吳 嵐，馬秀梅，楊桂林，曾海生，譚雨坪

(1 梧州市食品藥品檢驗所，廣西 梧州 543002；2 右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院，廣西 百色 533000；3 廣西中醫(yī)藥大學，廣西 南寧 530200)

黃芪是臨床常用的中藥之一，為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根[1]，具有補氣升陽、固表止汗之功效[2]。現(xiàn)代研究表明，黃芪含有黃酮類、多糖、皂苷類及氨基酸、微量元素等成分[3-4]。黃芪具有抗腫瘤、保護心腦血管、提高免疫功能、保護肺功能、調(diào)節(jié)血壓等藥理作用[5-6]。黃芪多糖具有抗動脈粥樣硬化、保護視網(wǎng)膜、抗衰老等藥理作用[7-8]。課題組開展黃芪多糖提取工藝的研究工作，是為了獲得比較理想的中藥多糖提取效率，為大規(guī)模生產(chǎn)提供實驗依據(jù)。為了提高實驗優(yōu)化結(jié)果的可信度，本研究在通過運用正交試驗，優(yōu)化驗證實驗結(jié)果選取的實驗因素是包含最佳實驗點的參數(shù)下，再次通過運用響應(yīng)面優(yōu)選提取時間、提取溫度和液料比的最佳工藝參數(shù)。目的是為提高黃芪多糖的得率及黃芪中藥質(zhì)量控制提供理論依據(jù)。

1 儀器與材料

1.1 儀 器

GL124-1SCN型電子分析天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計，蘇州-島津儀器有限公司；HWS12水浴鍋,上海一恒公司。

1.2 材料與試劑

黃芪藥材,購于廣東康美藥業(yè)有限公司，經(jīng)右江民族醫(yī)學院附屬醫(yī)院藥學部曾海生副主任藥師鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus(Fisch.)Bge. var. mongholicus(Bge.)Hsiao或膜莢黃芪Astragalus membranaceus(Fisch.)Bge.的干燥根;D-無水葡萄糖(生產(chǎn)批號HA062217195)，寶雞市辰光生物科技有限公司;乙醇、苯酚、濃硫酸等均為分析純;水為純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

取粉碎的黃芪樣品1.0 g，精密稱定，提取2次，每次加入30 mL無水乙醇溶液，水浴回流提取60 min，立即趁熱把藥液過濾，用熱的無水乙醇沖洗3次，等到溶劑揮干后，將殘渣和濾紙一同放入錐形瓶中，加純水100 mL，水浴回流40 min，取出冷卻至室溫后，精密量取10 mL的回流液于離心管中，離心10 min，轉(zhuǎn)速設(shè)為5000 r/min，之后再精密吸取離心后的上清液1 mL，至10 mL容量瓶中加蒸餾水定容，振搖均勻后，備用。

2.2 對照品溶液的制備

取葡萄糖對照品54 mg，經(jīng)過105 ℃干燥至恒重，放置 50 mL的容量瓶中，加入適量純水輕輕搖勻使其溶解，再加入純水稀釋定容至刻度，輕輕搖勻后，得葡萄糖對照品溶液，濃度為1.08 mg/mL。

2.3 實驗測定方法

采用苯酚-硫酸法，分別吸取各組制備液的多糖溶液3 mL，放入15 mL的具塞試管中，加入體積1 mL的5%苯酚和5 mL的濃硫酸。將其輕輕搖勻后，先沸水浴上加熱20 min，取出后冷水浴中冷卻10 min，即得樣品溶液。于紫外下測吸光度，波長設(shè)置為490 nm，并記錄數(shù)據(jù)。

2.4 回歸方程的建立

分別吸取0.2、0.5、0.8、1.0、1.2、1.5和2.0 mL的對照品溶液置25 mL容量瓶中，加蒸餾水定容至刻度，蒸餾水作為空白對照，按照2.3項下的測定方法進行測定，檢測波長為490 nm，測其吸光度繪制標準曲線，縱坐標(Y)為吸光度(A)，橫坐標(X)為葡萄糖溶液濃度(c)，最終得到的回歸方程為：Y=0.06108X+0.01185，相關(guān)系數(shù)r2=0.9993，結(jié)果表明：在0.00864～0.0864 mg/mL范圍內(nèi)，配制的葡萄糖溶液濃度與吸光度呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系。黃芪多糖得率計算：

多糖得率=4X/1000m×100%

式中：X為總多糖的濃度(由回歸方程計算出)，m為黃芪樣品重量。

2.5 單因素試驗

2.5.1 提取時間的考察

將粉末過三號篩后，取1.0 g黃芪粉末，提取時間分別設(shè)為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min，制備樣品溶液(按照“2.1項”下的實驗步驟)，然后按照2.3項下的方法測其吸光度，最后確定合適的純水提取時間，結(jié)果見圖1。

郭啟明辭職來到洛陽的時候，身上只有6萬多元的存款。在和關(guān)小美同居的這段時間，兩個人過得很瀟灑，經(jīng)常從宜陽坐車去洛陽城市里玩，還給她你買衣服首飾等，很快所剩無幾。情急之下，郭啟明只得打電話向父親求助，最后還是父母把15萬塊養(yǎng)老錢給了他救急。

圖1 提取時間對多糖得率的影響Fig.1 The effect of extraction time on the yield of polysaccharides

從結(jié)果可知，水提時間對黃芪多糖的提取影響明顯，多糖得率跟著水提時間的增加而逐漸升高，在40 min時到達最位置，而后逐漸下降，因而選擇30 min、40 min、50 min三個水平進行正交試驗及響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。

2.5.2 提取溫度的考察

將黃芪粉末過三號篩后，取1.0 g黃芪粉末，設(shè)置水提時間為40 min，水提溫度分別設(shè)為50、 60、70、80、90、100 ℃，制備樣品溶液(按照“2.1項”下的實驗步驟)，然后測其吸光度(按照2.3項下的方法)，實驗考察中確定合適的水提溫度，實驗結(jié)果見圖2。

圖2 實驗溫度對多糖得率的影響圖Fig.2 The effect of experimental temperature on the yield of polysaccharides

從結(jié)果可知，水提溫度對黃芪多糖的提取影響明顯，黃芪多糖提取率隨著實驗水提時間的延長而增加，當達到溫度 90 ℃最高位置，而后逐漸下降，因此選取溫度80 ℃、90 ℃、100 ℃三水平進行正交試驗及響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。

2.5.3 液料比的考察

將黃芪粉末過三號篩后，取1.0 g黃芪藥材粉末，分別加入純水體積為20、30、40、50、60 mL，水提時間為40 min，水提溫度為90 ℃，制備樣品溶液(按照“2.1項”下的實驗步驟)，然后測其吸光度(按照2.3項下的方法)，確定合適的液料比，結(jié)果見圖3。

圖3 料液比對多糖得率的影響圖Fig.3 The effect of the ratio of material to liquid on the yield of polysaccharides

根據(jù)實驗數(shù)據(jù)，由數(shù)據(jù)分析結(jié)果可知，實驗條件料液比對中藥黃芪多糖的提取率影響比較顯著，隨料液比的增加，多糖的提取率也上升，在1:40時到最高位置，而后逐漸下降，因而選擇30:1、40:1、50:1 mL/g三水平進行正交試驗及響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計。

2.6 正交試驗

表1 試驗提取方法考察因素水平表Table 1 Test extraction method investigating factor level table

表2 黃芪多糖實驗提取方法考察試驗結(jié)果(n=3)Table 2 Astragalus polysaccharides experimental extraction method inspection test results(n=3)

由表2可知，各實驗考察因素對黃芪多糖提取的影響順序(A>B>C)，由表3軟件方差分析可知，實驗提取時間對黃芪多糖得率有顯著性，而水提溫度和液料比沒有統(tǒng)計學意義，因此水提溫度和液料比無顯著性差異，故最佳提取工藝為A2B3C2。即提取時間為40 min，提取溫度為100 ℃，投料比為40:1(mL/g)。

表3 方差分析Table 3 Analysis of variance

2.7 響應(yīng)面方法分析黃芪多糖提取工藝

從2.5項下的考察單因素試驗結(jié)果分析研究發(fā)現(xiàn)，黃芪多糖得率影響效果明顯主要因素是提取時間、提取溫度、液料比，但正交試驗設(shè)計與單因素實驗考察結(jié)果有所不同，正交試驗數(shù)據(jù)分析得出，只有水提時間因素具有顯著性差異。因而，為了綜合研究中藥黃芪多糖的最佳提取工藝條件，本實驗依據(jù)Box. Benhnken的中心設(shè)計組合分析原理，數(shù)理統(tǒng)計分析比較單因素試驗與正交試驗設(shè)計結(jié)果，采用三因素三水平，利用響應(yīng)面的方法分析。結(jié)果見表4～表5。

表4 響應(yīng)面方法-因素與水平設(shè)計表Table 4 Response surface method-factor and level design table

表5 Box-Behnken 試驗設(shè)計以及響應(yīng)值Table 5 Box-Behnken experimental design and response values

試驗數(shù)據(jù)分析的實驗響應(yīng)結(jié)果，然后與試驗各單因素因素實驗水平比較，進行相關(guān)試驗回歸擬合，得到的線性回歸方程為如下：

Y=7.65+0.82A+0.35B-0.3C-0.54AB-0.12AC+0.12BC-1.64A2-0.72B2-0.91C2

從表6的數(shù)據(jù)可以分析知道，該實驗模型設(shè)計分析結(jié)果非常顯著(P<0.05)，而失擬項P=0.1476>0.05，結(jié)果表明響應(yīng)值與預測值之間有良好的擬合度，因此該實驗模型可用來預測黃芪多糖最佳的提取工藝。提取時間(P=0.0325<0.05)，提取溫度(P=0.1207>0.05)，液料比(P=0.0868>0.05)，說明黃芪多糖的提取受提取時間影響顯著，而提取溫度與液料比對黃芪多糖的提取影響不顯著。

表6 響應(yīng)面中的各項回歸方程方差分析結(jié)果Table 6 ANOVA results of various regression equations in the response surface

本實驗采用Design Expert 10.0.1軟件分析，結(jié)果分析并得出黃芪多糖的最優(yōu)提取工藝：提取時間為42 min，提取溫度為98.32 ℃，液料比為42.81:1時，黃芪多糖得率為6.98%，較高。為了方便試驗，微微調(diào)整試驗方案，設(shè)置提取時間為 40 min，提取溫度為98 ℃，液料比為40:1，該結(jié)果也與正交試驗的結(jié)果相近，在此工藝條件下進行的試驗(n=3)，黃芪多糖得率分別為7.10%、6.95%、7.04%，試驗接近預測值，說明該多糖提取工藝穩(wěn)定、可行。

3 結(jié) 論

在正交試驗中，提取時間對黃芪多糖含量的影響明顯，而提取溫度、液料比的顯著性不高，提取溫度和液料比這兩個因素有明顯的交互作用在實驗中的表現(xiàn)出來，這對多糖含量有較大的影響，因而提取時間、提取溫度、液料比這三種因素對黃芪多糖含量的影響不僅是線性關(guān)系。所以，用這兩種方法進行對比結(jié)果顯示，響應(yīng)面法則能更好地闡釋多因素與響應(yīng)值兩者的關(guān)系。當前，在提取藥材的工藝研究中發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用較多的則是正交試驗[9]，該方法可直觀地分析所得結(jié)果，然而它得到的優(yōu)選值，具有一定的局限性，因為只能是試驗所用水平的某一種組合。采用一系列的實驗數(shù)據(jù)用多項式進行擬合，分析得到回歸方程，而后將函數(shù)用圖形的方式直觀地表現(xiàn)出來的方法稱為響應(yīng)面法，該方法能對所得結(jié)果關(guān)系直觀地研究進行分析。