林 雯，史瓊枝，李銀科，曾 媛，謝向陽 ，胡 華*

1. 黃石市愛康醫(yī)院檢驗科，黃石 435000；2.中國人民解放軍中部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院藥劑科，武漢 430070

藥物遞送到腦部腫瘤部位，一般需要跨越血腦屏障和腦瘤屏障[1-2]。由于肽類的相對分子質(zhì)量比蛋白質(zhì)更小，故其更適合作為靶向修飾分子，引導載體攜帶藥物穿越體內(nèi)屏障到達靶向部位[3]。A7R(ATWLPPR)是一種七肽，該肽在體外可以選擇性地抑制人內(nèi)皮細胞的增殖。它是血管內(nèi)皮生長因子受體-2(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2)和神經(jīng)氈蛋白-1(neuropilin-1, NRP-1)的特異性配體，這2個受體在血管內(nèi)皮細胞和一些腫瘤細胞中有較高水平的表達[4-7]。將A7R肽的序列倒轉(zhuǎn)過來，并且采用d-氨基酸合成，可得到腦靶向能力更強的DA7R肽[8]。

紅細胞膜包裹納米粒(red blood cell membrane-camouflaged polymeric nanoparticles，RBC-NP)是將紅細胞載體體內(nèi)清除慢而釋藥行為可控性差與納米粒體內(nèi)清除快而釋藥行為可控強的特點綜合起來的一種載體，其能充分發(fā)揮這2種載體各自的優(yōu)勢[9-12]。

本研究擬將兼具跨血腦屏障與跨腦瘤屏障能力的靶向分子DA7R融合于紅細胞膜表面，賦予其體內(nèi)長循環(huán)腦腫瘤靶向的特性，延長納米載體的體內(nèi)循環(huán)時間，提高載體在腦血管部位的暴露概率，增強載體在腦部腫瘤部位的靶向遞藥功能，實現(xiàn)對腦部腫瘤的高效藥物遞送。

1 儀器與材料

1.1 儀器

RE52CS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮有限公司)；Optima超速低溫離心機(美國Beckman公司)；脂質(zhì)體擠出器(加拿大Avestin公司)；JY92-IID型細胞超聲破碎儀(寧波新芝生物科技有限公司)；NICOMP 380ZLS Zeta電位/粒度分析儀(美國Santa Barbara公司)；7500型透射電子顯微鏡(日本Hitachi公司)；1260型高效液相色譜儀(美國Agilent公司)；UV-2550紫外可見光分光光度計(日本島津公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)。

1.2 試藥

替莫唑胺(質(zhì)量分數(shù)99.6%，武漢康隆世紀科技發(fā)展有限公司)；DA7R肽(批號20200622，上海強耀生物科技有限公司)；DSPE-PEG2000-Mal、DSPE-PEG2000、1,2-二油?；?sn-丙三基-3-磷脂酰乙醇胺[1,2-dioleoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(carboxyfluorescein)，PECF]均購自上海艾韋特醫(yī)藥科技有限公司；PLGA(LA∶GA=50∶50，相對分子質(zhì)量30，山東濟南岱罡生物工程有限公司)；1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(fatal bovine serum, FBS)，均購自浙江天杭生物科技股份有限公司。

1.3 動物

SD大鼠購自湖北省逸摯誠生物科技有限公司[SYXK(鄂)2016-088]。

2 方法與結(jié)果

2.1 DSPE-PEG2000-DA7R的制備

參照文獻合成DSPE-PEG2000-DA7R[8]。分別稱取DA7R肽(RPPLWTA-cys)與DSPE-PEG2000-Mal 適量(1∶1)溶于含有三乙胺(5 eq)的二甲基甲酰胺溶液中，在氮氣保護下室溫攪拌48 h，加入L-半胱氨酸(10 eq)反應4 h封閉未反應的馬來酰亞胺殘基。對該反應液以雙蒸水避光透析(截留相對分子質(zhì)量3 500)48 h，冷凍干燥，得白色膨松狀產(chǎn)物，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 DA7R-NP的制備

2.2.1紅細胞膜的提取和純化 取雄性SD大鼠，體質(zhì)量(220 ± 20) g，麻醉，固定，將采血針刺入心尖，收集血液存于含肝素的采血管中。將收集到的血液在1 500 r·min-1(4 ℃)條件下離心15 min，棄去上層的血漿、白細胞和血小板。加入等滲的磷酸鹽緩沖生理鹽水(phosphate-buffered saline, PBS)緩沖液，以1 500 r·min-1(4 ℃)離心15 min，棄去上清，重復操作3次[13]。將獲得的紅細胞濃縮液貯存于4 ℃冰箱中，備用。

取濃縮的紅細胞液1.0 mL置于離心管中，加入去離子水0.9 mL，搖勻，再加入10倍的PBS溶液0.1 mL，混勻。在10 000 r·min-1(4 ℃)條件下離心10 min，棄去上清液。重復上述步驟，直至上清液幾乎無色。收集離心管下層的淡紅色紅細胞膜，用去離子水定容至原全血體積，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2PLGA納米粒的制備 采用分散揮發(fā)法制備納米粒。稱取PLGA約100 mg，溶于氯仿10 mL中；另取替莫唑胺5 mg，溶于二甲基亞砜1 mL中；將上述2種有機溶劑混合，緩慢滴加到去離子水20 mL中(1 000 r·min-1磁力攪拌)，室溫下繼續(xù)攪拌(200 r·min-1)4 h，揮去有機溶劑，得到帶藍色乳光的納米粒(nanoparticles, NP)溶液，置于4 ℃冰箱中備用。PECF標記的納米粒制備方法同上，只是在載體溶解時加入適量的PECF(終質(zhì)量濃度15 μg·mL-1)。

取紅細胞膜50 μL和DSPE-PEG2000-DA7R 1 mg混合于PBS溶液1 mL(10 mol·L-1，pH為7.4)中，在37 ℃下孵育4 h(搖床振蕩頻率50 r·min-1)，得到DA7R修飾的紅細胞膜。

將功能化的紅細胞膜在超聲條件(150 W，3 min，冰浴)下進行破膜，通過脂質(zhì)體擠出器(400 nm)20次，隨后將擠出的細胞膜與納米?；旌显偻ㄟ^擠出器(200 nm)，通過20次, 即得分散均勻的經(jīng)靶向肽修飾的紅細胞膜包裹的納米粒(DA7R-NP)。

2.3 DA7R-NP理化性質(zhì)的考察

2.3.1DA7R-NP形態(tài) 采用透射電子顯微鏡(transmission electron microscope，TEM)對DA7R-NP的形態(tài)進行觀察[14]。取適量的樣品懸液用去離子水稀釋至合適濃度，小心滴加至帶有支持膜的專用篩網(wǎng)上，自然風干，滴加質(zhì)量濃度為0.2 g·L-1的磷鎢酸液染色，自然干燥后用透射電鏡觀察形態(tài)。結(jié)果見圖1。

由圖1可見，制備的DA7R-NP粒徑約為100 nm，納米粒外層有膜狀物包裹，呈殼-核結(jié)構(gòu)。納米粒外觀圓整，多為球形或近球形。

圖1 DA7R-NP的透射電鏡照片

2.3.2DA7R-NP的粒度分布和Zeta電位 用Zeta電位/粒度分析儀測定DA7R-NP的粒徑和Zeta電位。儀器的激光波長設定為639 nm，入射光與散射光的夾角為90°，測定溫度為23 ℃。儀器同時測定Zeta電位。結(jié)果見圖2。

圖2 DA7R-NP的粒徑分布

由圖2可見，DA7R-NP的平均粒徑分別為(102.8±11.7) nm，多聚分散系數(shù)(polymer dispersity index，PDI)為0.138±0.009，Zeta電位為(-4.96±1.13) mV。

2.3.3包封率 Agilent TC-C18色譜柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相為冰醋酸水溶液(質(zhì)量濃度5 g·L-1)-甲醇(90∶10)；柱溫為40 ℃；檢測波長為329 nm；流速為1 mL·min-1；進樣量為20 μL。

替莫唑胺主峰與其他雜質(zhì)分離度良好，輔料不干擾主藥的測定。用流動相溶液配制系列替莫唑胺對照品溶液(質(zhì)量濃度0.1～30 μg·mL-1)，以峰面積(A)對質(zhì)量濃度(C)進行線性回歸，得回歸方程A=60.165C+1.534 8(r=0.999 9)，替莫唑胺的質(zhì)量濃度在0.1～30 μg·mL-1范圍內(nèi)與峰面積線性關(guān)系良好。高、中、低3個質(zhì)量濃度的平均回收率為100.3%，RSD值為1.72%，日內(nèi)精密度RSD值為1.41%，日間精密度RSD值為1.78%，溶液在5 d內(nèi)的RSD值為1.75%，均符合方法學要求。

采用離心法分離納米膠體溶液中的游離藥物，經(jīng)液相色譜儀測定藥物質(zhì)量濃度后，計算納米粒的包封率。將樣品液加入離心管中，離心45 min(25 000 r·min-1，4 ℃)，收集上清液，用液相色譜儀測定其中游離藥物的質(zhì)量濃度(C游)。

根據(jù)公式包封率=(C總-C游)/C總×100%計算納米粒的包封率，C總按投料量計算。計算得DA7R-NP的包封率為79.14%±2.57%。

2.4 穩(wěn)定性考察

精密量取制備的樣品(DA7R-NP)50 μL加入PBS溶液1 mL(pH 7.4)中，混合，密封，備用。將該樣品放置于4～8 ℃環(huán)境中，于樣品制備的當天(第0天)和制備后的第30天取樣測定樣品的粒徑、電位、透光率(750 nm)和包封率，考察4 ℃條件下制劑的穩(wěn)定性。

將PBS(pH 7.4)與FBS按照1∶9混合配制成稀釋液(模擬血漿)，取DA7R-NP樣品適量用混合稀釋液稀釋(1∶20)，放置于37 ℃條件下，分別于12、24 h測定透光率(750 nm)。

結(jié)果表明，在4～8 ℃條件下放置30 d后，DA7R-NP的粒徑(100.3±49.6) nm、PDI(0.135±0.011)、Zeta電位(-5.02±1.09) mV以及透光率與第0天基本一致(波動小于5%)，說明所得的納米粒在PBS中的穩(wěn)定性良好，未發(fā)生聚集或沉淀。DA7R-NP的包封率在第30天時略有下降，為78.61%±2.44%。

DA7R-NP在模擬血漿中24 h的透光率波動小于5%，說明在該模擬環(huán)境下，24 h樣品的光學特征未發(fā)生明顯變化，膠體體系基本穩(wěn)定。

2.5 體外釋藥行為考察

采用動態(tài)膜透析法進行體外釋藥行為考察[15-16]。分別精密量取含藥的DA7R-NP和NP混懸液2.0 mL置于透析袋(截留相對分子質(zhì)量8 000)中，兩端夾緊后置于100 mL PBS(pH 5.0)中，置于恒溫水浴中(37 ℃，100 r·min-1)振蕩，在0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h取釋放介質(zhì)200 μL，同時補加等體積空白釋放介質(zhì)，按照2.3.3項下方法測定釋放介質(zhì)中的藥物質(zhì)量濃度，繪制藥物釋放曲線。見圖3。

由圖3可知，沒有紅細胞膜包裹的納米粒(NP)在8 h時基本已釋放完畢，后繼釋放增加量不大。紅細胞膜包裹的納米粒(R-NP，DA7R-NP)在12 h時釋放量幾乎不再增加。在紅細胞膜的阻滯作用下，紅細胞膜包裹的納米粒呈現(xiàn)出較好的緩釋性能。

圖3 DA7R-NP、R-NP、NP的體外釋藥曲線 (n=6)

2.6 細胞攝取實驗

2.6.1bEnd.3細胞對納米粒的攝取 將bEnd.3細胞接種于6孔細胞板內(nèi)(1×105個/孔)，37 ℃培養(yǎng)(體積分數(shù)5%的二氧化碳)3 d后，移除孔中的培養(yǎng)基，分別加入適量經(jīng)PECF標記的NP、R-NP和DA7R-NP納米混懸液，用培養(yǎng)基調(diào)整濃度為0.3 μmol·mL-1。孵育0.5、1、2、4 h后，棄去納米懸液，用PBS緩沖液(4 ℃)洗滌3次，胰酶溶液(質(zhì)量濃度2.5 g·L-1)消化，以3 000 r·min-1離心5 min，棄去上清液，將細胞用PBS溶液0.5 mL(4 ℃)重新混懸，用流式細胞儀測定bEnd.3細胞的熒光強度。結(jié)果見表1。

表1 bEnd.3細胞對不同制劑納米粒的攝取量

由表1可知，bEnd.3細胞對3種納米粒的攝取量都隨時間的延長而增加。從2 h開始，DA7R-NP的熒光強度明顯強于無紅細胞膜包裹的NP、R-NP。NP與R-NP之間的熒光強度無顯著性差異。說明紅細胞膜經(jīng)DA7R修飾后，被bEnd.3細胞的攝取量較未修飾的納米粒有顯著提高。

2.6.2體外初步藥效評價 根據(jù)參考文獻建立體外血腦屏障模型[17-20]。用明膠D-Hank’s溶液(質(zhì)量濃度20 g·L-1)將細胞插入器包被后，在每個插入器(孔徑0.4 μm、直徑12 mm、面積1.12 cm2)中接種1×104個鼠腦毛細血管內(nèi)皮細胞，每2天更換1次培養(yǎng)液，培養(yǎng)6 d。于顯微鏡下觀察到細胞匯合后，將培養(yǎng)基加到細胞插入器的上池中，使上、下池液面差大于0.5 cm，此液面差可維持4 h以上，說明細胞已經(jīng)形成了緊密連接；用電阻儀檢測插入器內(nèi)、外兩側(cè)的電阻值為(213±9) Ω·cm2，說明體外血腦屏障模型基本建立成功。在細胞插入器的下池中接種入2×103個C6細胞，共培養(yǎng)24 h。移除細胞插入器上池中的培養(yǎng)基，分別加入空白培養(yǎng)基、含藥培養(yǎng)基、含藥NP、含藥R-NP和含藥DA7R-NP(替莫唑胺的終濃度為3 μmol·L-1)，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，經(jīng)磺基羅丹明B染色后，于540 nm波長下測定每孔A值，計算存活率。

不同替莫唑胺制劑在跨越血腦屏障后，對C6細胞的生長抑制效果見表2。腦膠質(zhì)瘤C6細胞存活率從小到大依次為：DA7R-NP組

3 討論

紅細胞相關(guān)的載藥系統(tǒng)較傳統(tǒng)的藥物載體在延長藥物體內(nèi)循環(huán)時間、提高藥物穩(wěn)定性等方面具有一定的優(yōu)勢[9]。本文將紅細胞膜用靶向肽修飾后，包覆于PLGA納米粒表面，可延長納米粒在體內(nèi)的停留時間，給予納米粒更長的時間到達腦血管周圍，從而提高靶向效率。此外，本方法還適用于紅細胞膜包封率不高而納米粒包封率高的藥物。

表2 不同替莫唑胺制劑穿越體外血腦屏障模型對C6細胞存活率的影響

靶向材料的合成采用肽類修飾中常用的加成反應合成。其原理是利用DSPE-PEG2000-MAL中的馬來酰亞胺基團(-MAL)與DA7R(RPPLWTA-cys)肽半胱氨酸殘基帶有的巰基(-SH)之間的邁克爾加成反應而制備DSPE-PEG2000-DA7R。該反應條件溫和，產(chǎn)物質(zhì)量分數(shù)高。實驗過程需要注意防止巰基氧化并控制反應溫度。

本文制備的紅細胞膜包覆的納米粒在粒徑、電子顯微鏡照片等方面與文獻報道一致[9-11]。DA7R-NP的穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，經(jīng)紅細胞膜包裹后的納米粒在低溫條件下30 d內(nèi)基本穩(wěn)定，制劑具有較好的穩(wěn)定性。模擬血漿中穩(wěn)定性實驗結(jié)果表明，DA7R-NP可以在模擬血漿中至少穩(wěn)定存在24 h。這些結(jié)果可能是紅細胞膜自身良好的穩(wěn)定性使然。體外釋藥行為考察結(jié)果也表明，在紅細胞膜的阻滯作用下，藥物從納米粒中的釋放速度減慢，緩釋作用顯著。

初步的體外血腦屏障模型結(jié)果表明，在DA7R肽的介導下載體跨越血腦屏障的能力顯著提高，這可能與DA7R肽可與血管內(nèi)皮生長因子受體-2、神經(jīng)氈蛋白-1特異性結(jié)合相關(guān)。下一步需要進一步在動物模型中考察DA7R-NP的藥物腦靶向遞送能力。

紅細胞膜表面抗原的組織相容性是制約該技術(shù)發(fā)展的重要因素。目前的策略有2種，一是采用個體化的血細胞分離制備藥物載體，二是去除紅細胞表面主要的抗原成分(如多糖、蛋白質(zhì)等)。

本實驗制備的由DA7R肽修飾的紅細胞膜包裹的PLGA納米粒理化特性、穩(wěn)定性良好，具有很好的藥物腦靶向遞送應用潛力。