何磊，杜佳輝，李娜

（1.鄭州人民醫(yī)院急診科，鄭州 450000；2.河南省胸科醫(yī)院胸外科，鄭州 450000）

肺癌是一種呼吸系統(tǒng)惡性腫瘤疾病，其病死率位居惡性腫瘤之首[1]。目前，關(guān)于診斷肺癌的方案主要檢測腫瘤標(biāo)志物、支氣管鏡檢查、痰脫落細(xì)胞學(xué)檢測、胸腔積液檢測以及胸部計(jì)算機(jī)斷層掃描等[2]。由于肺癌發(fā)病前期不明顯，大部分患者確診時(shí)候已處于中晚期，所以5 年生存率比較低[3]。因此，尋找用于肺癌的診斷和治療的新靶點(diǎn)至關(guān)重要。近年來自噬作為抗腫瘤研究的熱點(diǎn)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色，一方面其通過降解聚集的蛋白質(zhì)和功能性障礙的細(xì)胞器，減少細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。另一方面，自噬調(diào)控肺癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡等過程[4]。

微小RNA（miRNA）是長度在20～24 個(gè)堿基的單鏈非編碼小RNA[5]。研究表明，miRNA 與信使RNA（mRNA）堿基互補(bǔ)配對，從而降解靶mRNA 或抑制其翻譯，進(jìn)而參與轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控[6]。越來越多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展，主要調(diào)控腫瘤細(xì)胞的自噬、增殖、遷徙和侵襲等過程[7-8]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-21 和miR-23a 可成為肺癌早期診斷的標(biāo)志物[9]。并且miRNA-31 和let-7a 在肺癌患者中的異常表達(dá)，為肺癌早期診斷提供參考意義[10]。研究發(fā)現(xiàn)，miR-144 表達(dá)增加后，肺癌細(xì)胞中自噬激活后，從而抑制細(xì)胞的增殖和遷移[11]。因此，特異性表達(dá)的miRNA 可成為肺癌診斷和治療的標(biāo)志物。

miR-152 參與多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程，研究表明，在肺癌患者血清中檢測miR-152 異常表達(dá)，并且顯著性低于正常人群[12]。在早期非小細(xì)胞肺癌診斷中，血清外泌體中的miR-152 可以作為輔助診斷標(biāo)志物[13]。但miR-152 影響肺癌A549 細(xì)胞的作用及機(jī)制仍不明確。成纖維細(xì)胞生長因子-2（FGF2）是一種廣泛存在人體各組織中的肽類絲裂源[14]。由于FGF2 常參與細(xì)胞自噬過程[15]，對腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲具有重要作用[16]。本研究通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建miR-152 過表達(dá)以及FGF2 過表達(dá)的肺癌A549 細(xì)胞，檢測miR-152 與FGF2 互作關(guān)系，探究miR-152 和FGF2 對肺癌A549 細(xì)胞的自噬、增殖和侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞 正常上皮細(xì)胞BEAS-2B 和肺癌A549細(xì)胞系均購自中科院上海細(xì)胞庫。

1.1.2 試劑及試劑盒 FBS 胎牛血清、MEM 培養(yǎng)基和0.25%的胰蛋白酶（Gibco，Waltham，MA）；miRNA空轉(zhuǎn)化合物、FGF2 過表達(dá)空轉(zhuǎn)質(zhì)粒、miR-152 mimic和miR-152 shRNA 以及FGF2 過表達(dá)質(zhì)粒（廣州市銳博生物科技有限公司）；opti-medium 培養(yǎng)基、lip3 000、Trizol 試劑和BCA 試劑（Invitrogen；Thermo Fisher Scientific，lnc）；Dual Luciferase Reporter Assay System 試劑盒（psiCHECK-2 vector; Promega，Madison，WI，USA）；0.25%甲紫溶液（索萊寶科技有限公司）；Transwell 小室（密理博科技有限公司）；PrimeScript TM RT 試劑盒（Takara Biotechnology）；SYBR Green Ⅰ[寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司]；RIPA 緩沖液、SDS-PAGE 和PVDF 膜（Sigma-Aldrich 中國）；牛血清白蛋白（鹽城賽寶生物科技有限公司）；PMSF 抑制蛋白降解液（北京索萊寶科技有限公司）；兔抗人FGF2、LC3B Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p62 和GAPDH 單克隆抗體（Cell Signaling Technology，Inc.）；羊抗兔二抗[艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司]；一抗稀釋液和二抗稀釋液（北京百奧萊博科技有限公司）；超敏發(fā)光液ECL（上海翊圣生物科技有限公司）。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 正常上皮細(xì)胞BEAS-2B 和A549細(xì)胞通過快速升溫復(fù)蘇后，10%FBS 的MEM 培養(yǎng)液分別制成細(xì)胞混懸液，放入培養(yǎng)皿后，于37℃恒溫，5%CO2的培養(yǎng)箱中。隔天進(jìn)行傳代1 次，實(shí)驗(yàn)使用的細(xì)胞為對數(shù)生長期的細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及分組 將正常上皮細(xì)胞BEAS-2B（正常上皮細(xì)胞組）和A549 細(xì)胞（肺癌A549 細(xì)胞組）接種于6 孔板，待其長至密度80%～90%后，為下一步實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。再將A549 細(xì)胞分為miR-NC 組、pcDNA3.1-NC 組、miR-152 mimics 組、miR-152 inhibitor 組、pcDNA3.1-FGF2 組 和miR-152+pcDNA3.1-FGF2 組。miR-NC 組是miRNA 空轉(zhuǎn)物干擾A549 細(xì)胞，pcDNA3.1-NC 組是FGF2 過表達(dá)的亂序質(zhì)粒干擾A549 細(xì)胞，miR-152 mimics 組是miR-152 過表達(dá)質(zhì)粒干擾A549 細(xì)胞，miR-152 inhibitor組是miR-152 沉默質(zhì)粒干擾A549 細(xì)胞，pcDNA3.1-FGF2 組是FGF2 過表達(dá)質(zhì)粒干擾A549 細(xì)胞，miR-152+pcDNA3.1-FGF2 組是miR-152 過表達(dá)質(zhì)粒和FGF 過表達(dá)質(zhì)粒同時(shí)干擾A549 細(xì)胞。轉(zhuǎn)染步驟：將對數(shù)生長的A549 細(xì)胞種于6 孔板內(nèi)，待其長至密度40%～50%。用opti-medium 培養(yǎng)基稀釋對應(yīng)的質(zhì)粒后，再與lip3000 混勻孵育15 min 后，加入孔內(nèi)。待轉(zhuǎn)染8 h 后，棄去轉(zhuǎn)染液。添加正常培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)細(xì)胞長至80%～90%，放在熒光倒置顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。轉(zhuǎn)染率超過80%，可進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn) 雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測使用Dual Luciferase Reporter Assay System試劑盒。將FGF2 非翻譯區(qū)（UTR），包含miR-152 預(yù)測結(jié)合位點(diǎn)的3′UTR，所有各自結(jié)合位點(diǎn)突變型（Mut）3′UTR 的片段插入psiCHECK-2 載體，再通過DNA 測序驗(yàn)證所有構(gòu)建體。將含有野生型（Wt）或Mut 的psiCHECK-2 載體轉(zhuǎn)染到有或沒有合成miR-152 模擬物細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染36 h 后，使用雙重?zé)晒馑孛笀?bào)告基因檢測系統(tǒng)檢測熒光素酶活性，以海腎活性標(biāo)準(zhǔn)化。

1.5 細(xì)胞克隆檢測細(xì)胞增殖能力 取miR-NC 組、pcDNA3.1-NC 組、miR-152 mimics 組、miR-152 inhibitor 組、pcDNA3.1-FGF2 組和miR-152+ pcDNA3.1-FGF2 組對數(shù)生長時(shí)的細(xì)胞，0.25%的胰蛋白酶消化后，1 000×g 離心10 min 收集細(xì)胞后，用10% FBS 的MEM 培養(yǎng)基混勻制成單細(xì)胞混懸液。每組將1 000 個(gè)細(xì)胞接種于6 孔板內(nèi)，培養(yǎng)10～14 d，當(dāng)觀察孔內(nèi)有肉眼可見的克隆，就終止培養(yǎng)。用PBS洗滌2～3 次后，甲醇固定15 min，加入適量的0.25%甲紫溶液染色。在倒置顯微鏡計(jì)算大于50 個(gè)細(xì)胞的克隆數(shù)，最后統(tǒng)計(jì)分析每個(gè)孔的克隆數(shù)，該實(shí)驗(yàn)每組需要設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔，并且獨(dú)立重復(fù)操作3 次。

1.6 Transwell 小室檢測細(xì)胞侵襲能力 Transwell小室上層添加100 μL 的Matrigel 生物膠，在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)40 min 后，再分別加入100 μL MEM 混合1×104個(gè)miR-NC 組、pcDNA3.1-NC 組、miR-152 mimics 組、miR-152 inhibitor 組、pcDNA3.1-FGF2 組和miR-152+ pcDNA3.1-FGF2 組的細(xì)胞。而Transwell小室下室加100 μL 10% FBS 的MEM 培養(yǎng)基，再置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)12 h。棄去上清液，PBS 洗滌3 次，再用甲醇固定15 min 后，0.25%甲紫溶液染色1 h。將小室放在倒置顯微鏡下隨機(jī)選取5 個(gè)視野（200×），拍照記錄遷移下室的細(xì)胞總數(shù)。該實(shí)驗(yàn)每組需要設(shè)立3 個(gè)復(fù)孔，并且獨(dú)立重復(fù)操作3 次。

1.7 蛋白質(zhì)印跡法檢測相關(guān)蛋白表達(dá)水平 將miR-NC 組、pcDNA3.1-NC 組、miR-152 mimics 組、miR-152 inhibitor 組、pcDNA3.1-FGF2 組和miR-152+ pcDNA3.1-FGF2 組細(xì)胞長至80%～90%通過胰酶消化，1 000×g 離心收起細(xì)胞后用蛋白裂解液（RIPA 緩沖液：PMSF 抑制蛋白降解液=100：1）裂解后提取總蛋白。BCA 試劑測得各組的總蛋白濃度后，都調(diào)成一致濃度，再100℃變性后保存于-20℃?？偟鞍纂娪痉蛛x后，將其轉(zhuǎn)膜至PVDF膜。用3%牛血清白蛋白液封閉2 h 后，TBST 洗滌3 次，每次10 min。將其放入對應(yīng)的一抗混合液（一抗1∶1 000）（FGF2、LC3B Ⅱ/Ⅰ、beclin1、p62 和GAPDH），在4℃孵育過夜。用TBST 洗滌3 次，每10 min 1 次，放入二抗和3%牛血清白蛋白液（1∶4 000）混懸液中，室溫孵育2 h。TBST 洗滌3 次，每次10 min，將超敏發(fā)光液ECL 滴在膜上，放入化學(xué)發(fā)光成像儀（Invitorgen，USA）進(jìn)行蛋白顯影。通過Image J 軟件進(jìn)行分析結(jié)果，相對蛋白表達(dá)以GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)化。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS19.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為重復(fù)3 次實(shí)驗(yàn)結(jié)果。計(jì)量資料中符合正態(tài)分布資料以±s 表示，軟件采用One way ANOVA 單因素分析，多組間的兩兩比較采用SNKQ 檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-152 在正常上皮細(xì)胞BEAS-2B 和肺癌A549 細(xì)胞中的表達(dá)情況 qPCR 結(jié)果如圖1A 和1B所示，與正常上皮細(xì)胞BEAS-2B 比較，肺癌A549 細(xì)胞中的miR-152 表達(dá)量顯著降低（P＜0.01），而FGF2的mRNA 表達(dá)量顯著增加（P＜0.01）。

圖1 qPCR 檢測正常上皮細(xì)胞和A549 細(xì)胞中miR-152 和FGF2的表達(dá)情況Fig 1 The expression of miR-152 and FGF2 in normal epithelial cells and A549 cells detected by qPCR

2.2 FGF2 是miR-152 的靶點(diǎn) 根據(jù)TargetScan 的預(yù)測，miR-152 3′ -UTR 中的靶向位點(diǎn)與FGF2 部分互補(bǔ)（圖2A）。假設(shè)FGF2 與miR-152 基因的3′-UTR 結(jié)合，從而抑制了miR-152 的基因表達(dá)。雙重螢光素酶活性測定結(jié)果如圖2B 所示，miR-152-Wt組的相對螢光素酶活性顯著少于NC 組（P＜0.05），但miR-152-Mut 組在螢光素酶活性方面與NC 組比較，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明miR-152 是FGF2 的直接靶標(biāo)。

圖2 雙熒光素酶檢測FGF 與miR-152 關(guān)系Fig 2 Relationship between FGF and miR-152 detected by dual luciferase

2.3 miR-152 靶向FGF2 對肺癌A549 細(xì)胞增殖的影響 二維克隆實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3A 和3B 所示，miR-152 mimics 組細(xì)胞形成的克隆數(shù)（42±3.21）顯著低于miR-NC 組（214±10.23）（t=-48.88，P＜0.05），而miR-152 inhibitor 組克隆數(shù)（352±4.23）顯著高于miR-NC 組（t=-27.68，P＜0.05）。pcDNA3.1-FGF2 組細(xì)胞形成的克隆數(shù)（501±6.12）顯著高于pcDNA3.1-NC 組（124±11.43）（t=-42.18，P＜0.05）。miR-152+pcDNA3.1-FGF2 組細(xì)胞形成的克隆數(shù)（187±6.21）顯著高于miR-152 mimics 組（42±3.21）（t=-32.25，P＜0.05）。

圖3 二維克隆法檢測肺癌A549 細(xì)胞克隆能力Fig 3 The clonal ability of lung cancer A549 cells detected by twodimensional cloning method

2.4 miR-152 靶向FGF2 對肺癌A549 細(xì)胞侵襲的影響 Transwell 實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4A 和4B 所示，miR-152 mimics 組穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)為（35±4）個(gè)，顯著低于miR-NC 組（101±5）個(gè)（t=-19.82，P＜0.05），而miR-152 inhibitor 組（162±5.03）個(gè)，顯著高于miR-NC 組（t=-22.33，P＜0.05）。pcDNA3.1-FGF2 組穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)為（199±6）個(gè)，顯著高于pcDNA3.1-NC 組（98±4）個(gè)（t=-10.64，P＜0.05）。miR-152+pcDNA3.1-FGF2 組穿過基質(zhì)膠膜的細(xì)胞數(shù)為（78±3）個(gè)，顯著高于miR-152 mimics 組（t=-8.19，P＜0.05）。

圖4 Transwell 小室檢測肺癌A549 細(xì)胞侵襲能力（200×）Fig 4 The invasiveness of lung cancer A549 cells detected by Transwell chamber（200×）

2.5 miR-152 靶向FGF2 對肺癌A549 細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白的影響 Western 印跡實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5A 和5B 所示，與miR-NC 組比較，miR-152 mimics 組FGF2 和p62 蛋白表達(dá)量顯著減少（P＜0.05），LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），而miR-152 inhibitor 組FGF2 和p62 蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05），LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 蛋白表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）。與pcDNA3.1-NC 組比較，pcDNA3.1-F GF2 組FGF2 和p62 顯著增加（P＜0.05），LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 蛋白表達(dá)量顯著減低（P＜0.05）。與miR-152 mimics 組比較，miR-152+ pcDNA3.1-FGF2 組FGF2 和p62 顯著增加（P＜0.05），LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 蛋白表達(dá)量顯著增加（P＜0.05）。

圖5 Western 印跡檢測A549 細(xì)胞內(nèi)FGF2、LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1和p62 蛋白表達(dá)情況Fig 5 The expression of FGF2，LC3BⅡ/Ⅰ，beclin1 and p62 proteins in A549 cells detected by Western blotting

3 討論

肺癌是我國發(fā)病率最高的惡性腫瘤之一，惡性程度高且臨床預(yù)后較差[17]。肺癌容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，大部分患者確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期[18]。目前，對于肺癌治療的手段主要是手術(shù)和化療等綜合治療方案，在一定程度能緩解病情，但是生存期仍不樂觀[19]。研究表明，細(xì)胞自噬是機(jī)體的一種自我保護(hù)機(jī)制，其在應(yīng)激條件下降解癌細(xì)胞產(chǎn)生的損傷細(xì)胞器和有害的蛋白質(zhì)物質(zhì)，可以阻止癌癥的發(fā)生和發(fā)展[4]。LC3B Ⅱ/Ⅰ、beclin1 和p62 是主自噬標(biāo)志物，LC3BⅡ/Ⅰ和beclin1 蛋白表達(dá)量隨著自噬水平升高而升高。自噬降解受到抑制時(shí)，p62 的表達(dá)量增加[20]。越來越多研究表明，非編碼RNA 通過參與自噬調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，介導(dǎo)自噬相關(guān)基因的表達(dá)，從而參與癌癥細(xì)胞的增殖和侵襲過程[21]。因此，深入了解肺癌的發(fā)病機(jī)制，尋找與其自噬、增殖和侵襲相關(guān)的信號(hào)分子，可進(jìn)一步提高肺癌的生存率，改善臨床預(yù)后。

研究表明，miRNA 表達(dá)和功能異常常與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系[22]。研究表明，miR-152 抑制胃癌細(xì)胞、膀胱癌細(xì)胞和卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力[23-25]。因此，miRNA 有可能參與肺癌A549 細(xì)胞的增殖和侵襲調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常上皮細(xì)胞比較，miR-152 在肺癌A549 細(xì)胞中的表達(dá)顯著降低。這說明miR-152 可能對肺癌A549 細(xì)胞有影響作用。筆者進(jìn)一步構(gòu)建miR-152過表達(dá)和沉默的肺癌A549 細(xì)胞。qPCR 結(jié)果顯示，與miRNC 組比較，miR-152 mimics 組的miR-152 表達(dá)量顯著增加，miR-152 inhibitor 組表達(dá)量明顯減少。這說明miR-152 過表達(dá)和沉默的肺癌A549 細(xì)胞模型構(gòu)建成功。細(xì)胞克隆和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺癌A549 細(xì)胞中miR-152 過表達(dá)后，其增殖和侵襲能力顯著降低，而miR-152 沉默后，其增殖和侵襲能力明顯增加。與miR-NC 組比較，miR-152 mimics 組的自噬標(biāo)志蛋白LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 增加，而p62表達(dá)量受到抑制，但miR-152 inhibitor 組的結(jié)果與之相反。這說明miR-152 能激活肺癌A549 細(xì)胞的自噬，從而降低其增殖和侵襲能力。

FGF2 屬于一種重要的神經(jīng)營養(yǎng)因子和血管生成因子，能促進(jìn)細(xì)胞的增殖和基因表達(dá)等[14]。FGF2通過調(diào)控腫瘤血管生成，從而參與腫瘤的生長、侵襲和轉(zhuǎn)移過程[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，與正常上皮細(xì)胞比較，肺癌A549 細(xì)胞中的FGF2 的表達(dá)顯著增加。進(jìn)一步通過過表達(dá)肺癌A549 細(xì)胞中的FGF2，觀察FGF2 對肺癌A549 細(xì)胞的影響。qPCR 結(jié)果顯示，與pcDNA3.1-NC 組 比 較，pcDNA3.1-FGF2 組 中 的FGF2 表達(dá)量增加，說明肺癌A549 細(xì)胞過表達(dá)FGF2模型構(gòu)建成功。細(xì)胞克隆和Transwell 小室實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，肺癌A549 細(xì)胞中FGF2 過表達(dá)后，其增殖和侵襲能力顯著增加。這說明FGF2 的過表達(dá)激活肺癌A549 細(xì)胞的增殖和侵襲能力。本研究進(jìn)一步證實(shí)，過表達(dá)FGF2 后，肺癌A549 細(xì)胞中的FGF2 和p62明顯增加，LC3B Ⅱ/Ⅰ和beclin1 表達(dá)受到抑制。這提示FGF2 抑制自噬，從而激活肺癌A549 細(xì)胞的增殖和侵襲。

越來越多研究發(fā)現(xiàn)，miRNA 與mRNA 相互競爭，從而影響靶基因的轉(zhuǎn)錄[6]。研究表明，miR-152通過與神經(jīng)纖維網(wǎng)蛋白1 相互競爭，從而抑制非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力[12]。本研究通過TragetScan 預(yù)測miR-152 與FGF2 具有特異性結(jié)合，雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證miR-152 通過與FGF2 的3′UTR 區(qū)域直接結(jié)合從而負(fù)調(diào)控FGF2的表達(dá)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證miR-152 靶向FGF2 對肺癌A549 細(xì)胞的影響，本研究在過表達(dá)miR-152 的基礎(chǔ)上過表達(dá)FGF2 基因，與miR-152 過表達(dá)組比較，其細(xì)胞自噬能力明顯抑制，而增殖和侵襲能力顯著增加。這也提示，過表達(dá)FGF2 基因可逆轉(zhuǎn)過表達(dá)miR-152 對肺癌A549 細(xì)胞增殖和侵襲的抑制作用，進(jìn)一步證實(shí)FGF2 是miR-152 的靶基因。

綜上所述，miR-152 可靶向FGF2 調(diào)控肺癌A549 細(xì)胞自噬，從而影響A549 細(xì)胞增殖和侵襲能力，為肺癌的靶向治療和診斷提供潛在靶點(diǎn)。