張 琪，龔麟鳳

武漢市紅十字會醫(yī)院藥劑科，武漢 430015

鹽酸雷洛昔芬(raloxifene hydrochloride，RLX)是由美國禮來公司開發(fā)的第二代選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑(selective estrogen receptor modulators, SERMs)，臨床上用于預(yù)防和治療絕經(jīng)后的骨質(zhì)疏松癥，改善絕經(jīng)后更年期癥狀，并有潛在的心血管保護(hù)作用[1-2]。然而，RLX屬于生物藥劑學(xué)分類系統(tǒng)(biopharmaceutics classification system, BCS)Ⅰ類藥物，在水中幾乎不溶解(為2 μg·mL-1)，且具有極強(qiáng)的肝臟首過效應(yīng)，口服生物利用度較低，小于2%[3-4]。為了提高RLX的溶解度，提高其生物利用度，研究人員已將其開發(fā)成多種新型給藥系統(tǒng)，包括固體分散體[5]、脂質(zhì)納米粒[6]、介孔碳納米顆粒[7]、自乳化釋藥系統(tǒng)[8]和環(huán)糊精包合物[9]等。固體脂質(zhì)納米粒(solid lipid nanoparticles, SLNs)是以生物相容性好的固態(tài)天然或合成的類脂為載體，將藥物吸附或包裹于脂質(zhì)中制成的新一代納米粒給藥系統(tǒng)，在提高難溶藥物的溶解度和口服生物利用度方面得到廣泛關(guān)注[10-11]。因此，本研究采用熱熔乳化-高壓均質(zhì)法將鹽酸雷洛昔芬制備成固體脂質(zhì)納米粒，并通過大鼠體內(nèi)藥動學(xué)評估藥物的生物利用度，為提高鹽酸雷洛昔芬的口服生物利用度提供一種有效的解決方案。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HWCL-5型集熱式恒溫磁力攪拌器(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；SRH500-45高壓均質(zhì)機(jī)(ATS工業(yè)系統(tǒng)有限公司)；TD5G臺式過濾離心機(jī)(長沙湘銳離心機(jī)有限公司)；Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀(英國Malvern公司)；日立Chromaster高效液相色譜儀(日立高新技術(shù)公司)；JEM-2100 Plus型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；ZRS-8GS型智能溶出試驗(yàn)儀(天津海益達(dá)科技有限公司)；DSC3型差示掃描量熱儀(梅特勒-托利多國際有限公司)；L-90K型超速離心機(jī)(美國貝克曼公司)。

1.2 試藥

鹽酸雷洛昔芬原料藥(質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.5%，批號ST200817-1，重慶圣華曦藥業(yè)股份有限公司)；山崳酸甘油酯(德國巴斯夫公司)；大豆磷脂(上海太偉藥業(yè)股份有限公司)；泊洛沙姆188(德國巴斯夫公司)；乙醇(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；純化水(實(shí)驗(yàn)室自制)。

2 方法與結(jié)果

2.1 RLX-SLNs的制備

通過對制備工藝進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)考察，采用熱熔乳化-高壓均質(zhì)法制備RLX-SLNs[12]。稱取鹽酸雷洛昔芬100 mg、山崳酸甘油酯2 000 mg和大豆磷脂200 mg加入裝有10 mL乙醇的梨形瓶中，攪拌至固體完全溶解，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇，并放置在真空干燥箱中過夜，得到無色固體脂質(zhì)混合物，將固體混合物放置在85 ℃水浴中形成熔融狀透明油狀溶液，恒溫保存，作為油相，備用；稱取泊洛沙姆18 850 mg加入裝有50 mL純化水的燒杯中，攪拌溶解，水浴加熱至85 ℃，恒溫保存，作為水相，備用；在2 500 r·min-1磁力攪拌速度下將油相緩慢滴加到水相中，滴加結(jié)束后持續(xù)攪拌10 min，形成乳白色乳狀液；將該溶液進(jìn)行高壓均質(zhì)處理，設(shè)定均質(zhì)壓力為500 bar，循環(huán)均質(zhì)5次，冰水浴冷卻，加水定容至50 mL，即得到外觀呈乳白色的RLX-SLNs，4～8 ℃低溫保存，備用。

2.2 包封率測定

量取RLX-SLNs 4 mL置于高速離心管中，以15 000 r·min-1離心1.5 h后溶液分層，上層為澄清透明溶液，下層為白色沉淀物，移取上層溶液1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加流動相定容，得到待測液(W游離)；另取RLX-SLNs 1.0 mL，置于50 mL量瓶中，加乙腈超聲破乳，再加入流動相定容，得到待測液(W總)。取上述2份樣品，分別用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography，HPLC)[13]檢測藥物含量。用包封率=[(W總-W游離)/W總]×100%計(jì)算RLX-SLNs的包封率。計(jì)算得包封率為97.8%±1.6%，說明大部分RLX被包裹或吸附在納米粒中，游離藥物極少。

2.3 粒徑分布及Zeta電位測定

取RLX-SLNs 0.1 mL，置于聚苯乙烯樣品池中，再加入3 mL純化水稀釋，使用Malvern Zetasizer Nano ZS90納米粒徑電位分析儀測定粒徑分布與Zeta電位。儀器參數(shù)設(shè)置：光源為氦-氖激光器，激光功率為4 mW，波長為633 nm，環(huán)境溫度為25 ℃。結(jié)果見圖1。

注：A. RLX-SLNs的粒徑分布；B. RLX-SLNs的Zeta電位圖。

經(jīng)測定RLX-SLNs的粒徑為(194.5±8.5) nm，粒徑較小，有利于被小腸上皮細(xì)胞通過內(nèi)吞作用攝取[14]；RLX-SLNs的多聚分散指數(shù)(polydispersity index, PDI)為0.183±0.08，說明納米粒的粒徑分布較窄，粒徑大小較為均勻；RLX-SLNs的Zeta電位為(-34.3±1.5) mV，有利于體系穩(wěn)定[15]。

2.4 透射電鏡觀察

取少量RLX-SLNs，加入純化水稀釋，用滴管取1滴上述稀釋液滴加到碳涂層銅網(wǎng)上，均勻鋪展，再滴加1滴質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的磷鎢酸鈉溶液，負(fù)染10 min，之后用濾紙從液體邊緣處吸取多余的水分，并放置在紅外燈下干燥，在透射電鏡下觀察，并拍攝照片，見圖2。在透射電鏡下可清楚地觀察到RLX-SLNs呈球形，表面光滑，大小較為均勻，無聚集，未觀察到藥物晶體。

圖2 RLX-SLNs的透射電鏡照片

2.5 差示掃描量熱法分析

使用差示掃描量熱儀對RLX原料藥、脂質(zhì)熔融物、RLX原料藥與脂質(zhì)的物理混合物以及RLX原料藥與脂質(zhì)形成的熔融物進(jìn)行熱分析。精密稱取上述4種樣品各5 mg放入鋁鍋中，密封，固定到樣品板上，另將空的鋁鍋密封后固定到另一個(gè)樣品板上，作為對照，開通氮?dú)?，流速?0 mL·min-1，以10 ℃·min-1的速率加熱，溫度范圍為50～350 ℃。結(jié)果見圖3。

圖3 差示掃描量熱圖

DSC熱分析結(jié)果顯示，RLX原料藥在271.2 ℃處出現(xiàn)吸熱峰，該吸熱峰為RLX的熔點(diǎn)，固體脂質(zhì)熔融物的熔點(diǎn)均在80 ℃左右，RLX原料藥與脂質(zhì)的物理混合物中脂質(zhì)的熔點(diǎn)為80.4 ℃，藥物的熔點(diǎn)為271.2 ℃，熔點(diǎn)均未發(fā)生變化，而RLX原料藥與脂質(zhì)形成的熔融物只出現(xiàn)了脂質(zhì)的吸熱峰，未檢測到RLX的吸熱峰，說明RLX以分子狀態(tài)分散在固體脂質(zhì)中[16]。

2.6 不同pH稀釋穩(wěn)定性

RLX-SLNs經(jīng)口服進(jìn)入胃腸道需經(jīng)歷pH改變和被稀釋的過程，其物理性質(zhì)有可能發(fā)生變化，進(jìn)而影響到藥物的吸收，因此用不同pH值介質(zhì)溶液稀釋RLX-SLNs來模擬其在胃腸道環(huán)境中的穩(wěn)定性[17]。取RLX-SLNs 1.0 mL分別經(jīng)pH 1.2、4.5、6.8、7.4溶液稀釋50和200倍，在37 ℃條件下放置6 h，檢測其粒徑分布。結(jié)果見表1。

表1 RLX-SLNs用不同pH值介質(zhì)溶液稀釋穩(wěn)定性結(jié)果

研究表明，RLX-SLNs經(jīng)不同pH值介質(zhì)稀釋后，在放置過程中均未出現(xiàn)絮凝或沉淀現(xiàn)象，粒徑大小基本無變化，具有較強(qiáng)的抗稀釋性，可以初步預(yù)測RLX-SLNs進(jìn)入胃腸道后不會因?yàn)轶w液稀釋或pH改變而發(fā)生絮凝或沉淀。

2.7 體外藥物釋放

采用反向透析法考察RLX-SLNs在不同pH介質(zhì)溶液中的體外藥物釋放情況[18]。取RLX-SLNs 2 mL置于透析袋中，系緊兩端，放入100 mL釋放介質(zhì)中，釋放介質(zhì)分別選擇pH 1.2鹽酸溶液、pH 4.5醋酸鹽緩沖液、pH 6.8磷酸鹽緩沖液和pH 7.4磷酸鹽緩沖液，介質(zhì)中均添加了質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的吐溫-80，水浴溫度為(37±0.5) ℃，磁力攪拌速度為100 r·min-1，并在設(shè)定時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、4、6、8、12、24 h)取3 mL介質(zhì)溶液，經(jīng)過濾、稀釋，用HPLC法檢測藥物含量，繪制藥物累積釋放度-時(shí)間曲線。見圖4。

由圖4可見，RLX-SLNs在4種介質(zhì)中表現(xiàn)出相似的藥物釋放速率，均為雙相釋放模式，即前期藥物釋放為突釋，在初始2 h藥物釋放量約為35%，這主要是來自于游離的和吸附在固體脂質(zhì)納米粒表面RLX的釋放；后期表現(xiàn)為緩釋，在24 h藥物釋放量約為85%，主要是來自于固體脂質(zhì)納米粒內(nèi)部藥物的釋放。

圖4 RLX-SLNs在4種不同pH介質(zhì)溶液中體外釋放度-時(shí)間曲線

2.8 體內(nèi)藥代動力學(xué)

2.8.1血樣前處理 取100 μL大鼠血漿樣品轉(zhuǎn)移到5 mL離心管中，加入乙酸乙酯2 mL渦旋5 min，使血漿蛋白充分沉淀，以5 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于另一只5 mL離心管中，放入真空干燥箱中揮干有機(jī)溶劑，殘留物用100 μL流動相重新溶解，渦旋振蕩2 min。按照如下所述色譜條件檢測：色譜柱為ZORBAX SB-C8(150 mm×4.6 mm，5 μm)，流動相為20 mmol·L-1醋酸銨緩沖液(用醋酸調(diào)節(jié)至pH=4.5)-乙腈(63∶37)，流速為1.0 mL·min-1，檢測波長為289 nm，柱溫為35 ℃。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果表明，血漿中RLX的質(zhì)量濃度在50.0～5 000.0 ng·mL-1范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線為y= 0.018 4x+0.010 2(R2=0.999 6)，方法的定量限為20 ng·mL-1，低(50 ng·mL-1)、中(1 000 ng·mL-1)和高(5 000 ng·mL-1)3個(gè)質(zhì)量濃度的藥物提取回收率分別為93.9%、94.1%、93.1%，日間和日內(nèi)精度RSD值均低于5%，說明該方法的提取回收率高，精密度好，可用于血漿樣品的分析。

2.8.2動物實(shí)驗(yàn) 取12只雌性Wistar大鼠，體質(zhì)量為(220±20) g，大鼠禁食12 h，期間只提供飲用水。將大鼠分成A、B組，每組6只，A組大鼠用喂食針口服給予RLX混懸劑，B組大鼠用喂食針口服給予RLX-SLNs，給藥劑量均為15 mg·kg-1，在規(guī)定的時(shí)間點(diǎn)(0.5、1、2、4、6、8、12、24 h)用乙醚麻醉大鼠，使用毛細(xì)管通過眼眶后靜脈叢穿刺取血，血樣以4 000 r·min-1離心10 min，分離血漿，收集上清液(血漿)置于-20 ℃條件下冷凍保存，檢測前室溫解凍，按照色譜條件進(jìn)樣檢測藥物含量，使用軟件WinNonLin?分析血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間數(shù)據(jù)，計(jì)算藥動學(xué)參數(shù)。結(jié)果見表2、圖5。

表2 大鼠口服給予RLX混懸劑和RLX-SLNs后藥動學(xué)參數(shù)的比較

圖5 血藥質(zhì)量濃度-時(shí)間曲線

3 討論

本研究制備的RLX-SLNs采用山崳酸甘油酯作為固體脂質(zhì)，其熔點(diǎn)約為80 ℃，經(jīng)DSC檢測證實(shí)RLX是以分子形態(tài)溶解到固體脂質(zhì)中，這樣有利于提高藥物的溶解度。另外，由于RLX-SLNs的粒徑約為200 nm，粒徑極小，故擁有巨大的比表面積，可提高對腸壁的生物黏附性，延長了其在胃腸道中的停留時(shí)間。

藥動學(xué)參數(shù)檢測結(jié)果顯示，與大鼠口服RLX懸浮劑相比，大鼠口服RLX-SLNs后的半衰期(t1/2)有所延長，達(dá)峰時(shí)間(tmax)有一定的滯后，達(dá)峰血藥質(zhì)量濃度(Cmax)顯著提高(P<0.05)，為RLX懸浮劑的4.7倍，口服生物利用度顯著提高(P<0.05)，約提高了5.4倍。一方面，RLX-SLNs的外表面是由親水性的大豆磷脂和泊洛沙姆188構(gòu)成，改善了納米粒的潤濕性；另一方面，RLX-SLNs通過腸道中的M細(xì)胞和淋巴運(yùn)輸被直接吸收進(jìn)入體循環(huán)，減弱了肝首過效應(yīng)，促進(jìn)了藥物的口服吸收[19]。