑制作用。盡管已有部分研究提出PI3K/AKT信號通路在KBD軟骨細胞自噬中起到抑制作用，然而，現(xiàn)有研究基本都是使用成年人的樣本（眾所周知，KBD發(fā)病的年齡階段主要是在兒童和青少年時期），不夠全面；同時，也沒有針對同OA那樣進行疾病的不同階段（如疾病早期和晚期）的研究和分析；涉及的報道也大多是通過DNA甲基化、轉(zhuǎn)錄組學(xué)或蛋白質(zhì)組學(xué)方法開展研究，沒有非常確切、直接的證據(jù)。對于該信號通路在KBD軟骨損傷和自噬過程中的基因、蛋白及細胞水平等仍缺乏大量驗證性的研究，PI3K/AKT通路在KBD和OA軟骨細胞自噬和損傷中的動態(tài)變化和具體機制還有待更深入和細致的驗證和補充。未來進一步驗證PI3K/AKT信號通路在軟骨自噬和損傷過程中的具體機制可作為研究KBD和OA發(fā)病機制的方向之一，將為探索骨關(guān)節(jié)疾病的治療方案提供科學(xué)依據(jù)。